Design, syntese og antilanogene effekter av (2-substituert fenyl-1,3-ditiolan-4-yl)metanolderivater
Mar 22, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
Do Hyun Kim1Su Jeong Kim1Sultan Ullah1Hwi Young Yun1Pusoon Chun2Hyung Ryong Moon1
Abstrakt:Forfatterne designet og syntetiserte 17 (2-substituert fenyl-1,3-ditiolan-4-yl) metanol (PDTM)-derivater for å finne et nytt kjemisk stillas som viser utmerkettyrosinase-hemmendeaktivitet. Deres tyrosinaseinhiberende aktiviteter ble evaluert mot sopptyrosinase ved 50 μM, og fem av PDTM-derivatene (PDTM3, PDTM7–PDTM9 og PDTM13) ble funnet å hemme sopptyrosinasemer enn kojinsyre eller arbutin, de positive kontrollene. Av sytten PDTM-er, viste PDTM3 (halvmaksimal hemmende konsentrasjon 13,94±1,76 μM), med en 2,4-dihydroksyfenyldel, de største hemmende effektene (kojinsyre halvmaksimal hemmende konsentrasjon 18.86} 2,14 μM). Interessant nok hadde PDTM-forbindelser uten hydroksylgruppe, PDTM7–PDTM9, også sterkere hemmende aktiviteter enn kojinsyre. I silicostudier av interaksjoner mellom tyrosinase og de fem PDTM-ene antydet deres bindingsaffiniteter nært relatert til deres tyrosinase-hemmende aktiviteter. Cellebaserte eksperimenter utført med B16F10 musehudmelanomceller viste at PDTM3 effektivt hemmetmelanogeneseog mobilnettettyrosinaseaktivitet. En cellelevedyktighetsstudie utført ved bruk av B16F10-celler indikerte at den antilanogene effekten av PDTM3 ikke skyldtes cytotoksisiteten. Kinetiske studier viste at PDTM3 kompetitivt hemmet tyrosinase, noe som indikerer binding til det tyrosinase-aktive stedet. Vi fant at PDTM3 med et nytt kjemisk stillas kunne være en lovende kandidat for hudblekende midler og at 1,3-ditiolanringen kunne brukes som et kjemisk stillas for kraftig tyrosinaseinhibering.Nøkkelord:tyrosinasehemmer, melanogenese, 1,3-ditiolan, PDTM
Cistanche er en tyrosinasehemmer.
Introduksjon
De siste tiårene,tyrosinasehemmerehar vært av betydelig interesse, på grunn av nøkkelrollen som tyrosinase spiller imelanogenese. Melanin produseres ved hjelp av en kombinasjon av enzymatisk katalyserte og kjemiske reaksjoner. Den biosynteseveien som er ansvarlig for melaninproduksjonen ble først belyst av Raper1 og Mason2 og nylig modifisert av Cooksey et al3 og Schallreuter et al.4 Melanogenese initieres av enzymet tyrosinase, som katalyserer de to første oksidative trinnene i melaninbiosynteseveien: oksidasjonene av l-tyrosin til l-dopa etterfulgt av l-dopa til l-dopakinon (Figur 1). Disse to trinnene er også de hastighetsbestemmende trinnene i melaninbiosyntesen fordi fysiologisk pH kan fortsette spontant etterfølgende trinn.5 Dopakinonet som produseres i det andre trinnet omdannes til cysteinyldopa av glutation eller cystein, og til slutt til pheomelanin, som er ansvarlig for gult til røde farger på pattedyrhud, eller til dopakrom ved autooksidasjon og til slutt eumelanin, som er ansvarlig for brune/svarte farger på pattedyrhud (figur 1). Melanin beskytter menneskelig hud mot skadelig ultrafiolett stråling og bestemmer også det fenotypiske utseendet. På den annen side kan overdreven opphopning av melanin i huden forårsake hyperpigmenteringsassosierte sykdommer og kosmetiske problemer, som fregner, melasma og senile lentiginer.
Tyrosinaseer vidt distribuert i bakterier, sopp, insekter, planter og dyr, inkludert mennesker, og er ansvarlig for fargene på menneskelig hud og hår og uønsket brunfarging av frukt og grønnsaker.6 Uønsket enzymatisk brunfarging og sykdommer forbundet med hyperpigmentering i huden har oppfordret forskere til å søke etter nye potente tyrosinasehemmere for bruk som hudblekende og antibrune midler. Mangetyrosinasehemmerehar blitt oppdaget til dags dato,7–9, men relativt få har blitt godkjent som hudblekende materialer på grunn av sikkerhetshensyn eller svake blekingseffekter.
I våre tidligere studier, på grunnlag av strukturer av l-tyrosin og l-dopa, naturlige substrater av tyrosinase, designet vi to potensielle tyrosinasehemmere med en tiazolidinring (MHY384 og MHY794; figur 1) og syntetiserte dem ved kondensering av en passende benzaldehyd og l-cystein eller cysteaminhydroklorid. Disse to forbindelsene ble identifisert å være kraftige konkurransedyktigetyrosinasehemmereog for å effektivt redusere melanogenese i HRM2 hårløse mus.10,11 I tillegg til å direkte hemme tyrosinaseaktivitet, hemmet MHY384 tyrosinaseekspresjon ved å undertrykke det sykliske adenosinmonofosfat-PKA10 og NO-indusert syklisk guanosinmonofosfat-undertrykte også 13MHG12, 13MHG12,tyrosinaseuttrykk indusert av NO-mediertmelanogenesesignalering.11Disse positive resultatene og det faktum at toverdig –S– er en klassisk isoster av toverdig –NH– oppmuntret oss til å syntetisere derivater med en ditiolanring som et surrogat for tiazolidinringen som vanligvis eksisterer i MHY384 og MHY794, for å finne nye tyrosinasehemmere.
I denne studien, som en del av vår pågående innsats for å finne et nytt og sterkt kjemisk stillas for hemming av tyrosinase og utvikle nyetyrosinasehemmere, syntetiserte vi en klasse av strukturelt nye (2-substituert fenyl-1,3-ditiolan-4-yl)metanol (PDTM)-derivater (Figur 1) og undersøkte deres anti-lanogene effekter ved å bruke sopptyrosinase og cellebaserte analyser. I denne studien ble kojinsyre og arbutin brukt som en positiv kontroll for tyrosinaseinhiberende aktivitet, fordi kojinsyre er en av de mest brukte positive kontrollene for evaluering av tyrosinaseinhibering og arbutin er klinisk brukt som blekemiddel.
Materialer og metoder
Materialer
Med mindre annet er angitt, alle kommersielt tilgjengelige reagenser – l-tyrosin (kode T3754), l-dopa (kode PHR1271), kojinsyre (kode K3125), MTT (3-(4,5-dimetyl{{ 8}}tiazolyl)-2,5-difenyl-2H-tetrazoliumbromid) (kode M2128), PMSF (fenylmetylsulfonylfluorid) (kode P7626), Triton X-100 ( 4-(1,1,3,3-tetrametylbutyl)fenylpolyetylenglykol) (kode T8787), kaliumhydrogenfosfat (kode P9666), kaliumdihydrogenfosfat (kode PHR1330), 2,3- dimerkapto-1-propanol (kode 64046), 1,4-dioksan (kode 296309), svovelsyre (kode 339741) og benzaldehyder – ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). Fetalt bovint serum, Dulbecco's Modified Eagle's Medium, fosfatbufret saltvann (PBS), penicillin, streptomycin og trypsin ble kjøpt fra Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Sopptyrosinase(kode T3824) og -melanocyttstimulerende hormon (-MSH; kode M4135) ble også kjøpt fra Sigma-Aldrich. 1H og 13C kjernemagnetisk resonans (NMR) spektra ble registrert på Varian Unity Inova 400 og Varian Unity AS 500 instrumenter (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Lavoppløselig massespektrometri (MS) og høyoppløselig MS-data ble oppnådd på henholdsvis et Expression CMS (Advion, Ithaca, NY, USA) og et 6530 Accurate Mass quadrupole time-of-flight væskekromatografi massespektrometer (Agilent) . Syntese av PDTM1–PDTM17 ble utført i laboratoriet vårt.
cistanche ekstrakt
Generell prosedyre for syntese av PDTM1–PDTM17
Til en omrørt løsning av 2,3-dimerkapto-1-propanol (100 mg, 0,80 mmol) i 1,4-dioksan (1 ml) ble det tilsatte en løsning av svovelsyre (0,1 ekvivalens) i 1,4-dioksan (1 ml) og et passende benzaldehyd (1,1 ekvivalens) etterpå. Etter å ha blitt omrørt ved romtemperatur i 10 minutter, ble reaksjonsblandingen omrørt ved 70 grader i 40 minutter til 1 time. Blandingen ble deretter fordelt mellom etylacetat og vann, og det organiske laget ble tørket over vannfritt MgS04, filtrert og inndampet. Resten som ble oppnådd ble renset ved bruk av silikagelkolonnekromatografi for å gi rene PDTM-produkter: PDTM1–PDTM17.14 Strukturell karakterisering (1H og 13C NMR og massedata for alle PDTMer og 1-D og 2-D NMR spektra for noen PDTM-er) av syntetiserte forbindelser er gitt i tilleggsmaterialer.
Hemming av sopptyrosinaseav PDTM1–PDTM17
De hemmende effektene av PDTM-analoger på sopptyrosinase ble utforsket med mindre modifikasjoner, som beskrevet tidligere i vårt arbeid.15 Hver forbindelse (10 μL, sluttkonsentrasjon 50 μM) ble blandet med substratløsning (170 μL), fremstilt av 14,7 mM kaliumfosfat buffer (pH 6,5) og 293 µM l-tyrosinløsning (1:1, v/v), i hver brønn i en 96-brønnplate. Til hver brønn ble sopp-tyrosinase-løsning (20 μL, 1, 000 U/mL) tilsatt og inkubert i 30 minutter ved 37 grader. Innhold av dopakrom dannet i brønner ble bestemt ved å måle optiske tettheter ved 475 nm ved bruk av en VersaMax mikroplateleser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Kojinsyre og arbutin ble brukt som positive kontroller. Alle forsøk ble utført i tre eksemplarer. Inhiberingsrater påtyrosinaseble beregnet slik:
Hemming ( prosent )=× 100 [ ( 1 − AB/ )] (1)
hvor A indikerer den optiske tettheten til testforbindelsen og B representerer den optiske tettheten til kontrollen.
Halvmaksimal hemmende konsentrasjon (IC50) er konsentrasjonen av en forbindelse som hemmer en standard 50 prosent respons. IC50 er avledet fra x-aksen på en inhibitor-konsentrasjon versus produktdannelseskurve og bestemmes fra justeringen av dose-responskurven på den avhengige y-aksen. I denne studien ble doseavhengige inhiberingseksperimenter utført i tre eksemplarer for å bestemme IC50 av forbindelser. I henhold til inhiberingsprosenten på fem doser (sluttkonsentrasjon 10, 20, 30, 40 og 50 µM) i hvert eksperiment, ble de log-lineære kurvene og deres ligninger bestemt. Individuelle IC50-verdier ble deretter beregnet som konsentrasjonen når y-aksen tilsvarte 50 prosent inhibering. Resultatene fra de tre forsøkene vises.
Analyse av arten av sopptyrosinaseinhibering
For å belyse arten av den hemmende effekten av PDTM3 på sopptyrosinase, ble kinetiske studier utført. PDTM3 (10 μL [0, 5, 10 eller 25 μM sluttkonsentrasjon]) ble tilsatt til 170 μL l-tyrosinløsning (0,5, 1, 2 eller 4 mM sluttkonsentrasjon) og deretter blandet med sopptyrosinaseløsning (20 μL, 1,000 U/mL) i hver brønn i en 96-brønnplate. Etter at blandingen var inkubert i 30 minutter ved 37 grader, ble innholdet av dopakrom produsert i brønner bestemt ved å måle optiske tettheter ved 475 nm ved bruk av en mikroplateleser. Alle forsøk ble utført i tre eksemplarer. For å bestemme arten av inhibering ble et Lineweaver-Burk-plott brukt.
cistanche ekstrakt fordel
Dokkingsimulering av PDTM3 eller kojinsyre med tyrosinase
In silico-dokkingsimuleringen av protein-ligand ble utført med AutoDock Vina ved bruk av en systematisk søketeknikk og 3-D-strukturen til Agaricus bisporustyrosinase(Protein Data Bank ID 2Y9X).16,17 I krystallstrukturen til tyrosinase ble bindingsstedet til l-tyrosin brukt som en dokkinglomme. Simuleringsresultater ble oppnådd fra dokking mellom tyrosinase og syntetiske forbindelser (PDTM3, PDTM7, PDTM8, PDTM9 og PDTM13) eller kojinsyre. Før dokkingsimulering med forbindelsene ble utført, ble 2-D-strukturer av forbindelser transformert til 3-D-strukturer, ladninger av forbindelser ble bestemt, og hydrogenatomer ble satt inn ved hjelp av ChemOffice. LigandScout 3.1.2 ble brukt for å forutsi mulige interaksjoner mellom ligander og tyrosinase og identifisering av farmakoforer. Dokkingsimuleringsbilder av 17 PDTM-er er gitt i tilleggsmateriale.
Bestemmelse av melanogenesenivå i B16F10-celler
Melanin-innholdsanalyser med mindre modifikasjoner ble brukt i B16F10-celler for de hemmende effektene av PDTM3 påmelanogenese.19 Celler sådd med en tetthet på 5×104 celler/brønn i en 24-brønnplate fikk feste ved 37 grader i en fuktet atmosfære inneholdende 5 prosent CO2 over natten. Dagen etter ble cellene eksponert for -MSH (1 µM) og PDTM3 (0, 5, 10 eller 25 µM) eller kojinsyre (25 µM), og platen ble inkubert i 24 timer under de samme forholdene. Etter å ha blitt vasket to ganger med PBS, ble cellene løsnet ved inkubering ved 60 grader i 200 μL 1 N NaOH i 1 time. Lysatene ble flyttet til en 96-brønnplate og optiske tettheter ble målt ved 405 nm av en enzymkoblet immunosorbentanalyseleser for beregning av gjennomsnittlig prosentvis hemming av kojinsyre og PDTM3. Alle forsøk ble utført i tre eksemplarer.
Tyrosinase-aktivitetsanalyse i B16F10-celler
Ved å estimere oksidasjonshastigheten til l-dopa,tyrosinaseaktivitetene ble evaluert med mindre modifikasjoner, som beskrevet i forrige arbeid.20 Celler som ble sådd med en tetthet på 5×104 celler/brønn i en 24-brønnplate fikk lov til å feste ved 37 grader i en fuktet atmosfære som inneholder 5 prosent CO2 i 24 timer. Cellene ble eksponert for -MSH (1 µM) og PDTM3 (0, 5, 10 eller 25 µM) eller kojinsyre (25 µM), og platen ble inkubert under de samme forholdene i 24 timer. Etter å ha blitt skylt to ganger med PBS, ble cellene lysert med 100 μL lyseringsbuffer inneholdende 0,1 mM PMSF (5 μL), 50 mM PBS (90 μL, pH 6,8) og 1 prosent Triton X-100 (5 μL) og fryses ved -80 grader i 30 minutter. Lysater ble tint og sentrifugert ved 12,000 g i 30 minutter ved 4 grader, og supernatanter (80 μL) ble kombinert med 10 mM l-dopa (20 μL) i en 96-brønnplate, som deretter ble inkubert i 30 minutter ved 37 grader. Optiske tettheter ble beregnet ved 500 nm, og de hemmende aktivitetene til tyrosinase ble bestemt slik:
Hemming ( prosent )=× 100 ([A−B] − [C−D] /[ A−B ] ) (2)
hvor B og A er de optiske tetthetene til blindprøven før og etter inkubering, henholdsvis, og D og C er de optiske tetthetene til testforbindelsen før og etter inkubering, henholdsvis.
Statistisk analyse
Enveis variansanalyse etterfulgt av Dunnetts test ble brukt for å bestemme om gruppegjennomsnittet skilte seg signifikant fra kontrollene. Welchs uparrede t-test ble brukt for å bestemme om effektene av PDTM3 og kojinsyre var signifikant forskjellige. Statistisk analyse ble utført ved bruk av GraphPad (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Alle resultater er angitt som gjennomsnitt ± standardfeil for tre uavhengige eksperimenter. Tosidige P-verdier på, 0.05 ble ansett som statistisk signifikante.
Resultater og diskusjon
Fremstilling av PDTM1–PDTM17PDTM1–PDTM17 ble syntetisert som vist i skjema 1. Oppvarming av 2,3-dimerkapto-1-propanol og tallrike passende substituerte benzaldehyder (1–17) i 1,4-dioksan i nærværet av svovelsyre ga de ønskede PDTM-produktene som faste stoffer eller klebrig olje. Strukturene til sluttproduktene ble bekreftet ved 1H og 13C NMR, korrelasjonsspektroskopi, heteronukleær enkeltkvantekorrelasjonsspektroskopi, heteronukleær multippelbindingskorrelasjonsspektroskopi og lav- og høyoppløselig MS. Tilstedeværelsen av singletten som tilsvarer –SCH(Ph)S–-protonet ved δ=6.09–5.56 ppm i 1H NMR-spektre bekreftet dannelsen av en ditiolanring mellom benzaldehyder og 2,3-merkapto -1-propanol. I 1H NMR-spektroskopiske data for PDTM-er, dukket 2-H-toppen opp mer nedfelt enn toppene av protoner festet til sp3-karbonatomer, og 4-H-eksometylen- og 5-H2-toppene ble observert mer upfield i navngitt rekkefølge. I 13C NMR spektroskopiske data, bortsett fra topper fra fenylringen, var karbontoppen til eksometylen (~64 ppm) mest nedfelt, fulgt i rekkefølge av 4-C (~58 ppm), 2-C (~55,3 ppm) og 5-C (~41 ppm). Fire produkter – PDTM6, PDTM12, PDTM13 og PDTM15 – ble hver oppnådd som et enkelt racemat, mens de andre ble oppnådd som en blanding av to racemater ([2R,4R]/[2S,4S] og [2R,4S]/ [2S,4R], 1:1–1:1,5), hvis forhold ble beregnet ved bruk av 1H NMR spektroskopiske data. Fenomenet i produktformasjonen kunne ikke forklares bare med steriske, elektroniske og/eller stereoelektroniske effekter. Detyrosinase-hemminganalysen ble utført uten separasjon av racematene.
Hemmende effekter av PDTM1–PDTM17 på sopptyrosinase
Potensialene til de 17 syntetiserte produktene, PDTM1–PDTM17, for å hemme sopptyrosinaseaktivitet ble undersøkt ved å bruke kojinsyre22 og arbutin23 som positive kontroller. Inhiberinger ble bestemt ved å bruke 293 µM l-tyrosin som substrat og syntetiske forbindelser ved en konsentrasjon på 50 µM.Tyrosinaseinhiberinger av kojinsyre og arbutin ble bestemt ved henholdsvis 50 og 500 uM.
Tre forbindelser – PDTM11 (3,4,5-trimetoksyfenyl), PDTM15 (4-hydroksy-3-metylfenyl) og PDTM17 (3,5-di-t-butyl{{ 12}}hydroksymetyl) – hemmet tyrosinase i samme grad som kojinsyre og hemmet den mer enn arbutin (tabell 1). Fem PDTM-derivater – PDTM3 (2,4-dihydroksyfenyl), PDTM7 (4-metoksyfenyl), PDTM8 (3,4-dimetoksyfenyl), PDTM9 (2,4-dimetoksyfenyl), og PDTM13 (3-brom-4-hydroksyfenyl) – hemmet tyrosinase sterkere enn kojinsyre. IC50-verdier av disse forbindelsene ble undersøkt: 13,94±1,76 µM (PDTM3), 16,47±2,36 µM (PDTM7), 16,97±2,99 µM (PDTM8), 27,85±1,47 µM (PDTM5) ±31,31 µM (PDTM5) og 31 µM. De lave IC50-verdiene til PDTM3, PDTM7, PDTM8 og PDTM13 indikerte at styrken var sterkere enn for kojinsyre (18.86±2.14 µM) og arbutin (381.26±3.22 µM), som ble brukt som positive kontroller . Interessant nok stemmer dette resultatet overens med vårt tidligere funn om at mange analoger med en 2,4-dihydroksyfenyldel har høyeretyrosinase-hemmendeaktivitet enn kojinsyre.10,13,24–32
De gjenværende PDTM-derivatene hadde ingen (PDTM1 og PDTM2) eller lav hemmende effekt (PDTM4, PDTM5, PDTM6, PDTM10, PDTM12, PDTM14 og PDTM16) sammenlignet med kojinsyre. I følge våre akkumulerte struktur-aktivitetsforholdsdata var analoger med minst en hydroksylgruppe mer i stand til å hemme tyrosinase. Noe overraskende inhiberte fire PDTM-derivater uten hydroksylgruppe tyrosinaseaktivitet like mye eller mer effektivt enn kojinsyre. Disse var PDTM7 (4-metoksyfenyl), PDTM8 (3,4-dimetoksyfenyl), PDTM9 (2,4-dimetoksyfenyl) og PDTM11 (3,4,5-trimetoksyfenyl) . Forbindelser (PDTM1-2, PDTM4-5 og PDTM12) med bare en 4-hydroksylgruppe på fenylringen eller en alkoksy- eller hydroksylgruppe i posisjon 3 med en 4-hydroksylgruppe gruppen hadde lav eller ingen aktivitet, mens forbindelser (PDTM13–PDTM17) med en alkyl- eller bromgruppe i posisjon 3 med en 4-hydroksylgruppe viste moderat høy tyrosinaseinhiberende aktivitet. Disse struktur-aktivitet-forholdsresultatene støtter hypotesen om attyrosinaseinhiberendeaktiviteten til forbindelser med en 4-hydroksylgruppe påvirkes i stor grad av typen 3-substituent.
cistanchefordel: anti-aldring
Modus for sopptyrosinaseinhibering av PDTM3
Siden PDTM3 hemmet sopptyrosinasemest ble et Lineweaver–Burk-plott brukt for å bestemme arten av dens hemmende effekt. Som avbildet i figur 2 ble det oppnådd et dobbelt-resiprokt plott, og alle linjer med forskjellige helninger krysset y-aksen i samme punkt. Derfor økte Km (Michaelis konstant) verdier gradvis med konsentrasjonen av PDTM3. Detaljerte kinetiske parameterverdier er vist i tabell 2. På den annen side ble maksimal reaksjonshastighet (Vmax) ikke påvirket av PDTM3-konsentrasjon. Disse funnene viser PDTM3 doseavhengig og kompetitivt hemmet tyrosinase.
I silico-dokkingsimuleringer av assosiasjon av tyrosinase med PDTM3, PDTM7–PDTM9, PDTM13 og kojinsyre
AutoDock Vina ble brukt for å bestemme om de syntetiserte PDTM-analogene direkte hemmet tyrosinase gjennom binding til dets aktive sete. Kojic syre og fem PDTM-analoger (PDTM3, PDTM7–PDTM9 og PDTM13), som ble funnet å ha kraftig sopptyrosinase-hemmendeaktivitet, ble brukt som ligander for dokkingsimuleringen. Hver av disse PDTM-analogene kan ha fire stereoisomerer, og bindingsenergiene til stereoisomerene er angitt i figur 3A. Alle fem PDTM-analogene ble funnet å ha en lignende eller høyere affinitet for det aktive stedet for tyrosinase sammenlignet med kojinsyre (-5,4 kcal/mol), og PDTM3 viste størst affinitet. Dette resultatet indikerte at de sterke hemmende effektene av disse fem PDTM-derivatene skyldtes deres bindingsaffinitet med tyrosinase, og viste en nær sammenheng mellom bindingsaffinitet, bestemt ved dokkingsimulering, og tyrosinaseinhibering.
LigandScout 3.1.2 ble brukt til å identifiseretyrosinaseaminosyrerester som interagerer med PDTM-analoger. Som vist i figur 3B og C, interagerte 4-hydroksylgruppen på fenylringen til PDTM3 med His85 av tyrosinase gjennom hydrogenbinding, og fenylringen interagerte med Val283 og Ala286 gjennom hydrofobe interaksjoner og med His263 gjennom π–π stable interaksjon. Hydrogenbinding mellom den alkoholiske hydroksylgruppen og aminosyrerester av tyrosinase ble kun påvist for PDTM7 og PDTM8. Imidlertid interagerte den alkoholiske hydroksylgruppen til begge PDTM-analogene med forskjellige aminosyrerester, f.eks. PDTM7 interagerte med His244 og Asn260, mens PDTM8 interagerte med Gly281. Videre var Val283 av tyrosinase involvert i hydrofobe interaksjoner med alle fem analogene.
Melanin-innholdsanalyser
B16F10-celler ble brukt til å evaluere depigmenteringsaktivitetene til PDTM-analogene. PDTM3 ble valgt for de cellebaserte eksperimentene på grunn av dens potente sopptyrosinase-hemmendeeffekt og dens mangel på toksisitet for B16F10-celler. PDTM3 ble evaluert for sin hemmende effekt mot -MSH-stimulertmelanogenesei B16F10-celler ved å bestemme melaninnivåer i cellene. Melaninnivåer ble betydelig redusert etter at celler ble behandlet samtidig med PDTM3 og -MSH sammenlignet med celler behandlet med -MSH alene. Over konsentrasjonsområdet 0–25 μM viste PDTM3 en signifikant og doseavhengig antilanogen effekt. Videre, ved en konsentrasjon på bare 10 μM, viste PDTM3 høyere hemmende styrke enn kojinsyre ved 25 μM, som vist i figur 5. Disse resultatene indikerte at den antilanogene effekten av PDTM3 i B16F10-celler ikke var relatert til cytotoksisitet.
Tyrosinase-aktivitetsanalyse i B16F10-celler
Den hemmende effekten av PDTM3 på cellulær tyrosinaseaktivitet ble undersøkt i B16F10-celler prestimulert med -MSH. PDTM3 doseavhengig hemmettyrosinaseaktivitet over konsentrasjonsområdet 0–25 μM (Figur 6). Videre samsvarte disse resultatene godt med melanininnholdsresultater, noe som antydet at den antilanogene effekten av PDTM3 skyldtes hemming av tyrosinase.
Konklusjon
I dette arbeidet ble en rekke PDTM-analoger syntetisert og evaluert for deres effekter påmelanogeneseog tyrosinaseaktivitet i B16F10-celler. Åtte analoger viste like mye eller mer potent hemming mot sopptyrosinase enn kojinsyre, og PDTM3 hadde den største hemmende aktiviteten. I B16F10-celler hemmet PDTM3 signifikant melaninbiosyntesen på en doseavhengig måte ogtyrosinaseaktivitet over konsentrasjonsområdet 0–25 μM uten cellegift. Ved en konsentrasjon på 10 μM reduserte PDTM3 melaninbiosyntesen og tyrosinaseaktiviteten betydelig mer enn kojinsyre ved 25 μM. I lys av vår observasjon at mange PDTM-analoger viste kraftige tyrosinaseinhiberende aktiviteter, foreslår vi at 1,3-ditiolan anses som et passende stillas fortyrosinase-hemmendeaktivitet. Nå ser vi etter separasjonsbetingelser for hver PDTM-blanding av to racemater, og separasjonsforholdene og den antilanogene effekten av hvert enkelt racemat vil bli rapportert etter hvert.
