Evaluering av antimelanogen aktivitet og mekanisme av Galangin i silico og in vivo
Mar 29, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
Ki Wung Chung, en Hyeong Oh Jeong, en Eun Kyeong Lee, en Su Jeong Kim, en Pusoon Chun, bHae Young Chung,*, a og Hyung Ryong Moon*, en
Unormal pigmentering på grunn av overdreven melaninsyntese kan føre til alvorlige problemer som fregner, aldersflekker og melanom. Tyrosinasehemmere har vært et interessant mål for behandling av hyperpigmentering fordi tyrosinase er det hastighetsbegrensende enzymet i melaninsyntesen. Screeningen for sterke tyrosinasehemmere førte til funnet av flavonoidetgalanin, som viste bemerkelsesverdige hemmende effekter på sopptyrosinase. IC50-verdien til galanin (3,55±0,39 µM) var lavere enn for kojinsyre (48,55±1,79 µM), som ble brukt som en positiv kontroll. I silico dokking simulering og mekanistiske studier viste at galanin interagerte med de katalytiske stedene til tyrosinase og konkurrerte med tyrosin. I B16F10 melanomceller stimulert med -melanocytt-stimulerende hormon, hemmet galanin tyrosinaseaktivitet så vel som melaninproduksjon. Selv om høye doser avgalaninvar cytotoksiske, ble ingen cytotoksiske effekter observert ved lave doser. I tillegg ble in vivo-effekten av galanin evaluert i HRM2 melanin-besittende hårløse mus. Målt ved hudblekingsindeksen og melaninfarging, økte gjentatt UVB-eksponering hudens melaninsyntese. Galangin-påføring reduserte melanogenese indusert av UVB-eksponering betydelig. Samlet indikerer våre data detgalaninviser sterk tyrosinaseinhiberingsaktivitet, noe som tyder på at det kan være et effektivt hudblekende middel.
Nøkkelordgalanin; melanogenese; pigmentering; tyrosinase
Galangin, en flavonoidforbindelse, finnes i høye konsentrasjoner i Alpinia officinarum og Helichrysum) Tidligere studier har vist at galangin har ulike farmakologiske aktiviteter, beskytter planter mot UV-stråling, patogener og planteetere, og utøver antibakterielle og antivirale aktiviteter.2– 4) Det har imidlertid også antioksidative egenskaper, som kan tilskrives dets gunstige effekter.5) Galangin utøver også antikrefteffekter gjennom hemming av veksten av kreftcellene.6,7)
Melanin er et biologisk pigment som finnes i de fleste organismer. I hudbiologi produseres melanin ved oksidasjon av aminosyren tyrosin. I normal fysiologi forhindrer melanin hudskader gjennom absorpsjon av skadelig UV-stråling.8)Det syntetiserte melaninet i hudmelanocytter distribueres til keratinocytter, hvor det primært deltar i beskyttelse mot skadelig UV-bestråling.8) Men til tross for visse fordeler, er overdreven melanin kan også forårsake estetiske problemer og hudsykdommer.9) Unormale pigmenteringer, som fregner, aldersflekker, melasma og senile lentiginer, forårsaker alvorlige problemer for normal hudfysiologi.10,11) Derfor er modulering av melanogenese en viktig strategi for behandlingen av overdreven hudpigmentering.En rekke enzymer deltar i prosessene med melanogenese. Blant disse ulike enzymene er tyrosinase, som katalyserer oksidasjonsprosessene av L-tyrosin til 3,4-dihydroksyfenylalanin (L-DOPA) og L-DOPA til dopakinon, den viktigste.12) Disse prosessene mediert av tyrosinase er hastighetsbegrensende prosesser. Under unormale forhold har hyperaktivering av tyrosinase blitt oppdaget med økt total melaninproduksjon.13) På grunn av sin nøkkelrolle i melanogenese, er tyrosinase et attraktivt mål for et depigmenteringsmiddel.14) Således er forskjellige tyrosinasehemmere fra både naturlig forekommende og syntetiske kilder er utviklet. Mange tyrosinasehemmere, inkludert hydroksykinon, kojinsyre og arbutin, har tidligere blitt brukt i medisin- og kosmetikkindustrien. Selv om det er utviklet flere tyrosinasehemmere kommersielt, har cytotoksiske bivirkninger blitt tydelige.12) Derfor er det nødvendig med effektive og sikre hudblekende midler.
Hensikten med denne studien var å karakterisere galangin som en potent tyrosinasehemmer ved bruk av ulike eksperimentelle metoder. Under søket etter tyrosinasehemmere fra naturlige kilder fant vi at galangin reduserte tyrosinaseaktiviteten betydelig med høy styrke. Fordi de hemmende effektene av galanin på tyrosinase allerede var rapportert, fokuserte vi på de hemmende mekanismene og styrken i celle- og dyreforsøk.1) Ved å bruke forskjellige in silico-, in vitro- og in vivo-eksperimenter, indikerte våre data at galangin kan være en kraftig hudblekende middel for behandling av hudpigmentering.
cistanche tubolosa helsemessige fordeler:hudbleking
MATERIALER OG METODER
Materialer
Galangin, kojinsyre, sopptyrosinase, L-tyrosin, -melanocytt-stimulerende hormon (-MSH) og andre kjemiske reagenser ble kjøpt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA).
Måling av tyrosinaseinhiberende effekt og hemmende mekanisme i et cellefritt system
For å evaluere den hemmende effekten og mekanismene til galangin på tyrosinase, ble sopptyrosinase brukt som tidligere beskrevet. Kort fortalt ble 1000 enheter sopptyrosinase oppløst i 20 µL fosfatbufret saltvann (PBS) og tilsatt til 170 µL av analyseblandingen, som inneholdt 1 mM L-tyrosin, 50 mM fosfatbuffer (pH 6,5), og µL. testmaterialet. Blandingen ble inkubert ved romtemperatur (25 grader) i 30 minutter. Mengden produsert dopakrom ble målt spektrofotometrisk ved 492 nm (OD492) i en mikroplateleser. IC50 ble beregnet fra repetisjoner av eksperimentet ved forskjellige galangindoser. For å bestemme den hemmende mekanismen til galanin, ble det utført en kinetisk analyse av tyrosinase. Forskjellige konsentrasjoner av L-tyrosin (1, 2, 4 og 8 mM) ble brukt for inhiberingsanalysen. Etter undersøkelse ble hver verdi konvertert til sin gjensidige i henhold til Lineweaver – Burk-plott. Resultatene viste plottet av 1/V versus 1/[S]. Skjæringspunktet mellom hvert plott ble brukt for å bestemme den hemmende mekanismen.
Dokkingsimulering
For in silico protein-ligand docking-simulering brukte vi AutoDock4.2. Vellykket binding ble oppnådd mellom proteinet og liganden. Den tredimensjonale (3D) strukturen til tyrosinase brukt i krystallstrukturen var fra Agaricus bisporus (PDB ID: 2Y9X) og et forhåndsdefinert bindingssted for tyrosin ble brukt som dokkingslomme.15) Dokkingsimuleringene ble utført mellom tyrosinase og galangin /kojinsyre. Forbindelsene ble fremstilt for dokkingsimulering ved følgende trinn: (1) 2D-strukturer ble konvertert til 3D-strukturer; (2) ladninger ble beregnet, og (3) hydrogenatomer ble tilsatt ved bruk av ChemOffice-programmet. Forutsigelsen av mulige hydrogenbindingsrester mellom forbindelsene og tyrosinase og generering av farmakoforer ble beregnet av LigandScout 3.0.
Cellekultursystem
Murine melanom B16F10-celler hentet fra American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) ble først brukt til å evaluere effekten av galanin på tyrosinaseinhibering. Cellene ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM; WELGENE Inc., Korea, LM001-05) supplert med 10 prosent føtalt bovint serum (FBS; WELGENE Inc., S101-01) og penicillin/streptomycin (100 IE/50 µg/mL; WELGENE Inc., LS202-02) ved 37 grader i en fuktet atmosfære som inneholder 5 prosent CO2 i luften. For å evaluere effekten av galangin på cellelevedyktighet, ble en cellelevedyktighetsanalyse utført ved bruk av et kommersielt tilgjengelig sett (EZ-1000, Dogen Bio, Korea). Kort fortalt ble cellene dyrket i 96-brønnplater og behandlet med forskjellige konsentrasjoner av galangin. Etter den angitte tiden ble absorbansen avlest ved 450 nm ved å bruke en mikroplateleser. Alle celleforsøk ble utført minst tre ganger for å sikre reproduserbarhet.
Tyrosinase aktivitet
Tyrosinaseaktivitet i B16F10-celler ble undersøkt gjennom måling av oksidasjonshastigheten til L-DOPA. Cellene ble sådd ut i skåler med 60 π-brønner, inkubert i nærvær eller fravær av 1 µM -MSH, og deretter behandlet i 24 timer med 5 og 10 µM galangin. Behandling med kojinsyre ble brukt som positiv kontroll. Cellene ble lysert i 500 µL 50 mM natriumfosfatbuffer (pH 6,8) inneholdende 25 µL 1 prosent Triton X-100 og 25 µL 0,1 mM fenylmetylsulfonylfluorid og deretter frosset ved -80 grader i 30 minutter. Etter tining og blanding ble de cellulære lysatene klarnet ved sentrifugering ved 12000 xg i 30 minutter ved 4 grader. Supernatantene (80 µL) ble plassert i en 96-brønnplate, 20 µL L-DOPA (2 mg/ml) ble tilsatt, og absorbansen ble avlest ved 492 nm hvert 10. minutt i 1 time ved 37 grader ved bruk av en plateleser.
Cistancheekstrakt: hemmer tyrosinaseekspresjon
Melanin innhold
I den nåværende studien ble melanininnholdet brukt som en indeks for melanogenese. Kort fortalt ble B16-celler belagt i en 60π-skål og inkubert i nærvær eller fravær av 1 uM -MSH. Cellene ble deretter inkubert i 24 timer med eller uten galangin ved 5 og 10 µM. Behandlingen med kojinsyre ble brukt som en positiv kontroll. Etter to vaskinger med PBS ble prøvene oppløst i 500 µL 1 NNaOH, inkubert ved 60 grader i 1 time og blandet for å solubilisere melaninet. Absorbansen ved 405 nm ble målt ved å bruke en mikroplateleser.
In vivo-eksperimenter
In vivo-depigmenteringseffektiviteten til galangin ble vurdert i dyreforsøk. Dyrestudiene ble designet av Aging Tissue Bank, godkjent av Institutional Animal Care Committee ved Pusan National University, og utført i samsvar med retningslinjene for dyreforsøk utstedt av Pusan National University. Seks uker gamle mannlige HRM2 melanin-besittende hårløse mus ble hentet fra Hoshino Laboratory Animals (Yoshino, Saitama, Japan) og holdt under kontrollerte forhold (23±1 grad, 55 prosent ±5 prosent fuktighet, 12-t lys /mørk syklus) med gratis tilgang til vann og standard laboratoriediett. Etter en tilvenningsperiode på 1 uke ble musene tilfeldig delt inn i fire grupper på seks dyr. Galangin (10 µM) og kojinsyre (50 µM) ble fremstilt i en løsning bestående av propylenglykol og etanol (3:7). Oppløst løsning (200 µL) eller bærer ble påført topisk på dorsalhuden til dyret en gang per dag. Dyrene ble bestrålt med UVB fra en CROSSLINKER (BEX-800, Ultra-Lum Inc., CA, USA) ved 50 mJ/cm2 i samsvar med dyreforsøksplanen. Fargene på hudstedene ble målt ved å bruke et spektrofotometer CR-10 (Konica Minolta Sensing, Inc., Sakai, Osaka, Japan) der fargene ble beskrevet med L*-, a*- og b*-verdiene deres i samsvar med Commission International de L'Eclairage fargesystem. Etter at dyrene ble avlivet, ble skinnene samlet, fiksert i 4 prosent paraformaldehyd over natten ved romtemperatur og farget for melanin ved å bruke et Fontana–Masson-fargesett fra American Master*Tech Scientific, Inc. (Lodi, CA, USA) i i samsvar med produsentens instruksjoner. Kort fortalt ble oppskåret skinn farget med en ammoniakksølvløsning i 60 minutter ved 60 grader, inkubert i 0,1 prosent gullklorid og deretter i 5 prosent natriumtiosulfat.
Statistiske analyser
Studentens t-test ble brukt til å analysere forskjeller mellom to grupper og ANOVA ble brukt til å analysere forskjeller mellom grupper. Verdier av s<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" the="" analysis="" was="" performed="" using="" graphpad="" prism="" 5="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca,="">
cistanche tubolosa
RESULTATER
In Silico Docking Simulering av Galangin på Tyrosinase
Galangin er et naturlig forekommende fytokjemikalie og inneholder en flavonoiddel i sin struktur (fig. 1). Opprinnelig ble det utført en dokkingsimulering mellom sopptyrosinase (tertiær struktur) og forbindelser (galangin, kojinsyre og tyrosin). Dokkingstedet som galangin og kojinsyre ble bundet til ble tidligere bestemt som det aktive stedet for tyrosinase.15) Denne simuleringen var vellykket og en betydelig poengsum ble oppnådd. Bindingsenergien mellom galangin og tyrosinase var -7,67 kcal/mol, bestemt ved analyse ved bruk av Autodock4.2. Bindingsenergien mellom tyrosinase og kojinsyre (den positive kontrollen) var -4,09 kcal/mol, og -5,13 kcal/mol mellom tyrosinase og det opprinnelige substratet, tyrosin (tabell 1). Disse resultatene viste at galangin bandt tyrosinase med høyere affinitet enn de andre interaksjonene. Basert på dokkingsimuleringsresultatene søkte vi interaksjonene mellom tyrosinase og forbindelser ved å bruke LigandScout-programmet. Vi fant at galangin interagerte med ASN-260, VAL-283, ALA-286 og PHE-292, mens kojinsyre bare interagerte med ASN-260 og MET280 ( Fig. 2, Tabell 1). Disse interaksjonene kan derfor være nøkkeldeterminantene for inhibitoraktivitet og ha en viktig effekt på dokkingscore.
Bestemmelse av anti-melanogene effekter og mekanismer i sopptyrosinase
Basert på silikonresultatene og andre tidligere rapporterte resultater, evaluerte vi de antilanogene effektene og mekanismene ved å bruke sopptyrosinase. Når testet med sopptyrosinase i cellefritt system, var den hemmende effekten av galangin sterkere enn kojinsyre (fig. 3A). I tillegg reduserte galangin doseavhengig tyrosinaseaktivitet (fig. 3B). IC50-verdiene for galangin og kojinsyre ble beregnet og er presentert i tabell 2. Den lave IC50-verdien til galangin (3,55±0,39 µM) indikerte at styrken var betydelig høyere enn for kojic syre (48,55±1,79 uM). Den hemmende mekanismen til galangin ble videre evaluert ved å bruke Lineweaver – Burk dobbelt-resiproke plott. Ulike konsentrasjoner av L-tyrosin (1, 2, 4 og 8 mM) og galangin (0, 7,5 og 15 µM) ble brukt for inhiberingsanalysen. De tidsavhengige endringene i absorbansen ble målt og de doble resiproke resultatene ble plottet (fig. 3C). Resultatene indikerte at plottet av 1/V versus 1/[S] produserte tre forskjellige linjer med forskjellige helninger, som krysset på samme vertikale akse. Etter hvert som konsentrasjonen av forbindelsen økte, økte verdien av Km, men verdiene av Vmax forble de samme, noe som antydet at galangin var en konkurrerende hemmer av binding til tyrosinase. Disse dataene stemte overens med in silico-resultatene som galangin bandt til og hemmet det aktive stedet for tyrosinase.
Fig. 1. Strukturene til Galangin, Kojic Acid og Tyrosine
Evaluering av depigmenterende aktivitet av Galangin i B16F10 murine melanomceller
Deretter ble depigmenteringsaktiviteten til galangin evaluert ved å bruke B16F10 murine melanomceller. Først ble de cytotoksiske effektene av galangin på B16F10 murine melanomceller testet. Som vist i fig. 4A reduserte galangin cellelevedyktigheten betydelig ved doser over 25 µM. Derfor, for å unngå cytotoksisitet, brukte vi 5 µM og 10 µM galangin i eksperimentene for å evaluere de antilanogene effektene. B16F10-celler ble behandlet med galangin i nærvær av 1 uM -MSH. Den totale melaninsyntesen forårsaket av -MSH-behandling var synlig for det blotte øye og viste at galangin kraftig hemmet -MSH-utløst melaninsyntese (fig. 4B). -MSH-behandling økte tyrosinaseaktiviteten og melanininnholdet i B16F10-celler betydelig (fig. 4C, D). Galanginbehandling hemmet cellulær melanogenese, som ble forsterket av -MSH på en doseavhengig måte (fig. 4C, D). Samlet indikerte disse resultatene at galangin kan være et potent middel for undertrykkelse av melanogenese gjennom hemming av tyrosinase.
Tabell 1. Dokkingscore og de viktigste interaktive restene av forbindelser
Effekter av Galangin på in vivo hudpigmentering
De hemmende effektene av galangin ble deretter undersøkt i melanin-besittende hårløse mus som ble behandlet som beskrevet av skjemaet i fig. 5A. Fargene på hudstedene ble målt nøyaktig ved å bruke et spektrofotometer. UVB-eksponeringen av mus førte til en reduksjon i L*-verdien, som var representativ for pigmentering (fig. 5B). De UVB-induserte reduksjonene i L*-verdien ble signifikant blokkert i de galanin-behandlede dyrene sammenlignet med den i kontrolldyrene behandlet med bærer, som viste den kraftige depigmenteringseffektiviteten til galanin (fig. 5B). ΔL*-verdien indikerte også styrken til galangin under forsøksperiodene (fig. 5C). I tillegg indikerte hudfargene som ble oppdaget av det blotte øye på dag 14 også den antilanogene styrken til galangin (fig. 5D). Fontana–Mas son-farging, som fremhever melanin, bekreftet effekten av galangin. Hudprøvene fra UVB-bestrålte dyr viste økte melaninflekker (fig. 5E). I samsvar med de numeriske dataene fra spektrofotometri, viste galanin-behandlede dyr en reduksjon i de fargede melaninflekkene sammenlignet med de UVB-bestrålte kontrolldyrene (fig. 5E). Samlet antydet disse dataene detgalaninvar et effektivt tidsangiogent middel i den UVB-induserte in vivo melanogenesemodellen.
Fig. 2. Resultatene for in Silico dokkingsimulering mellom tyrosinase og kandidatforbindelsene
DISKUSJON
Det har tidligere blitt rapportert at galangin utøver ulike biologiske effekter, inkludert cytobeskyttelse. Selv om anti-tyrosinase-aktiviteten til galangin tidligere har blitt studert, ble ikke mekanismene og den nøyaktige effekten i cellekultursystemer fullstendig beskrevet.1,16) Derfor hadde vi som mål å utforske styrken og hemmende mekanismer til galangin. Den hemmende effekten av galangin ble først evaluert ved å bruke in silico-dokkingsimulering. Dokkingsimuleringene avslørte at bindingen av galangin til det aktive stedet for tyrosinase var mer stabil enn bindingen til det opprinnelige substratet (tyrosin) eller kojinsyre (positiv kontroll). Den hemmende effekten og mekanismene ble også bekreftet ved bruk av sopptyrosinase. Til slutt ble den hemmende effekten av galangin mot melanogenese evaluert i -MSH-stimulerte B16F10 murine melanomceller. Oppsummert identifiserte denne studien galanin som et potent middel.
Beregningsbasert dokkingsimulering er etablert som et kraftig verktøy for å screene og evaluere nye farmakologiske midler.17) Dokkingsimuleringsresultater gir ikke bare bindingsstedene, men også bindingsaffiniteten mellom forbindelsen og enzymet, som gir innledende informasjon uten behov for fysiske eksperimenter.18) Selv om spådommene ikke alltid er nøyaktige og krever ytterligere eksperimenter, reduserer dokkingsimuleringen materialene og ressursene som kreves, og kan også støtte de biologiske eksperimentelle dataene. Vår beregningsbaserte dokkingsimulering indikerte at galangin kunne binde seg sterkere til tyrosinase enn tyrosin eller kojinsyre. Videre var antallet interagerende rester mellom galangin og tyrosinase større sammenlignet med tyrosin eller kojinsyre. De første dokkingdataene ble ytterligere verifisert ved å bruke en tyrosinase-enzymanalyse, som viste at IC50 for galangin var lavere enn kojinsyre; dermed var de hemmende effektene av galangin på tyrosinase mer potente enn kojinsyre.
Den hemmende mekanismen til galangin på tyrosinase ble videre undersøkt ved å bruke sopptyrosinase. Fordi dokkingsimuleringsdata antydet at galangin binder seg til det samme aktive stedet som tyrosinase binder seg til, ble det forventet at galangin kan være en konkurrerende hemmer av tyrosinase. De eksperimentelle resultatene avslørte at galangin kompetitivt hemmet tyrosinase fra å binde dets opprinnelige substrat, tyrosin, noe som bekreftet dokkingsimuleringsresultatene. Samlet viste resultatene påliteligheten til den beregningsbaserte dokkingsimuleringen og dens potensiale for screening av hemmere.
Effekten av galangin ble også evaluert i B16F10 murine melanomceller. Galangin viste signifikante cytotoksiske effekter i B16F10-celler når det ble administrert i høy dose. Dette stemte overens med tidligere rapporter om antikreftaktiviteten til galangin i flere kreftcellelinjer.19,20) På grunn av de cytotoksiske effektene, krevde eksperimentene for å verifisere de anti-melanogene effektene av celler nøye utvalg av forholdene. Imidlertid var IC50-verdien til galangin svært lav når den ble testet i et cellefritt system som ikke viste noen cytotoksiske effekter. Faktisk var effekten av galangin for hemming av melanogenese akseptabel ved lave doser som ikke utøvde cytotoksisitet. Lave doser galangin reduserte effektivt melanininnholdet, samt tyrosinaseaktiviteten, i cellekultursystemet. Sammen med det cellefrie systemet,galaninviste seg å ha en sterk hemmende effekt på tyrosinase i cellekultursystemet.
Til slutt ble den antilanogene effekten av galangin evaluert ved å bruke en HRM2 hårløs mus. Den hårløse musemodellen HRM2 ga et nyttig grunnlag for in vivo melanogenese-eksperimenter, da musen kan produsere melanin, spesielt under miljøpåkjenninger.21,22) I denne musemodellen viste galangin en signifikant anti-lanogen effekt på UVB-indusert melaninsyntese. Så vidt vi vet, er dette den første studien som viser den antilanogene effekten av galangin ved bruk av en in vivo melanogenesemodell. Det er viktig å etablere in vivo-effekt fordi mange andre melanogenese-hemmere ikke har virket in vivo på grunn av deres manglende evne til å krysse stratum corneum i huden. Oppsummert,galaninble identifisert som et potent animalsk angiogent middel in vivo. Vi konkluderte med at tyrosinasehemmeren galangin tilbød en ny medikamentkandidat for behandling av hyperpigmenteringsforstyrrelser.
cistanche kapsler
