Kontakt:jerry.he@wecistanche.com

Vinita D. Apraj1, Nancy S. Pandita2

1 Institutt for biologiske vitenskaper, 2 Institutt for kjemi, Sunandan Divatia School of Science, SVKMs NMIMS, Vile-Parle (W), Mumbai, Maharashtra, India

Cistanche har en anti-aldringseffekt

ABSTRAKT

Bakgrunn: Skallet til Citrus reticulata Blanco brukes tradisjonelt som styrkende, mage-, snerpende og karminativ. Det er også nyttig i hudpleie. Mål: Å studereanti-aldringpotensialet til alkoholekstrakter av C. reticulata Blanco peeling ved bruk av in vitro antioksidant- og anti-enzymanalyser.

Materialer og metoder: Planteekstrakter ble oppnådd ved Soxhlation (CR HAE‑ Hot Alcoholic Extract of Citrus reticulata) og maserasjonsmetode (CR CAE‑ Cold Alcoholic Extract of Citrus reticulata). Kvalitativ og kvantitativ fytokjemisk analyse ble utført. Videre in vitroantioksidant, anti-enzym- og gasskromatografi-massespektrometri (GC-MS)-analyser ble utført. Resultater: Totalt fenol- og flavonoidinnhold av CR HAE ble funnet å være høyere enn CR CAE. EC50-verdien for CR HAE og CR CAE for 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl, Superoxide anion og 2,2'-azino-bis (3-etylbenzotiazolin-6-sulfonsyre)-analyser var 25 {55}},33 ± 40,16 µg/ml og 254,73 ± 15,78 µg/ml, 221,27 ± 11,25 µg/ml og 354,20 ± 23,79 µg/ml, og 59,12 µg/ml og 59,12 µg/ml, og ±g/lyv. Absorbanskapasiteten for oksygenradikaler for CR HAE og CR CAE ble funnet å være henholdsvis 1243 og 1063 µmol 6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylkroman-2-karboksylsyreekvivalent/g stoff. Anti-kollagenase- og anti-elastase-aktiviteter ble evaluert for både CR HAE og CR CAE. EC50-verdier av CR HAE og CR CAE for anti-kollagenase og anti-elastase var henholdsvis 329,33 ± 6,38 µg/ml, 466,93 ± 8,04 µg/ml og 3,22 ± 0,24 mg/ml, 0,30 mg/ml, 5,09 mg/ml. CR HAE viste sterkere anti-kollagenase og anti-elastase aktivitet enn CR CAE. GC-MS-analyse av CR HAE ble utført fordi CR HAE viste høyereantioksidantog anti-enzympotensial enn CR CAE. Konklusjon: C. reticulata peeling kan brukes ianti rynkehudpleieformuleringer.

Nøkkelord: 1,1-difenyl-2-picrylhydrazyl, 2, 2'-azino-bis (3-etylbenzotiazolin-6-sulfonsyre), anti-rynke, elastase, gasskromatografi-massespektrometri, oksygenradikalabsorpsjonskapasitet

SAMMENDRAG

• Hudantialdringspotensialet til Citrus reticulata Blanco peeling ble evaluert gjennom

• In vitroantioksidantog anti-enzymanalyser

• To typer ekstraksjon ble utført og ekstrakter ble utsatt for kvalitativ og kvantitativ fytokjemisk analyse. Ekstraktet oppnådd ved Soxhlation (CR HAE) viste høyere totalt fenol- og flavonoidinnhold enn ekstrakt oppnådd ved maserasjon (CR CAE)

• CR HAE demonstrerte sterk DPPH- og Superoxide-frie radikal-fjernende aktivitet, mens ABTS-rensende aktiviteten til begge ekstraktene ble funnet å være lik. Oksygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) av CR HAE ble funnet å være mer; som indikerer dets sterke antioksidantpotensial

• In vitro kollagenase- og elastase-enzyminhiberingsaktiviteter ble evaluert for både ekstraktene og CR HAE viste sterkt anti-kollagenase- og anti-elastasepotensiale, noe som indikerer dets antialdringsevne

• GC-MS-analyse av CR HAE avslørte tilstedeværelsen av forskjellige forbindelser

hovedsakelig inkludert polymetoksyflavoner. CR HAE viste lovende antioksidant- og anti-enzymatisk aktivitet og kan brukes som en potensiellanti rynkeagent ianti-aldringhudpleieformuleringer.

Forkortelse brukt: ECM: Ekstracellulær matrise, UV: Ultrafiolett, ROS: Reaktive oksygenarter, MMP: Matrix metalloproteinase, Chc: Clostridium histolyticum collagenase, DPPH: 2, 2-difenyl-1-picrylhydrazyl, GC-massekromatografi: gasskromatografi Spektroskopi, RT: Romtemperatur, µg GAE/ mg: Mikrogram Gallussyreekvivalent / milligram, W/V: Vekt etter volum, µg QE/

mg: Mikrogram Quercetin-ekvivalent / milligram, CR HAE: Varm alkoholekstrakt av Citrus reticulata Blanco, CR CAE: Kald alkoholekstrakt av Citrus reticulata Blanco, EC50: Halvmaksimal effektiv konsentrasjon, PMS NADH: Phenazine methosulfate nicotinamide adenine, N teBTtrcleotideenine , DMSO: Dimetylsulfoksid, APS: Ammoniumpersulfat, AAPH: 2,2-azobis(2-amidino-propan) dihydroklorid, TROLOX: (±) 6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylkroman-karboksylsyre syre, ORAC: Oxygen Radical Absorbance Capacity, FALGPA: N-[3-(2-Furyl) akryloyl)]-Leu-Gly-Pro-Ala, SANA: Succinyl-Ala-Ala-Ala-piliardation, REF. Faktor, MSD: Masseselektiv detektor

INTRODUKSJON

Den viktigste rollen til huden for et menneske er å skape en barriere mellom det indre og ytre miljøet i kroppen. Innvendig skjermer og beskytter huden hele det fysisk-kjemiske fenomenet som er nødvendig for livet, eksternt er det en barriere mot mekaniske krefter. Huden er det største organet i kroppen.[1] Det er et svært følsomt organ og kan lett bli skadet av infeksjoner og sykdommer.

Dette er en artikkel med åpen tilgang distribuert under vilkårene i Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 3.0-lisensen, som lar andre remikse, finpusse og bygge på verket ikke-kommersielt, så lenge forfatteren er kreditert og de nye kreasjonene er lisensiert under de samme vilkårene.

Hudproblemer kan oppstå på grunn av ulike faktorer som miljøforurensning, overeksponering for ultrafiolette stråler, alder på individer, skadelige mikroorganismer, spisevaner, stress og kjemikalier. Hudbehandling og -pleie er avgjørende ikke bare for å ha en sunn hud, men også for personens generelle velvære.[2]

Et av de store hudproblemene i dagens verden er for tidlig aldring av huden. Prosessen med hudaldringsprosessen er delt inn i to kategorier: indre og ytre aldring. Iboende aldring av huden eller naturlig aldring er forårsaket av endringer i hudens elastisitet over tid. Ekstrinsisk aldring av huden er hovedsakelig et resultat av eksponering for solstråling (fotoaldring). Frie radikaler dannet på grunn av oksidativt stress, spiller en stor rolle i løpet av både indre og ytre aldring.[3] Hud består av tre hovedlag; epidermis, dermis og subcutis. Hovedkomponentene i dermis er kollagen og elastinfibre. Reduksjon i kollagen og elastin fører tilrynkeformasjon.[4] Hovedårsaken til at huden begynner å synke og dannesrynkerer nedbrytningen av elastin og kollagen. Kollagenase- og elastaseenzymer er ansvarlige for nedbrytning av ulike komponenter i den ekstracellulære matrisen (ECM), dvs. kollagen og elastin. Elastin er et protein som hjelper huden med å holde seg smidig og fast. Når huden din er strukket, er det elastinen som returnerer den til normal posisjon. Kollagen er et fibrøst protein. Kollagen er spesielt blant proteiner på grunn av sin store strekkstyrke som gir fasthet til huden.Rynkerresultat av en kombinasjon av indre og ytre aldring samt på grunn av økt nivå av kollagenase- og elastaseenzymer.[5]

Kosmetikk brukes regelmessig og universelt i forskjellige former for å forbedre skjønnheten. Hudpleiekosmetikk behandler overflatelaget av huden ved å gi bedre beskyttelse mot miljøet enn hud som ikke er behandlet.[6] Det er en økende etterspørsel etter kosmetikk for ansiktshudpleie. I følge datamonitor var globale utgifter til hudpleieprodukter i 2012 82 milliarder dollar, der to tredjedeler av utgiftene besto av ansiktshudpleie. En rapport fra forskning og markeder, forventer at den globale omsetningen for hudpleieprodukter vil krysse 100 milliarder dollar i 2018. Ansiktspleiesegmentet forventes å fortsette å dominere markedet. Den økende etterspørselen etteranti-aldringprodukter og økende bekymring for bruk av naturlige og organiske hudpleieprodukter er de viktigste faktorene som driver hudpleieindustrien.[7] Kosmetikk alene er ikke tilstrekkelig for å ta vare på hud og kroppsdeler; det krever tilknytning av aktive ingredienser for å kontrollere skaden og aldring av huden. Disse urteaktive stoffene som inneholder aktive ingredienser er svært viktige for å opprettholde hudens helse. Kosmetikk med urteaktive stoffer dukker nå opp som en passende løsning på det nåværende problemet.[8] I denne studien, hudanti-aldringpotensialet til alkoholekstrakter av Citrus reticulata Blanco peeling ble evaluert ved in vitro antioksidant-, anti-kollagenase- og anti-elastase-analyser. C. reticulata Blanco (Rutaceae) er vanligvis kjent som Narangi eller Santra (oransje). Frukten er avføringsmiddel, afrodisiakum, snerpende, styrkende og lindrer oppkast.[9] Fruktskallet brukes tradisjonelt som styrkende, mage-, snerpende, karminativt og anti-scorbutic. Sitrusskall har blitt sett på som et biprodukt fra sitrusfruktindustrien, men det er rapportert å inneholde flere aktive komponenter i langt høyere konsentrasjon enn fruktkjøttet.[10] Fruktskallet er også nyttig i hudpleie.

MATERIALER OG METODER

Kjemikalier og reagenser

Askorbinsyre, quercetin, jern(III)klorid, natriumkarbonat (Na2CO3), natriumnitritt (NaNO2), natriumhydroksid (NaOH), aluminiumklorid (AlCl3), 1,1-difenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), bukspyttkjertellastase hos svin (ECC) .3.4.21.36), Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilid (SANA), Clostridium histolyticum collagenase (ChC) (EC.3.4.23.3), N-(3-[2-Furyl)]acryioyl Gly-Pro-Ala (FALGPA), fluorescein-natriumsalt, 2,2-azobis (2-metylpropionamidin) dihydroklorid (AAPH) og gallussyre ble kjøpt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA.) 2, 2 '‑azino-bis (3-etylbenzotiazolin-6-sulfonsyre) diammonium

salt (ABTS), (±) 6-hydroksy-2,5,7,8-tetra-metylkroman-2-karboksylsyre (TROLOX) anskaffet fra Fluka, USA. Nitroblått tetrazolium (NBT), fenazinmetosulfat (PMS) og nikotinamidadenindinukleotid - redusert dinatriumsalt (NADH) ble hentet fra SRL Pvt. Ltd., Mumbai, India. Ammonium per sulfat (APS) ble kjøpt fra Rankem, India.

Innsamling av plantemateriale

Frukter av C. reticulata Blanco, Rutaceae ble hentet i januar 2013 fra Mumbai (India). Den taksonomiske identifiseringen av plantemateriale ble bekreftet av Dr. CS Latto, University of Mumbai. Autentisering ble utført ved Agharkar Research Institute, Pune.

Utvinning av plantemateriale

Frukten ble vasket grundig under vann. Skall ble skilt fra frukt og tørket i skygge. Deretter ble det tørkede materialet utsatt for pulverform og lagret i en lufttett beholder ved romtemperatur. Ca. 50 g tørket pulver ble ekstrahert med 300 ml metanol. Planteekstrakter ble oppnådd ved Soxhlation (CR HAE‑ Hot Alcoholic Extract of Citrus reticulata) og maserasjonsmetode (CR CAE‑ Cold Alcoholic Extract of Citrus reticulata). Soxhlet-ekstraksjon ble utført ved 65 grader i 10–12 timer. Kaldmaserasjon ble utført ved konstant risting; hvor blandingen av plantepulver og metanol ble holdt på en roterende shaker (REMI CIS-24 PLUS) og ble satt til 100 rpm ved RT i 72 timer. Ekstraktene ble filtrert ved bruk av Whatman-filterpapir nr. 1, og filtratene ble deretter fordampet under redusert trykk og tørket ved bruk av en rotasjonsfordamper (R-205, Buchi Laboratory Equipment, Flawil, Sveits) satt til 50 grader. Tørkede ekstrakter ble lagret ved 4 grader, i merkede, sterile flasker med lokk inntil videre bruk.

Foreløpig fytokjemisk analyse av ekstrakter

Ekstraktene som nevnt ovenfor ble utsatt for ulike kvalitative fytokjemiske tester for identifisering av kjemiske bestanddeler som er tilstede i plantematerialet i henhold til de beskrevne metodene.[11]

Bestemmelse av totalt fenolinnhold

Totalt fenolinnhold (TPC) ble bestemt med Folin - Ciocalteu-reagenset ved å bruke den gitte metoden.[12] Til 0,5 ml av hver prøve ble 2,5 ml 1:10 fortynning av Folin - Ciocalteaus reagens og 2 ml Na2CO3 (7,5 prosent w/v) tilsatt og inkubert ved 765 nm ved bruk av et ultrafiolett-synlig spektrofotometer. Resultatene ble uttrykt som µg gallussyreekvivalent per mg ekstrakt (µg GAE/mg ekstrakt).

Bestemmelse av totalt flavonoidinnhold

Totalt flavonoidinnhold (TFC) ble målt ved AlCl3 kolorimetrisk analyse. [13]

En alikvot (1 ml) ekstrakter eller standardløsninger av quercetin (20, 40, 60, 80 og 100 µg/ml) ble tilsatt en 10 ml målekolbe som inneholdt 4 ml destillert vann. Til kolben ble 0,30 ml 5 prosent NaNO2 tilsatt og etter 5 minutter ble 0,3 ml 10 prosent AICl3 tilsatt. Etter 5 minutter ble 2 ml 1 M NaOH tilsatt og volumet ble fylt opp til 10 ml med destillert vann. Løsningen ble blandet og absorbansen ble målt mot blindprøven ved 510 nm. TFC ble uttrykt som µg quercetinekvivalent per mg ekstrakt (µg QE/mg ekstrakt).

Antioksidantanalyser

1, 1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl frie radikaler rensende analyse

Aktiviteten til å fjerne frie radikaler ble evaluert ved gitt metode med noen modifikasjoner. [14] Aktiviteten for fjerning av frie radikaler ble evaluert ved gitt metode med noen modifikasjoner. Et volum på 1 ml av de forskjellige konsentrasjonene (100–800 µg/ml) av testprøver ble blandet med 200 µl (0,36 mg/ml) DPPH-metanolløsning. Etter risting ble blandingen inkubert i mørke ved romtemperatur i 30 minutter, og deretter ble absorbansen målt ved 517 nm. Askorbinsyre ble brukt som en positiv kontroll.

Phenazine methosulfate-NADH-systemet superoksidanion-rensende analyse

Superoksidfjerningsaktiviteten ble evaluert ved gitt metode. [15] Tris HCl-buffer (3 ml, 16 mM, pH 8.0) som inneholder 0,75 ml NBT (50 µM)-løsning, 0,75 ml NADH ( 78 µM) løsning, og 0,3 ml prøveløsning av ekstrakt (50–350 µg/ml) i metanol ble blandet. Reaksjonen ble startet da 0,75 ml PMS-løsning (10 uM) ble tilsatt til blandingen. Reaksjonsblandingen ble inkubert ved 25 grader i 5 minutter, og absorbansen ble avlest ved 560 nm mot de tilsvarende blindprøvene. Askorbinsyre ble brukt som standard.

2,2'-azino-bis (3-etylbenzotiazolin-6-sulfonsyre) radikalfjerningsanalyse

Analysen utføres i henhold til den gitte metoden.[16] ABTS radikalkationer ble produsert ved å reagere ABTS og APS og inkubere blandingen ved romtemperatur i mørke i 16 timer. Kort fortalt inneholdt det totale reaksjonsvolumet 10 mM PBS pH 7,4 (positiv kontroll eller testløsninger) med forskjellige konsentrasjoner. ABTS radikalløsning ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 0,219 mM. Reaksjonsblandingen ble blandet og umiddelbart avlest ved 734 nm ved bruk av mikroplateleser (VERSA max, Molecular devices, USA). En kontrollreaksjon ble utført uten testprøven. Gallussyre ble brukt som en positiv kontroll.

Ekstraktenes evne til å rense DPPH-, PMS-NADH-radikaler og ABTS frie radikaler ble beregnet ved hjelp av følgende formel:

Radikal rensende aktivitet ( prosent )=([Abs of control − Abs of sample]/Abs of control) ×100, der Abs er absorbansen ved nevnte bølgelengde i nærvær eller fravær av testekstraktene.

Oksygenradikalabsorbanskapasitetsanalyse

Denne analysen ble utført i henhold til metoden beskrevet. [17] En preinkubasjonsblanding på 140 µl inneholdt − 20 µl testløsning eller TROLOX med forskjellige konsentrasjoner. 75 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,4; 120 µl natriumfluorescein (117 nM) blandet og inkubert ved 37 grader i 10 min. Etter preinkubering ble 60 ul AAPH (40 mM) tilsatt og blandet i 15 s. Reaksjonen ble utført i 90 minutter ved 37 grader. Fluorescensmålingene ble tatt ved 485 nm eksitasjon og 520 nm emisjonsfiltre.

Enzymanalyser

Anti-kollagenase-analyse

Kollagenasehemmingsanalyse ble utført ved metoden beskrevet tidligere, [18] som er basert på hydrolyse av FALGPA med kollagenase for å produsere FA-Leu og Gly-Pro-Ala. Analysen ble utført i 50 mM tricinbuffer (400 mM NaCl og 10 mM CaCl2, pH 7,5). ChC ble oppløst i bufferen for bruk ved en startkonsentrasjon på 0,8 enheter/ml. Det syntetiske substratet, FALGPA, ble oppløst i Tricine-bufferen til 2 mM. Prøveekstrakter ble inkubert med enzymet i bufferen i 15 minutter før tilsetning av substrat for å starte reaksjonen. Den endelige reaksjonsblandingen (75 µl totalt volum) inneholdt 25 µl 50 mM tricinbuffer, 25 µl testekstrakt (250–4000 µg/ml) og 25 µl 0,1 enheter enzym ChC. Kontroller utført med 50 mM tricinbuffer som testekstrakter ble oppløst i tricinbuffer (50 mM), mens katekin ble brukt som positiv kontroll. Etter tilsetning av 50 µl 2 mM FALGPA-substrat, ble kollagenaseaktiviteten målt umiddelbart ved 340 nm i 20 minutter ved bruk av en 96-brønners mikroplateleser (Bio-Tek M Quant, FLX 800).

Anti-elastase-analyse

Analysen som ble brukt var basert på metoder fra litteraturen. [19] Denne analysen ble utført i 0.2 mM Tris-HCL-buffer (pH 8.0). Porcin pankreaselastase (PE – EC 3.4.21.36) ble oppløst for å lage en 1 mg/ml stamløsning i {{10}},2 mM Tris-HCL-buffer. Substratet N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilid (SANA) ble oppløst i buffer ved 0,8 mM. Testekstraktene (0,156–10 mg/ml) ble inkubert med enzymet i 20 minutter før tilsetning av substrat for å starte reaksjonen. Den endelige reaksjonsblandingen (totalt 250 ul) inneholdt 50 ul planteekstrakt, 160 ul buffer, 20 ul enzym og 20 ul substrat. Catechin ble brukt som en positiv kontroll. Negative kontroller ble utført ved bruk av Tris-HCL-buffer. Absorbansen ble målt umiddelbart ved 410 nm og deretter kontinuerlig i 20 minutter ved bruk av en 96-brønners mikroplateleser (Bio-Tek M Quant, FLX 800). Prosentvis hemming for begge disse analysene er beregnet ved: Enzyminhiberingsaktivitet (prosent)=(1− [B/A]) ×100

Hvor, A=Enzymaktivitet uten prøve, B=Aktivitet i nærvær av prøve.

Gasskromatografi-massespektrometrianalyse

Følgende betingelser ble tatt i bruk for gasskromatografi-massespektrometri (GC-MS)-analyse.[20] Komponentidentifikasjonen ble utført ved bruk av Agilent 7890 A gasskromatograf kombinert med 5975 C inert masseselektiv detektor (MSD) med Triject Axis Agilent-detektor. 7693 autosampler inn i Agilent 19091S-433: HP-5MS kolonne (30 m × 250 µm × 0,25 µm). Helium ble brukt som bæregass (1 ml/min). Injektor- og detektortemperatur ble holdt på 250 grader. Kolonnetemperaturen ble programmert til 60 grader i 3 minutter og deretter hevet til 160 grader i 2 minutter ved 10 grader/min. Ytterligere temperatur ble hevet opp til 300 grader (ved 15 grader /min). Massespektre ble ervervet over 40–500 amu rekkevidde i EI-modus. De eluerte forbindelsene ble identifisert ved å sammenligne massespektraldata med standarddata tilgjengelig i biblioteket til National Institute of Standards and Technology. Hovedbestanddeler fra Soxhlet metanolisk ekstrakt av C. reticulata Blanco peeling (CR HAE) ble identifisert ved GC-MS-analyse.

Statistisk analyse

EC50-verdiene ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik, statistisk analyse ble utført ved enveisanalyse av varians etterfulgt av Tukeys multiple sammenligningstest (P < 0.05)="" hvor="" alle="" prøver,="" dvs.="" testekstrakter="" og="" positiv="" standard="" ble="" sammenlignet="" med="" hverandre.="" alle="" beregninger="" ble="" utført="" med="" graphpad="" prism="" (versjon="" 5.0,="" graphpad="" software,="">

RESULTATER OG DISKUSJON

Foreløpig fytokjemisk analyse av ekstrakter

Foreløpig fytokjemisk analyse av metanoliske ekstrakter av C. reticulata Blanco indikerer tilstedeværelsen av karbohydrater, aminosyrer, flavonoider, tanniner og fenoliske derivater, steroider, etc. [Tabell 1].

Tabell 1: Foreløpig fytokjemisk analyse av metanolekstrakter av Citrus reticulata Blanco-skall

FeCl3: Ferriklorid; CR HAE: Varm alkoholekstrakt av Citrus reticulata Blanco; CR CAE: Kald alkoholekstrakt av Citrus reticulata Blanco

Bestemmelse av totalt fenolinnhold

Fenolene, spesielt polyfenoler, utviser et bredt spekter av gunstige biologiske aktiviteter hos pattedyr, inkludert antivirale, antibakterielle, immunstimulerende, anti-allergiske, anti-hypertensive, anti-iskemiske, anti-arytmiske, anti-trombotiske, anti-kolesterolemitiske, anti-kolesteroliske , leverbeskyttende, anti-inflammatoriske og anti-kreftfremkallende virkninger.[21,22] Flere studier har vist at flavonoider fungerer som fjerner av superoksidanioner, singlet oksygen, hydroksylradikaler og lipidperoksylradikaler.[23,24] TPC og TFC. ble bestemt for begge ekstraktene ved bruk av standardkurver [Figur 1]. CR HAE viste høyere fenolinnhold, dvs. 187,93 ± 4,69 µg GAE/mg ekstrakt enn CR CAE, dvs. 58,66 ± 2,40 µg GAE/mg ekstrakt. TFC-er for CR HAE og CR CAE ble funnet å være nesten like, dvs. henholdsvis 171,72 ± 4,13 µg QE/mg ekstrakt og 169,88 ± 9,79 µg QE/mg ekstrakt.

Bestemmelse av totalt flavonoidinnhold

Antioksidantaktivitet bør ikke konkluderes basert på en enkeltantioksidanttestmodell. I praksis utføres flere in vitro testprosedyrer for evalueringantioksidantaktiviteter med prøvene av interesse.[25] I denne studien har vi evaluertantioksidantpotensialet til CR HAE og CR CAE av forskjelligeantioksidantanalyser inkludert DPPH-analyse for frie radikaler, superoksyd-anion-fjernende analyse, ABTS-radikalfangende analyse og oksygenradikalabsorbanskapasitet (ORAC)-analyse.

Antioksidantanalyser

1, 1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl frie radikaler rensende analyse

DPPH-analyse for frie radikaler er en av de mest brukte analysene for å teste den foreløpige radikalfjernende aktiviteten til planteekstrakter. DeantioksidantAktiviteten til planteekstrakter som inneholder polyfenolkomponenter skyldes deres evne til å donere hydrogenatomer eller elektroner og fange frie radikaler.[26] Dermed vil den lilla fargen til DPPH reduseres til , - diphenyl- picrylhydrazin (gul). Resultatene indikerer at CR HAE og CR CAE viste opptil 85 prosent av fjerning av DPPH-frie radikaler [Figur 2]. Askorbinsyre ble brukt som en positiv kontroll og viste rensende aktivitet på opptil 92 prosent. CR HAE viste litt høyereantioksidantaktivitet enn CR CAE. EC50-verdier (µg/ml) ble uttrykt i tabell 2.

Fenazin-metosulfat-NADH-systemet superoksidanion-fjerningsanalyse Selv om superoksidanion er en svak oksidant, produserer den til slutt

Tabell 2: EC-verdi for metanoliske ekstrakter av Citrus reticulata Blanco Peel for DPPH-, superoksid-, ABTS-, anti-kollagenase- og anti-elastase-analyser

kraftige og farlige hydroksylradikaler samt singlet oksygen, som begge bidrar til oksidativt stress.[27] Superoksidradikalene som genereres fra oppløst oksygen ved PMS-NADH-kobling og kan måles ved deres evne til å redusere NBT. Reduksjonen i absorbans ved 56 0 nm med planteekstraktet indikerer deres evne til å slukke superoksidradikaler i reaksjonsblandingen. CR HAE viste sterk superoksidfjernende aktivitet enn CR CAE [Figur 3]. Askorbinsyre ble brukt som en positiv kontroll og fjerner superoksidanion opp til 52 prosent. EC50-verdier (µg/ml) ble beregnet og uttrykt i tabell 2. CR HAE ble funnet å være mer effektiv (P < 0,05)="" enn="" cr="" cae="" ettersom="" den="" viste="" mindre="" ec50-verdi="" (µg/ml)="" og="">antioksidantaktivitet.

2,2'-azino-bis (3-etylbenzotiazolin-6-sulfonsyre) radikalfjerningsanalyse

ABTS-analyse er basert på fjerning av lys av ABTS-radikaler. Anantioksidantmed en evne til å donere et hydrogenatom vil slukke det stabile frie radikalet, en prosess som er assosiert med en endring i absorpsjon, som kan følges spektrofotometrisk.[28] ABTS-aktivitet ble kvantifisert i form av prosentvis hemming av ABTS frie radikalkation vedantioksidanteri hver prøve. ABTS-verdiene for CR HAE, CR CAE og gallussyre ble presentert i tabell 2. CR HAE og CR CAE viste ABTS-radikalfjernende aktivitet på konsentrasjonsavhengig måte og observert opp til 59 prosent. Gallussyre viste opp til 79 prosent av ABTS-rensende evne [Figur 4]. EC50-verdier (µg/ml) oppnådd for CR HAE og CR CAE indikerte ingen signifikant forskjell (P < 0,05)="" og="" antydet="" at="" begge="" ekstraktene="" har="" nesten="" likt="" abts-rensende="">

Oksygenradikalabsorbanskapasitetsanalyse

ORAC-analyse anses å være en mer biologisk relevant analyse enn andre målemetoderantioksidantstyrke fordi den måler hydrogen-atomoverføringsreaksjonene og simulerer in vivoantioksidanthandling.[29] Den måler også hvor godt vannløselige og lipidløselige komponenter av et naturlig stoff beskytter et standardisert mål mot oksidasjon av peroksylnitritt, hydroksylradikaler, superoksidanion og

singlet oksygen, og genererer en poengsum basert på sammenligning med enantioksidantkontroll.[30]I denne studien har vi målt ORAC-verdier for CR HAE og CR CAE og uttrykt i form av TROLOX (mmol TROLOX-ekvivalent/g substans) [Figur 5]. CR HAE viste høyere ORAC-verdi (1243 mmol TROLOX-ekvivalent/g stoff) enn CR CAE (1063 µmol TROLOX-ekvivalent/g stoff) [tabell 2].

Enzymanalyser

Anti-kollagenase-analyse

Matrisemetalloproteinaser (MMP) er en familie av proteolytiske enzymer som bryter ned ulike komponenter i ECM. Kollagenase er et av medlemmene av MMP-familiene og er ansvarlig for nedbrytningen av kollagen. Kollagenase fra bakterien C. histolyticum (ChC) (C 3.4.24.3) er en av få proteinaser som er i stand til å bryte ned den trippel-heliske regionen av naturlig kollagen under fysiologiske forhold og in vitro-betingelser ved bruk av syntetiske peptider som substrater. Beskyttende effekt av planteekstrakter mot kollagenase enzym kan studeres ved å bruke ChC og syntetisk substrat FALGPA. [31] I denne studien ble kollagenasehemmingsaktivitet evaluert for CR HAE og CR CAE. Catechin ble brukt som en positiv kontroll. Resultatene viste at CR HAE-ekstrakt var mer effektivt for å hemme kollagenase-enzymet enn CR CAE og viste hemming på opptil 76 prosent [Figur 6]. Effektiviteten ble målt i form av EC50-verdi (µg/ml) og uttrykt i tabell 2.

Anti-elastase-analyse

Elastase er det eneste enzymet som er i stand til å bryte ned elastin. Hemming av elastase-enzymet kan beholde elastisiteten og smidigheten til huden. [32] I form avanti-aldring, kan det være nyttig å finne hemmere av elastase-enzymer

for å forhindre tap av hudens elastisitet og dermed slapp hud. I anti-elastase-analysen ble bukspyttkjertel-elastase fra svin analysert spektrofotometrisk ved å bruke [N-Succ-(Ala) 3-p-nitroanilid] som substrat, og mengden p-nitroanilin ble bestemt ved å måle absorbansen ved 41{{ 6}} nm. De hemmende effektene av CR HAE og CR CAE på elastaseaktivitet ble undersøkt. Catechin ble brukt som en positiv kontroll. CR HAE viste sterk prosent elastasehemmende aktivitet sammenlignet med CR CAE og opptil 80 prosent hemming ble observert [Figur 7]. EC50-verdier (mg/ml) ble uttrykt i tabell 2 og det ble observert at CR HAE var mer potent enn CR CAE (P < 0,05).="" ec50-verdi="" oppnådd="" for="" katekin="" ble="" funnet="" å="" være="" svært="" mindre,="" noe="" som="" indikerer="" dens="" sterke="" anti-elastaseaktivitet="" og="" dens="" rolle="" som="" en="">anti-aldringkomponent. Kim et al., 2004 viste at katekin og epigallocatechin gallat isolert fra grønn te (Camellia sinensis) var potente anti-elastasehemmere.

Gasskromatografi-massespektrometrianalyse

CR HAE viste høyereantioksidantog antialdringsevner sammenlignet med CR CAE; derfor ble GC-MS-analyse av CR HAE utført for å forstå ingrediensene som er tilstede i den. Totalt 20 forskjellige forbindelser ble identifisert og presentert i tabell 3. Kromatogrammet viste 20 topper i retensjonstiden varierte fra 2,95 minutter til 44,45 minutter [Figur 8]. Den største toppen ved 44,11 minutter med 44,37 prosent areal ble identifisert som butylfosfonsyre, pentyl 4-(2-fenylprop-2-yl) fenylester. Zab et al., 2012[33] rapporterteantioksidantog antitumoraktivitet av butylfosfonsyre, pentyl-4-(2-fenylprop-2-yl)-fenylester tilstede i det etanoliske ekstraktet av C.reticulata. En annen hovedforbindelse som ble funnet var 4H-1-Benzopyran-4-4,3-4-4-on, dihydro) eller 4-kromanon (21,43 prosent areal) som er en type

flavanon. Di Majo et al., 2005[34] isolerte flavanonene fra sitrusfrukter og viste strukturavhengigeantioksidantaktivitet. Andre forbindelser 3', 4', 5, 7, 8-Pentamethoxyflavone og 4', 5, 7, 8-tetramethoxyflavone er typer polymethoxyflavone (PMF). PMF viser et bredt spekter av biologiske aktiviteter. Nylig isolerte og identifiserte Ho et al., 2012[35] hydroksylerte PMF-er fra sitrusskaller og undersøkte deres biologiske aktiviteter, inkludert anti-inflammasjon og kjemopreventive egenskaper for kreft. Andre identifiserte forbindelser inkluderer D-Limonen (1,46 prosent areal), 4H-Pyran-4-on, 2, 3-dihydro-3, 5-dihydroksy-6-metyl (1,46 prosent areal), 2-metoksy-4-vinylfenol (vinylfenol) 1,67 prosent areal), og n-heksadekansyre (2,51 prosent areal) og kan være relatert tilanti-aldringpotensialet til C. reticulata Blanco peeling. Strukturer av alle identifiserte forbindelser ble presentert i figur 9.

KONKLUSJON

C. reticulata Blanco-ekstrakter ble evaluert mot aldring av huden gjennom in vitroantioksidant, anti-kollagenase- og anti-elastase-analyser. Studien viste at metanolisk ekstrakt (Soxhlation) viste lovendeantioksidantog anti-enzymatisk aktivitet og kan brukes som en potentanti rynkeagent ianti-aldringhudpleieformuleringer.

Bekreftelse

Forfattere er takknemlige til Underwriters Lab (UL), Bangalore, India, for GC-MS-analyse og naturmidler, Bangalore, India, for ORAC-analyse.

Økonomisk støtte og sponsing

Null.

Interessekonflikter

Det er ingen interessekonflikter.