Utforskning av mekanismen til Cistanche-formelen som regulerer NLRP3-inflammator-mediert pyroptose ved behandling av kronisk prostatitt
Jun 05, 2025
Objektiv:
Denne studien hadde som mål å undersøkemekanisme som en Cistanche-basert urteformelregulerer aktiveringen avNLRP3 inflammasomog hemmerpyroptosei behandlingen avType III kronisk prostatitt (CP/CPPS).
Metoder:
(1) Dyreforsøk:
Femti SD-hannrotter ble tilfeldig fordelt i fem grupper: kontroll-, modell- og Cistanche-formelbehandlede grupper kl.lav (4,9 g/kg), middels (9,8 g/kg) og høy (19,6 g/kg)doser, med 10 rotter i hver gruppe. Bortsett fra kontrollgruppen ble alle rottene indusert medType III prostatittvia intraprostatisk injeksjon av prostataproteinekstrakt kombinert med CFA. Etter vellykket modellering fikk rottene daglig intragastrisk administrering av enten normalt saltvann (kontroll- og modellgrupper) ellerCistanche-basert formeli 30 dager.
Prostatavevbetennelse ble vurdert avHematoxylin-Eosin (HE) farging. SerumIL-1ogIL-18ble målt etterELISAmens oksidativt stressmarkører (MDA, SOD, ogGSH-Px) ble evaluert biokjemisk.NLRP3 uttrykki prostatavev ble påvist avimmunhistokjemi, ogNLRP3, Caspase-1 og GSDMD proteinnivåerble analysert ved hjelp avWestern blot.
(2) Celleeksperiment:
Menneskelige prostataepitelceller (RWPE-1)ble delt inn i kontroll, modell,Cistanche formel, ogNLRP3-hemmer (MCC950)grupper. Bortsett fra kontrollgruppen ble alle cellene stimulert medLPS (100 ng/ml, 4 timer)ogATP (5 mmol/ml, 30 min)å indusere pyroptose. Etter modellering mottok kontroll- og modellgruppen blankt serum, mensCistanche-gruppenmottatt6,25 ug/ml medikamentholdig serum. Inhibitorgruppen ble behandlet medMCC950.
PI-opptakogCaspase-1 uttrykkble vurdert viaflowcytometri. LDH utgivelseble målt biokjemisk.Supernatant IL-1 og IL-18 nivåerble kvantifisert ved ELISA.Western blotble brukt til å oppdageNLRP3, Caspase-1 og GSDMDuttrykk.
Resultater:
(1) Dyreeksperiment:
Sammenlignet med kontrollgruppen, viste modellgruppen betydelig inflammatorisk celleinfiltrasjon, epiteldegenerasjon og interstitielt ødem i prostatavev. DeCistanche-behandlede grupperviste doseavhengige reduksjoner i disse patologiske endringene.
Serum IL-1 og IL-18 nivåerble betydelig økt i modellgruppen (P<0.01) og betydelig redusert iCistanche lav-, middels- og høydosegrupper (P<0.01).
MDA-nivåervar forhøyet i modellgruppen (P<0.01) men betydelig redusert ved Cistanche-behandling (P<0.01).
SOD og GSH-Px nivåerble redusert i modellgruppen (P<0.05) og signifikant økt i alle Cistanche-behandlede grupper (P<0.01, P<0.05).
Immunhistokjemiviste forhøyetNLRP3 uttrykki modellgruppen, som ble betydelig redusert ved Cistanche-behandling.
Western blotresultatene viste økte proteinnivåer avNLRP3, Caspase-1 og GSDMDi modellgruppen (P<0.01), som alle ble betydelig hemmet av Cistanche (P<0.01).
(2) Celleeksperiment:
DePI-opptakshastighet, Caspase-1 uttrykk, ogLDH utgivelseble betydelig økt i modellgruppen (P<0.01), men betydelig redusert i bådeCistancheogMCC950grupper (P<0.01).
IL-1 og IL-18 nivåeri supernatanten var signifikant forhøyet i modellgruppen (P<0.01) og betydelig redusert iCistancheoginhibitor grupper (P<0.01).
Western blotviste signifikant økt NLRP3-, Caspase-1- og GSDMD-proteinekspresjon i modellgruppen (P<0.01), som ble betydelig nedregulert iCistancheoginhibitor grupper (P<0.01).
Konklusjon:
DeCistanche-basert urteformelutøver terapeutisk effekt påType III kronisk prostatittvedhemmer NLRP3-inflammasomaktivering, og dermed redusereCaspase-1 aktivering, forebyggendeGSDMD-spaltning og pyroptose, og undertrykkepro-inflammatorisk cytokinfrigjøring. Disse funnene tyder på detCistanchekan være lovendenaturlig urtemiddel for CP/CPPS, tilbyranti-inflammatorisk, antioksidant, ogpyroptose-hemmendeeffekter via modulering avNLRP3/Caspase-1/GSDMDsignalvei.
nøkkelord: kronisk prostatitt; Guihuang formel;NLRP3 inflammatom; pyroptose; programmert celledød
cistanche drar nytte av prostatahelse
Cistanche-basert urteformel for kronisk prostatitt: Eksperimentell studie av mekanisme og effektivitet
Kronisk prostatitt (CP)er en av de vanligste tilstandene innen urologi og menns helse. Epidemiologiske studier viser at ca8.4%av voksne menn i Kina opplever symptomer på prostatitt [1]. I følgeNational Institutes of Health (NIH)klassifisering, er prostatitt kategorisert i fire typer, medType III prostatitt (kronisk bekkensmertesyndrom, CP/CPPS)står for mer enn90%av alle kroniske tilfeller [2]. Type III prostatitt fører til bekkensmerter og urindysfunksjon og er ofte ledsaget av psykiske plager som angst og depresjon, noe som i betydelig grad svekker livskvaliteten [3–4].
I tradisjonell kinesisk medisin (TCM) tilsvarer kronisk prostatitt syndromer som "Lin Syndrome" eller "Jing Zhuo", og er først og fremst forårsaket av patogene faktorer somfuktighet, varme, blodstase og stagnasjon[5–7]. DeGuihuang formel, tradisjonelt brukt til å behandle CP/CPPS med fuktig varme og blodstase, har blitt modifisert i denne studien for å brukeCistanchesom en kjernekomponent, og danner en romanCistanche-basert urteformel. Denne modifiserte formelen tar sikte på å forbedre urinsymptomer og bekkenbetennelse med beggeklinisk effekt og sikkerhet [8–10].
Cistanche tubulosa i ørkenen
cistanche formelbaserte piller med 75 % glykosid
Støttende tjeneste fra Wecistanche-The Kontakt oss for å få en engrospris
E-post:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tlf:+86 15292862950
Bakgrunn og mekanisme
Våre tidligere studier viste at den Cistanche-baserte urteformelen betydelig lindret prostatittlignende lesjoner i rottemodeller ved å redusere patologisk betennelse og undertrykke pro-inflammatoriske cytokiner. Denne effekten er assosiert med hemming avPI3KogNF-KBsignalveier [11].
Ytterligere oppmerksomhet har blitt rettet motNLRP3 inflammasom, et multiproteinkompleks som regulerer inflammatoriske responser. Aktivering av NLRP3-inflammasomet fører til frigjøring av inflammatoriske cytokiner som IL-1 og IL-18, noe som bidrar til den inflammatoriske kaskaden i CP/CPPS [12–13]. Undersøker omCistanchekan modulere NLRP3 inflammasom aktivering er avgjørende for å forstå densanti-inflammatorisk mekanismeved behandling av kronisk prostatitt.
1. Materialer
1.1 Dyr og celler
SD-hannrotter (6 uker gamle, 240–260 g) ble hentet fra SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. [SCXK (Jing) 2019-0010], holdt i SPF-forhold med fri tilgang til mat og vann. Romtemperaturen ble holdt på (23±2) grader og luftfuktigheten på (60±5)%. Alle dyreprosedyrer ble godkjent av Animal Ethics Committee ved Xiyuan Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences (Ethics No: 2020XLC005-3). normale prostata epitelceller (RWPE-1, ATCC, katalognr. IM-H299) ble brukt for in vitro-eksperimenter ved passasje 5.
1.2 Urteformel
DeCistanche-basert formelbestår av følgende tradisjonelle urter (i gram):
Cistanche 12 g
Curcuma longa (gurkemeie) 10 g
Angelica sinensis 12 g
Magnolia officinalis 10 g
Boswellia carteri (røkelse) 5 g
Commiphora myrrha (Myrra) 5 g
Lonicera japonica (kaprifol) 15 g
Hedyotis diffusa 15 g
Plantago asiatica (Plantain Herb) 15 g
Citrus reticulata (tangerinskall) 10 g
Urtegranulene ble levert av Pharmacy Department of Xiyuan Hospital og produsert av Kangrentang Pharmaceutical Co., Ltd. (batchnr.: 19018391).
SEO nøkkelord:
Cistanche for kronisk prostatitt, urtemedisin for CPPS, TCM for bekkensmertesyndrom, Cistanche prostata betennelse, naturlige antiinflammatoriske urter for menn, Cistanche immunmodulasjon.
1.3 Reagenser og sett
BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Cat # P0010)
IL-1 og IL-18 ELISA-sett (Bioswamp, Cat# ZN2877, ZN2883)
Pyroptosis/Caspase-1 analysesett (immunokjemi, kat.nr. 9145)
NLRP3-antistoff (Novus, Kat.nr. NBP2-12446)
CFA (Complete Freund's Adjuvans, Sigma, Cat# C104202)
Vanlige reagenser: Xylen, absolutt etanol, nøytral gummi (Sinopharm)
Oksidativt stresssett: SOD, MDA, GSH-Px, LDH (Nanjing Jiancheng, Cat# A001-3, A003-2, BC1190, 20121225)
Antistoffer: Anti-GSDMD, Caspase-1, GAPDH (Abcam, Cat# ab219800, ab179515, ab8245)
MCC950 (NLRP3-hemmer, Selleck, Cat# S8930)
PYCARD/ASC-antistoff (Thermo, Kat.nr. PA5-95826)
1.4 Instrumenter
Optisk mikroskop (Nikon Eclipse Ti-SR, Japan)
Mikrotom (Leica RM2016, Shanghai)
Digital lysbildeskanner (3D HISTECH Pannoramic MIDI, Ungarn)
Høyhastighets kjølt sentrifuge (Thermo Fisher IECCL31R, USA)
Elektroforeseutstyr (CAVOY PP-1150, MP-8001, MP-3030, Beijing)
Shaker inkubator (Qilinbeier TS-2000A, Jiangsu)
Kryogen kvern (Jingxin JXFSTPRP-CL-BSC, Shanghai)
CO₂-inkubator (Sanyo MCO-20AIC, Japan)
Mikroplateleser (Bio-Rad DNM-9602, Beijing)
Biokjemisk analysator (Rayto Chemray 800, Shenzhen)
Flowcytometer (Beckman CytoFLEX S, USA)
2. Metoder
2.1 Modelletablering
(1) Dyremodell
Basert på tidligere modelleringserfaring, en rottemodell av autoimmunType III kronisk prostatittble etablert avintraprostatisk injeksjonav renset prostataproteinekstrakt blandet med komplett Freunds adjuvans (CFA) [14]. Vellykket modellering ble bestemt av patologiske trekk, inkludert: fortykkelse av prostatakapselen, forsvinning av kjertelfolder, ødeleggelse av acini, betydelig stromalt ødem, uskarp struktur, massiv infiltrasjon av lymfocytter, monocytter og plasmaceller. Glatte muskelceller og bindevevshyperplasi ble observert i prostatasepta, med merkbarvaskulær utvidelse og overbelastning. Biokjemisk ble modellen bekreftet avøkte leukocytterogreduserte lecitinlegemeri prostata homogenat.
(2) Cellemodell
Etter litteraturrapporter og tidligere forhåndseksperimenter [15–17], ato-trinns stimuleringsmetodeble brukt til å aktivereNLRP3 inflammasomi RWPE-1 celler. Trinn 1: Celler ble behandlet medLPS (100 ng/ml)i 4 timer for å starte inflammasompriming. Trinn 2: Celler ble deretter behandlet medATP (5 mmol/ml)i 30 minutter som aktiveringssignal. De optimale modellforholdene ble screenet ved hjelp avPI-opptakshastighetsom en markør.
2.2 Gruppering
(1) Dyrestudiegrupper
Rotter ble tilfeldig delt inn ifem grupperved å bruke en tilfeldig talltabell:
Kontrollgruppe
Modellgruppe
Cistanche formel lavdose gruppe
Cistanche formel middels dose gruppe
Cistanche formel høydose gruppe
Hver gruppe besto av 10 rotter. Alle gruppene unntatt kontrollgruppen ble utsatt for modellering. Detilsvarende human doseav den Cistanche-baserte formelen ble beregnet som 109 ÷ 70 × 6.3=9.8 g/kg formiddels dose, medlav doseved 4,9 g/kg oghøy doseved 19,6 g/kg [11]. Fradag 3 etter modellering, mottok behandlingsgruppene daglig intragastrisk administrering av de respektive dosene avCistanche-basert urteformeltil30 dager på rad, mens kontroll- og modellgruppene fikk like store mengder saltvann.
(2) Cellestudiegrupper
RWPE-1 celler ble delt inn i fire grupper:
Kontrollgruppe: dyrket med blankt serum
Modellgruppe: behandlet med LPS (100 ng/ml, 4 timer) og ATP (5 mmol/ml, 30 min)
Cistanche-gruppen: behandlet med6,25 ug/ml Cistanche formel medisinert serum
MCC950-gruppen: modell +NLRP3 inflammasomhemmer MCC950
2.3 Prøvesamling
Etter 30 dagers behandling ble rottene bedøvet med isofluran. Blod ble samlet fra abdominal aorta og sentrifugert ved 3000 rpm i 10 minutter for å isolere serum, som ble lagret ved -80 grader iELISAog biokjemiske analyser.
Venstre prostatalapp: fiksert i 4 % paraformaldehyd for histopatologi, immunhistokjemi og immunfluorescens.
Høyre prostatalapp: bevart iflytende nitrogentilWestern blot-analyse.
2.4 Dyreindeksdeteksjon
2.4.1 HE-farging
Hematoxylin og Eosin (HE) farging ble brukt for å observere inflammatorisk infiltrasjon i prostatavev. Morfologiske endringer i kjertler, kanaler og interstitielle strukturer ble evaluert under et lysmikroskop.
2.4.2 ELISA for IL-1 og IL-18
ELISA-sett ble brukt til å kvantifisereIL-1ogIL-18nivåer i rotteserum. Prøver ble behandlet etter standard ELISA-protokoll og analysert kl450 nmved hjelp av en mikroplateleser.
2.4.3 Biokjemisk påvisning av MDA, SOD, GSH-Px
Serumnivåer avMDA, SOD, ogGSH-Pxble målt ved bruk av kommersielle sett for å vurdere oksidativt stress i prostatavev.
2.4.4 Immunhistokjemi (IHC) for NLRP3
Prostatavevssnitt gjennomgikk avparafinisering, antigeninnhenting, blokkering og inkubasjon medanti-NLRP3 antistoff (1:1000). DAB-farging ble utført og motfarget med hematoksylin. NLRP3-ekspresjon ble observert mikroskopisk.
2.4.5 Immunfluorescens for GSDMD
Frosne prostatasnitt ble inkubert medanti-GSDMD antistoff (1:100), etterfulgt av fluorescerende sekundært antistoff og DAPI nukleær motfarging. GSDMD-uttrykk ble visualisert ved bruk av fluorescensmikroskopi.
2.4.6 Western Blot for NLRP3, Caspase-1, GSDMD
Protein ble ekstrahert fra prostatavev forWestern blot-analyse. Uttrykksnivåer avNLRP3 (1:1000), GSDMD (1:2000), ogCaspase-1 (1:2000)ble oppdaget. -aktin fungerte som internkontroll. Kvantifisering ble utført vhaImageJprogramvare.
2.5 Cellular Index Detection
2.5.1 Flowcytometri for PI-opptak
Celler ble vasket, resuspendert ved 1 x 106 celler/ml og farget med propidiumjodid (PI). PI-opptakshastigheter ble analysert ved hjelp avflowcytometriogFlowJoprogramvare.
2.5.2 LDH-frigjøringsanalyse
Etter behandling,LDHnivåer i kultursupernatanter ble vurdert som en markør for cellemembranskade ved bruk av en kolorimetrisk analyse kl.490 nm.
2.5.3 Flowcytometri for Caspase-1
Celler ble fiksert, permeabilisert og farget medCaspase-1 antistoff (1:1000). Uttrykket ble målt vedflowcytometri.
2.5.4 ELISA for IL-1 og IL-18 i supernatant
Kulturmedier ble samlet for å oppdageIL-1ogIL-18nivåer via ELISA. Proteininnhold i cellelysater ble kvantifisert ved å bruke BCA-analysen for å normalisere cytokinnivåer.
2.5.5 Western Blot for NLRP3, Caspase-1, GSDMD
Western blot ble utført på cellelysater med antistoffer motNLRP3 (1:1000), GSDMD (1:2000), ogCaspase-1 (1:2000). Deteksjon ble utført ved bruk av ECL og bildesystemer. -aktin ble brukt som belastningskontroll.
2.6 Statistisk analyse
Data ble analysert vhaGraphPad Prism 8.0. Resultater er uttrykt somgjennomsnitt ± SD. Gruppesammenlikninger ble gjort ved hjelp avuavhengige t-testerellerEnveis ANOVA. A P-verdi < 0,05ble ansett som statistisk signifikant.
