Ekstraviralt DNA i adeno-assosierte virale vektorpreparater induserer TLR9-avhengige medfødte immunresponser i humane plasmacytoide dendrittiske celler

Adeno-assosierte virale (AAV) vektorsuspensjoner produsert i enten humant avledede HEK-celler eller i Spodoptera frugiperda (Sf9) insektceller er forskjellige når det gjelder gjenværende vertscellekomponenter så vel som artsspesifikke post-translasjonelle modifikasjoner vist på AAV-kapsidproteinene . Her analyserte vi virkningen av disse forskjellene på de immunogene egenskapene til vektoren. Vi stimulerte humane plasmacytoide dendrittiske celler med forskjellige partier av HEK-celleproduserte og Sf9-celleproduserte AAVCMV-eGFP-vektorer avledet fra forskjellige produsenter. Vi fant at AAV8-CMV-eGFP så vel som AAV2-CMV-eGFP vektorer induserte partispesifikke, men ikke produksjonsplattformspesifikke eller produsentspesifikke inflammatoriske cytokinresponser. Disse kan reduseres eller oppheves ved å blokkere tolllignende reseptor 9-signalering eller ved å enzymatisk redusere DNA i vektorpartiene ved å bruke DNase. Vellykket HEK-celletransduksjon med DNase-behandlede AAV-partier og DNA-analyser viste at DNase ikke påvirket vektorens integritet, men degraderte ekstraviralt DNA. Vi konkluderer med at både HEK- og Sf9-celleavledede AAV-preparater kan inneholde immunogene ekstravirale DNA-komponenter som kan utløse partispesifikke inflammatoriske immunresponser. Dette antyder at forbedrede strategier for å fjerne ekstravirale DNA-urenheter kan være medvirkende til å redusere de immunogene egenskapene til AAV-vektorpreparater.

cistanche tubulosa-forbedre immunsystemet

Det siste tiåret har vært vitne til en enorm interesse for utvikling av nye rekombinant adenoassosiert virus (AAV)-baserte strategier for både grunnleggende forskning og kliniske anvendelser1–3. Hovedårsaken ligger i det faktum at AAV-vektorer har vært ekstremt allsidige verktøy innen genterapi, gitt deres evne til effektivt og trygt å levere terapeutiske gener til målvev4. Imidlertid rapporterer et økende antall etterforskere uavhengig funn som tyder på lokale og systemiske immunresponser etter levering av AAV i prekliniske og kliniske studier5–8.

AAV-vektorer har vist seg å aktivere medfødte immunmønstergjenkjenningsreseptorer som tolllignende reseptor (TLR)2 og TLR9, noe som resulterer i frigjøring av inflammatoriske cytokiner og type I interferoner (IFN)9,10. Immunogene komponenter av AAV som kan stimulere disse responsene inkluderer kapsidproteiner og vektorgenom9,10. Immunresponser etter AAV-påføring kan også utløses av urenheter i vektorsuspensjonen5,11. Disse urenhetene er blitt definert som en hvilken som helst komponent som er tilstede i den rensede AAV-vektorsuspensjonen bortsett fra det ønskede produktet12 og er et resultat av produksjonsprosessen av vektoren. To av hovedmetodene for å produsere kliniske rekombinante AAV-vektorer involverer transfeksjon av plasmid-DNA til HEK-celler og infeksjon av Spodoptera frugiperda (Sf9) insektceller med bacoluvirus13. Følgelig kan potensielt immunogene urenheter inneholdt i AAV-vektorsuspensjoner inkludere endotoksiner, cellekulturmediekomponenter, reagenser som brukes til AAV-rensing, proteiner og DNA avledet fra vertsceller, og gjenværende bakuloviralt DNA eller plasmid DNA5. Ytterligere faktorer som kan påvirke immunogenisiteten til AAV-vektorsuspensjoner er post-translasjonelle modifikasjoner (PTM-er) påtrykt kapsiden av de forskjellige vektorproduksjonsplattformene5. Viktigere er at HEK-celleavledede og Sf9-celleavledede AAV-vektorer skiller seg sterkt med hensyn til deres PTM-er, deres gjenværende vertscelleproteinurenheter11, og potensielt også i deres DNA-urenheter (HEK-celle-DNA vs. Sf9-celle-DNA så vel som gjenværende plasmid-DNA) vs. bakuloviralt DNA)14. Plasmacytoide dendrittiske celler (pCDs) er en spesialisert medfødt immuncelletype som skiller ut store mengder type I IFN og pro-inflammatoriske cytokiner ved virusinfeksjoner9,15 og spiller en viktig rolle i sensing av AAV-vektorer9. Følgelig, for å analysere om forskjellene mellom HEK-celleproduserte og Sf9-celleproduserte AAV-vektorer resulterer i forskjeller i deres immunogene egenskaper, stimulerte vi humane pDCer med forskjellige partier av den samme AAV-vektoren hentet fra de to produksjonssystemene og forskjellige produsenter. Vi fant at halvparten av de undersøkte vektorpartiene fremkalte partispesifikke pro-inflammatoriske immunresponser som verken var relatert til vektorproduksjonssystemet eller produsenten. Disse responsene ble mediert av TLR9-signalering og følsomme for behandling av vektorpartiene med DNase. Vellykket HEK-celletransduksjon av både ubehandlede og DNase-behandlede AAV-vektorpartier og DNA-analyser av AAV-preparater antydet at DNase ikke påvirket AAV-partikkelintegriteten, men snarere målrettet ikke-innkapslet ekstraviralt DNA. Samlet antyder dette at AAV-vektorpreparater kan inneholde ikke-innkapslet ekstraviralt DNA som kan påvirke de immunogene egenskapene til AAV-vektorpreparater i humane pDCer.

Fordeler med cistanche tubulosa-styrke immunsystemet

Resultater

AAV induserer partispesifikke medfødte immunresponser i humane pDCer.

Studier har vist at HEK-celleavledede og Sf9-celleavledede, AAV-vektorer er forskjellige når det gjelder PTM-er og urenheter inneholdt i virussuspensjonene11. Vi antok at disse faktorene kunne resultere i forskjeller i de immunogene egenskapene mellom HEK-celle- og Sf9-celleavledede vektorpartier. For å teste denne hypotesen analyserte vi totalt åtte AAV serotype 8 (AAV8) vektorpartier som inneholdt den identiske DNA-sekvensen til cytomegaloviruspromoter (CMV) og det identiske transgenet for det forbedrede grønne fluorescensproteinet (eGFP) (AAV8- CMV-eGFP; fem HEK- og tre Sf9-celleavledede loter) og fire AAV2-CMV-eGFP-partier (to HEK- og to Sf9-celleavledede partier) fra tre forskjellige produsenter [produsent A; Viral Vector Core Facility ved University of Iowa (Iowa, USA), produsent B; Virovek (CA, USA) og produsenten C; Vigene Biosciences (MD, USA)]. For å maksimere likheter mellom partiene ble de syv AAV8-partiene fra produsent A og produsent B (tabell 1) produsert ved bruk av det samme originale plasmidet. I tillegg ble en dråpedigital PCR (ddPCR) registrering av vektorgenomene (vg) til AAV-vektorpartiene utført i en side-ved-side-måling ved bruk av to forskjellige mål: en innenfor CMV-sekvensen og den andre innenfor eGFP-sekvensen til vektorene. Resultater oppnådd ved kvantifisering av CMV-målet ble brukt for titrering av AAV-vektor-lotene i de følgende eksperimentene (tabell 1). pDC-er er spesialiserte virale sensorer som massivt produserer type I IFN-er ved virusinfeksjon15, inkludert AAV-vektorer9. For å undersøke om HEK-celleproduserte og Sf9-celleproduserte AAV-vektorer er forskjellige i deres evne til å fremkalle medfødte immunresponser i immunkompetente celler, stimulerte vi humane pDC-er med AAV-vektorpartiene ovenfor. For dette formål ble pDC-er renset fra mononukleære celler fra perifert blod (PBMC-er) fra individuelle friske menneskelige donorer ved negativ seleksjon ved bruk av magnetisk aktivert cellesortering (MACS). Flowcytometrianalyse bekreftet renheten til de isolerte pDCene på over 90% (fig. S1). Ti pDC-er fra en individuell donor ble sådd og stimulert med AAV8- og AAV2-vektorpartier ved en MOI på 1:1 × 106 vg/celle i 18 timer. MOI på 1:106 vg/celle påført totalt 12.500 celler i 50 ul/brønn oversettes til en titer på 2,5 × 1011 vg/ml. Vi brukte denne titeren fordi den er innenfor rekkevidden av det som brukes i retinale genterapistudier hos mennesker (f.eks. 1 × 1012 vg/ml16 eller 4 × 1011–1,3 × 1012 vg/ml17) og ikke-menneskelige primater (f.eks. 5 × 1011–5 × 1012 vg/ml6). Stimulering med kjøretøyet fungerte som kontroll. Inkubasjon med AAV8- og AAV2-vektorpartier resulterte ikke i noe detekterbart transgenekspresjon i pDC-er. Imidlertid fire av de åtte AAV8-partiene (partiene A-HEK-1, A-HEK-2, A-HEK-3, A-Sf9-1) og to av fire AAV2-partier (partier B-Sf9-1, B-Sf9-2) induserte reaktiv celleproliferasjon i de stimulerte pDC-ene (fig. 1a). Dette ble ledsaget av en frigjøring av pro-inflammatoriske cytokiner (IP-10, MIP-1 og TNF-) og type I IFN (IFN-). Omvendt ble verken celleproliferasjon eller cytokinfrigjøring indusert av den gjenværende AAV8 (partiene A-Sf9-1, B-HEK-1, B-Sf9-1, C-HEK{{92} }) og AAV2-partier (partier C-HEK-1, C-HEK-2). Disse resultatene ble bekreftet i tre til fire uavhengige eksperimenter hver utført med cellene til en individuell donor (fig. 1a-c og tabell S1). Lotspesifikke forskjeller i cytokinkonsentrasjonene i disse uavhengige eksperimentene ble statistisk analysert ved bruk av en lineær blandet effektmodell og post hoc Dunnetts test (Q=2.6) ved å sammenligne minstekvadratmiddelverdiene for de forskjellige AAV-vektorpartiene med kjøretøykontrollen (tabell S2 og S3). Dette viste statistisk signifikante forskjeller i cytokinresponsene mellom "immunogene" AAV-vektorlots (AAV8-partier A-HEK-1, A-HEK-2, A-HEK-3, A-Sf{ {114}}, eller AAV2-lot B-Sf9-1, B-Sf9-2 henholdsvis) og kontroll, men ingen signifikante forskjeller mellom "ikke-immunogene" AAV-vektorlots (AAV8-lot A-Sf{{ 123}}, B-HEK-1, B-Sf9-1, C-HEK-1 eller AAV2 partier C-HEK-1, C-HEK-2 henholdsvis) og kontroll (tabell S3). Konsentrasjonene av resten av de målte cytokinene inkludert i multipleksanalysen var enten under analyseområdet (dvs. IL-1, IL-2, IL-4, IL-5 , IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, GM-CSF, IFN-) eller verken de "immunogene" eller de "ikke-immunogene" vektorpartiene induserte noen signifikante økninger i deres frigjøring (dvs. IL-7, IL-8, G-CSF, MCP-1) (fig. S2), noe som tyder på en grad av spesifisitet i den AAV-medierte cytokinresponsen. For å undersøke cytokinresponser på et tidligere tidspunkt, ble pDC-er stimulert med den "immunogene" AAV8-vektoren A-HEK-1. Vi observerte en signifikant økning i konsentrasjonen av TNF- i supernatanten allerede 2 timer etter pDC-stimulering. Dette responsmønsteret kunne bekreftes i tre eksperimenter, hver utført med cellene til en individuell donor (fig. S3). For å undersøke om en høyere dose av en "ikke-immunogen" AAV8-vektorlot var i stand til å utløse en immunrespons, stimulerte vi pDCer med den teknisk maksimale anvendelige MOI (1:4,61 × 106 vg). Interessant nok ble verken reaktiv celleproliferasjon eller cytokinresponser oppdaget ved stimulering med denne økte titeren (fig. S4). I motsetning til vår hypotese, viser disse resultatene at medfødte immunresponser mot AAV i pDC-er var partispesifikke og ikke relatert til et spesifikt produksjonssystem eller produsent/rensemetode.

Tabell 1. Ulike partier av AAV8- og AAV2-virale vektorer brukt i denne studien.

Figur 1. Induksjon av AAV-vektor lot-spesifikke immunresponser i humane pDCer. Menneskelige pDC-er ble stimulert med forskjellige mengder AAV8-CMV-eGFP og AAV2-CMV-eGFP (MOI: 1:1× 106 vg) i 18 timer (a) Representative lyse feltbilder av pDC-er stimulert med kjøretøykontroll (øvre bilde) eller et immunogent AAV-vektorparti (nedre bilde). Målestokken er 100 μm. (b) Cytokinfrigjøring av IP-10, MIP-1, TNF- og IFN- 2 av AAV8-stimulerte pDCer. (C) Cytokinfrigjøring av AAV2-stimulerte pDCer. Representative plott av ett av tre til fire uavhengige eksperimenter. Siden i IFN- 2-målingene (b,c) og TNF-måling (c) falt noen verdier under analyseområdet, ble konstanten 1 lagt til alle målte IFN- 2- og TNF-verdier for presentasjon i et semi-logaritmisk plot. Vist er medianer og interkvartilområder. I etikettene til de individuelle vektorpartiene er de tre produsentene representert med bokstavene A, B og C; HEK-celleavledede og Sf9-celleavledede vektorer er indikert med "HEK og "Sf9" og tilsvarende partier fra samme produsent og samme produksjonssystem er nummerert "1, 2, 3". Sirkel: HEK-avledet vektorparti; trekant: Sf9-avledet vektorparti; svart: vektorparti fra produsent A; oransje: vektorparti fra produsent B; grønt: vektorparti fra produsent C.

Immunresponsen på AAV-stimulering i pDC-er påvirkes ikke av forskjeller i kapsid/VG-forhold.

Prekliniske studier har vist at forskjeller i antall fulle og tomme vektorpartikler i AAV vektorsuspensjoner kan påvirke en immunrespons18. For å vurdere om forskjellene i immunogene egenskaper mellom de analyserte vektorpartiene skyldtes forskjeller i forholdet mellom fulle og tomme vektorpartikler, bestemte vi titeren av vektorkapsider i alle AAV-lotene ved AAV-titrerings-ELISA og beregnet kapsid/VG forhold. Interessant nok ble det funnet store forskjeller i kapsid/vg-forholdet mellom alle AAV-lotene (fig. 2). Omtrent to ganger flere kapsider enn vg (2:1) ble funnet i AAV8-CMV-eGFP-partiene A-HEK-1, A-HEK-3, A-Sf{{11} } og AAV2-CMV-eGFP B-Sf9-1; og fire ganger mer (4:1) i AAV8 parti A-Sf9-1. Et forhold på 1:1 ble observert i resten av partiene. Imidlertid ble det ikke funnet noen signifikante forskjeller mellom kapsid/vg-forhold mellom "immunogene" og "ikke-immunogene" AAV-vektorlots i AAV8 (P=0.27) og heller ikke i AAV2 (P=0.37) vektorpartier (fig. 2). Dette antyder at forskjellene i de immunogene egenskapene til de analyserte AAV-vektorpartiene heller ikke var relatert til forskjeller i forholdet mellom fulle og tomme vektorpartikler.

cistanche supplement fordeler-hvordan styrke immunforsvaret

Gjenkjennelse av "immunogene" AAV8-vektorlots av TLR9.

Det har blitt vist at den medfødte immungjenkjenningen av AAV av murine og humane pDCer er mediert av DNA-sensing TLR99. Følgelig evaluerte vi om TLR9 også var involvert i gjenkjennelsen av våre "immunogene" AAV8-vektorpartier. For dette formål ble pDC-er sådd som beskrevet og dyrket med TLR9-antagonisten H154 (50 µM) etterfulgt av stimulering med de "immunogene" AAV8-vektorpartiene A-HEK-1, A-HEK-2, A -HEK-3 og A-Sf9-1 (MOI: 1:1× 106 vg). Etter 18 timer ble ingen bevis for celleproliferasjon observert (fig. 3a), og en signifikant reduksjon i frigjøring av IP-10, MIP-1, TNF- og IFN- ble målt (fig. 3b). Dette indikerer at immunresponser på "immunogene" AAV8-vektorpartier i humane pDC-er er mediert av TLR9-signalering.

Figur 2. Sammenligning av kapsid/vg-forhold mellom forskjellige AAV8-CMV-eGFP og AAV2-CMV-eGFP vektorlots. Kapsid/vg-forholdene stammer fra absorbansmålinger (ELISA) og ddPCR-resultater av (a) åtte AAV8-vektorlot og (b) fire AAV2-vektorlot. Stiplede linjer skiller "immunogene" fra "ikke-immunogene" AAV-vektorpartier. Søyler indikerer gjennomsnitt og standardavvik for replikater. Statistisk signifikans ble bestemt ved å bruke uparet Student t-test.

Figur 3. Gjenkjenning av "immunogene" AAV8-CMV-eGFP vektorpartier av pDCer er TLR9-avhengig. Humane pDCer ble behandlet med TLR9-antagonisten H154 (50 μM) etterfulgt av stimulering med "immunogene" AAV8-vektorlots (MOI: 1:1×106 vg) i 18 timer. (a) Representative lyse feltbilder av rensede pDC-er behandlet med "immunogene" AAV-vektorpartier (øvre bilde) eller "immunogene" AAV-vektorpartier og H154 (nedre bilde). Skalaen er 100 μm. (b) Cytokinfrigjøring av IP-10, MIP-1, TNF- og IFN- 2 av stimulerte pDCer. Siden noen verdier i IFN- 2-målingene falt under analyseområdet, ble konstanten 1 lagt til alle målte IFN- 2-verdier for presentasjon i et semi-logaritmisk plot. Vist er middelverdier og standardavvik. Statistisk signifikans ble bestemt ved bruk av enveis ANOVA og Holm-Sidaks post hoc analyse. P-verdier: Mindre enn eller lik 0,05: *; Mindre enn eller lik 0,01: **; Mindre enn eller lik 0,001: ***.

DNase-behandling reduserer immunresponsen til "immunogene" AAV8- og AAV2-vektorlots.

Mens "immunogene" AAV8-vektorer fremkalte en TLR9-avhengig immunrespons i pDC-er, ble ingen slike responser indusert av de "ikke-immunogene" partiene. TLR9 aktiveres som respons på DNA, spesielt DNA som inneholder umetylerte CpG-motiver9. Viktigere, våre ddPCR-målinger bekreftet at de samme virale DNA-komponentene var til stede i både "immunogene" og "ikke-immunogene" vektorpartier. Samlet antydet dette at upakket/fritt DNA i den virale suspensjonen i stedet for det intra-virale DNA kan være årsaken til de observerte immunresponsene på "immunogene" AAV-vektor-partier. Derfor, hvis gjenværende fritt DNA var tilstede i den virale suspensjonen av de "immunogene" AAV8 vektorpartiene, bør den medfødte immunresponsen svekkes av DNase. For å teste denne hypotesen ble "immunogene" AAV8- og AAV2-vektorpartier forbehandlet med DNase I (100 µg/ml) i 30 minutter før AAV-stimulering. For å utelukke ikke-spesifikke effekter av DNase-behandling på pDC-ene eller AAV-partiklene, i AAV-bare stimuleringer, ble vektorene utsatt for DNasemok-behandling før pDC-stimulering. I disse falske behandlingene uten DNase ble AAV-partiklene inkubert ved 37 grader i et identisk DNase-fordøyelsesmedium i samme tidsperiode som de DNase-behandlede AAV-ene. Ti pDC-er ble sådd og stimulert med DNase-forbehandlede eller falske "immunogene" AAV-vektor-partier (MOI: 1:1 × 106 vg). pDCer som ble inkubert med kun DNase eller sham-behandlet med en bærer tjente som kontroller. Interessant nok reduserte DNase-behandling av de "immunogene" AAV8- og AAV2-vektorpartiene reaktiv celleproliferasjon (fig. 4a) og ble enten fullstendig avskaffet (AAV8-partier A-HEK-2 og A-Sf9-1; AAV2-partier B-Sf9-1 og B-Sf9-2) eller betydelig redusert (AAV8-partier A-HEK-1 og A-HEK-3) utgivelsen av IP{{40} }, MIP-1, TNF- og IFN- etter AAV-stimulering (fig. 4b,c). For å bekrefte at den observerte DNase-effekten faktisk var forårsaket av fordøyelsen av ekstraviralt DNA og ikke av en effekt av DNase på vektorens integritet, undersøkte vi om DNase-behandling av AAV-vektorpartier påvirket transduksjonskapasiteten til AAV. Siden AAV-applikasjonen ikke resulterte i noen påvisbar pDC-transduksjon, ble HEK-celler brukt til disse assayene da HEK-celler er en velkjent cellemodell for å analysere transduksjonseffektivitet ved AAV-transduksjon19. Vi stimulerte HEK293T-celler med DNase-behandlede og sham-behandlede AAV8- og AAV2-vektorlots (MOI: 1:8 × 104 vg) og evaluerte transduksjonseffektiviteten ved fluorescensmikroskopi 3 dager etter vektorpåføring. Som beskrevet viste AAV2-vektorer en høyere transduksjonsstyrke sammenlignet med AAV8-vektorer. Viktigere, dessuten, reduserte forbehandling med DNase verken transduksjonseffektiviteten i de HEK-avledede eller i Sf9--celleavledede AAV8- og AAV2-vektorlotene (fig. S5a,b). Disse resultatene gir ytterligere bevis på at DNase-effekten på de immunogene egenskapene til vektorpartiene skyldes nedbrytningen av det ekstravirale DNA. Selv om TLR9-antagonisten H154 i hovedsak opphevet frigjøringen av pro-inflammatoriske cytokiner for alle de fire immunogene AAV8-partiene (fig. 3), kunne DNase-forbehandling også eliminere den pro-inflammatoriske cytokinresponsen for AAV8-partiene A-HEK{{75} } og A-Sf9-1, mens den ikke fjernet den helt for AAV8-partiene A-HEK-1 og A-HEK-3 (fig. 4). For å teste om en økt DNase-behandlingstid kunne oppheve denne cytokinresponsen, gjentok vi simuleringseksperimentene med pDC etter en tidoblet økning i DNase-inkubasjonstid for de respektive partiene (A-HEK-1 og A-HEK{{87} }). Vi observerte at etter DNase-behandling av vektorene i 5 timer, sank de gjennomsnittlige cytokinkonsentrasjonene i supernatanten til de AAV-stimulerte cellene ytterligere og var ikke lenger signifikant forskjellig fra vehikelkontrollen. Dette responsmønsteret kunne bekreftes i tre eksperimenter, hver utført med cellene til en individuell donor (fig. S6). Dette antyder at den sentrale årsaken til den TLR9-avhengige pro-inflammatoriske immunresponsen i pDC-er faktisk er ekstraviralt DNA. For å teste om frigjøring av intraviralt DNA øker den immunstimulerende aktiviteten til AAV-vektorer, åpnet vi bevisst de virale kapsidene til den "immunogene" AAV8-partiet A-HEK-1 ved varmebehandling ved 95 grader i 10 minutter . Det varmebehandlede vektorpartiet ble deretter brukt til å stimulere pDCer. Selv om det ikke var noen forskjeller i den reaktive celleproliferasjonen ved AAV8 lot A-HEK-1 stimulering med og uten varmebehandling, var det en signifikant økning i frigjøringen av IP-10, MIP-1 , TNF- og IFN- i den varmebehandlede tilstanden, noe som indikerer at frigjøring av innkapslet viralt DNA i vektorsuspensjonen kan bidra til induksjon av immunresponser (fig. 5). Sammen indikerer disse dataene at AAV-vektorpreparater kan inneholde ekstravirale DNA-forurensninger som kan utløse lotspesifikke immunresponser i pDCer. Disse responsene formidles av TLR9-signalering og kan reduseres/oppheves ved behandling av vektorpartiene med DNase.

Figur 4. DNase-forbehandling reduserer immunresponser indusert av "immunogene" AAV8-CMV-eGFP og AAV2-CMV-eGFP vektorlots. Humane pDC-er ble stimulert med DNase-behandlede "immunogene" AAV8-vektorlotter i 18 timer (MOI: 1:1 × 106 vg). (a) Representative lyse feltbilder av rensede pDC-er stimulert med "immunogene" AAV-vektorpartier (øvre bilde) og "immunogene" AAV-vektorpartier forhåndsbehandlet med 1{{30}}0 ug/ml DNase I (nedre bilde). Målestokken er 500 μm. (b) Cytokinfrigjøring av IP-10, MIP-1, TNF- og IFN- 2 av AAV8-stimulerte pDCer. (c) Cytokinfrigjøring av AAV2-stimulerte pDCer. Siden i IFN- 2-målingene (b og c) og TNF-måling (b), falt noen verdier under analyseområdet, ble konstanten 1 lagt til alle målte IFN- 2- og TNF-verdier for presentasjon i et semi-logaritmisk plot. Vist er middelverdier og standardavvik. Statistisk signifikans ble bestemt ved å bruke enveis ANOVA og Holm–Sidaks post hoc-analyse. P-verdier: Mindre enn eller lik 0,05: *; Mindre enn eller lik 0,01: **; Mindre enn eller lik 0,001: ***.

Utforskende analyse av ekstravirale DNA-forurensninger i AAV8 vektorpreparater.

For å utføre den første utforskende karakteriseringen av de ekstravirale DNA-komponentene i AAV-vektor-lotene, en representativ "immunogen" (A-HEK-1) og "ikke-immunogen" (B-HEK-1) HEK-celleavledet vektorparti ble analysert. Disse partiene ble enten DNase-behandlet i pDC-medium i 30 minutter ved 37 grader som beskrevet ovenfor, eller ble mock-behandlet og ultrafiltrert ved bruk av en 100 kDa cut-of-filtreringsenhet, eller ble bare mock-behandlet (fig. S7a– g). Påfølgende Bioanalyzer LabChip-separasjon og vurdering av renset DNA avslørte tilstedeværelsen av sammenlignbare mengder vektor-DNA (fig. S7b–g) i behandlede og falske-behandlede prøver av hvert parti, noe som bekreftet at verken ultrafiltrering eller DNase-behandling påvirket DNA-innholdet inne i kapsiden. I tillegg viste den at bare det "immunogene" (fig. S7a–d), men ikke det "ikke-immunogene" vektorpartiet (fig. S7a,e–g) inneholdt ytterligere DNA-molekyler i størrelse fra 100 til 450 bp (fig. S7a, e–g) S7c,d og h). Viktigere, disse ekstra DNA-molekylene kunne påvises i den mock-behandlede prøven og den ultrafiltrerte prøven, men var praktisk talt fraværende i den DNase-behandlede prøven (fig. S7a-d). Dette indikerer at disse DNA-molekylene representerer ekstravirale DNA-forurensninger som kan brytes ned av DNase, men som ikke kan fjernes fra vektorsuspensjonen ved ultrafiltrering. Finansieringen av at disse forurensningene bare kunne påvises i den "immunogene" men ikke i den "ikke-immunogene" vektorpartiet beviser at forekomsten av disse ekstravirale DNA-molekylene er partispesifikke og kan i tillegg tyde på at disse molekylene induserer eller bidrar til de immunstimulerende egenskapene til vektoren. For å vurdere den potensielle kilden til det forurensende DNA i den "immunogene" (A-HEK-1) og "ikke-immunogene" (B-HEK-1) masse kvantitativ (q)PCR-analyse av HEK celle-DNA, plasmid-DNA og AAV vektor-DNA ble utført. Template-DNA fra DNase-behandlet, mock-behandlet og ultrafiltrert og kun mock-behandlede prøver av hvert parti ble brukt for amplifikasjon av Alu-repetisjon, kjernegenom multikopi NPIP-gen og mitokondrielle 16S rRNA-gensekvenser (mt16S) av HEK-celleopprinnelse , for amplifisering av et AAV8 invertert terminal gjentatt amplikon (ITR2; vektor- og transgenplasmid-DNA-opprinnelse), og for amplifikasjon av et amplikon for blah-genet (ampicillinresistens) (Amp; plasmid-DNA-opprinnelse) (tabell S4). Sammenligning av forholdene mellom ΔCt-verdiene til HEK-celle-DNA-spesifikt amplikon vs ITR2-amplikon (dvs. Alu vs. ITR2, NPIP vs. ITR2 og mt16S vs. ITR2) og plasmid-DNA-spesifikke amplikon kontra ITR2-amplikon (Amp) vs. ITR2), henholdsvis indikerer at de to partiene inneholder ubetydelige mengder HEK-cellekjerne- og mitokondrie-DNA. Derimot avslørte analysen en anstendig mengde plasmid-DNA i både det "immunogene" og det "ikke-immunogene" vektorpartiet (henholdsvis ca. 1/32 og 1/50, når det gjelder kopiantall i forhold til AAV-DNA). en andel som er godt innenfor rekkevidden av verdier rapportert for andre AAV vektorer12 (fig. S7). Ikke desto mindre var det ingen åpenbare forskjeller i den relative andelen av vektor-DNA til plasmid- og HEK-celle-DNA mellom de DNase-behandlede og mock-behandlede eller ultrafiltrerte og mock-behandlede prøvene av begge vektorpartiene (fig. S8). Dette kan tyde på at det ikke-pakkede forurensnings-DNAet i målsekvenssammensetning ligner det til det pakkede DNAet. En begrensning ved qPCR-analysen er imidlertid størrelsen på det forurensende DNA (100–450 bp) som vil inneholde en anstendig brøkdel av fragmenter med ufullstendig målsekvens.

Figur 5. Frigjøring av intraviralt DNA ved varmebehandling av vektorer forsterker pro-inflammatoriske cytokinresponser i pDCer. Cytokinfrigjøring av IP-10, MIP-1, TNF- og IFN- 2 av pDCer 18 timer etter stimulering med varmebehandlet AAV8-lot A-HEK-1 (MOI: 1:1× 106 vg). Horisontale linjer angir middelverdier og standardavvik. Statistisk signifikante forskjeller mellom cytokinresponser indusert av varmebehandlede og ubehandlede vektorer ble bestemt ved å bruke Student t-testen. P-verdi: Mindre enn eller lik 0.01: **; Mindre enn eller lik 0,001: ***.

Diskusjon

AAV-vektorer er et av de mest lovende verktøyene innen genterapi. Akkumulering av bevis utfordrer imidlertid synet om at immunogenisiteten til AAV er ubetydelig5. I lys av dette har det blitt stadig viktigere å bedre forstå mekanismene som immunresponser mot AAV oppstår. I denne studien demonstrerer vi at (1) AAV8 og AAV2 induserer partispesifikke medfødte immunresponser i humane pDCer som verken er spesifikke for kapsid/vg-forholdet eller produksjonsplattformen eller produsent/rensemetoden; (2) medfødte immunresponser i pDC er avhengig av TLR9-signalering og kan reduseres ved forbehandling med DNase; (3) DNase-behandling påvirker ikke integriteten til vektorpartikkelen ettersom den ikke reduserer transduksjonshastigheten til AAV8- og AAV2-vektorpartier i HEK293T-celler; og (4) AAV vektorpartier kan omfatte ekstravirale DNA-molekyler som kan fjernes ved behandling av vektorpartiet med DNase. Dette antyder at både HEK- og Sf9-celleavledede AAV-preparater kan inneholde ekstravirale DNA-urenheter som stimulerer en medfødt immunrespons. I en fersk studie ble det utført en sammenlignende analyse ved bruk av AAV-vektorer fra forskjellige vertscellearter (HEK-celler og Sf9-celler)11. Forfatterne fant at HEK- og Sf9--avledede vektorer er forskjellige når det gjelder PTM-er og gjenværende vertscelleproteinurenheter på tvers av alle AAV-serotyper og produsenter de testet. Videre analyserte de cytokinresponsen til primære humane fibroblaster på AAV-transduksjon og fant at HEK- og Sf9--avledede vektorer kan variere i deres immunogene egenskaper. I vår studie sammenlignet vi også disse to hovedproduksjonssystemene ved å bruke forskjellige partier av samme AAV-konstruksjon fra forskjellige produsenter og to forskjellige serotyper. Imidlertid var de vektorinduserte immunresponsene vi observerte i vår humane pDC-modell ikke spesifikt relatert til et gitt produksjonssystem, produsent eller serotype, i stedet var de partispesifikke. Tidligere prekliniske og kliniske studier av retinal genterapi har rapportert at immunresponser mot AAV-vektorer, som okulær betennelse eller immuncelleinfiltrasjon, kan påvirkes av forskjeller i kapsid/vg-forhold18 eller doseforskjeller5. Timmers et al.18 viste at fjerning av tomme AAV-kapsider fra virussuspensjonen reduserte inflammasjon og forbedret viral transduksjon i en pre-klinisk studie med ikke-menneskelige primater. Likevel viste resultatene våre at forhøyede kapsid/vg-forhold var til stede blant både "immunogene" og "ikke-immunogene" AAV-vektorlots, noe som betyr at et høyere antall kapsider (tomme kapsider) i virussuspensjonen ikke var ansvarlig for induksjon av de vektorlotspesifikke immunresponsene i vår humane pDC-modell. Foruten det har vi tidligere vist at AAV8 induserer immunresponser på en doseavhengig måte hos ikke-menneskelige primater6,8. Å øke dosen av de "ikke-immunogene" AAV-vektorene i denne studien var imidlertid ikke tilstrekkelig til å utløse en immunrespons i humane pDCer. Derfor, for å forstå årsaken til forskjellene i de immunogene egenskapene til vektorene, undersøkte vi mekanismen involvert i gjenkjennelsen av de "immunogene" AAV-partiene. Bruken av in vitro immunkompetente cellemodeller har gjort det mulig for forskere å mer nøyaktig studere rollen til TLR-veier i medfødte immunresponser generert av AAV-vektorer9,10. Zhu et al.9frst beskrev at pDC-er, men ikke konvensjonelle DC-er eller ikke-pDC-er, frigjør store mengder type I IFN og pro-inflammatoriske cytokiner som respons på AAV-stimulering og demonstrerte involvering av TLR9-banen i gjenkjennelsen av AAV8 og AAV2 ved å bruke muse-pDCer. Forfatterne observerte også at AAV2 induserte TLR9-avhengige immunresponser i humane pDCer. I vår studie, med bruk av en av de mest spesifikke TLR9-antagonistene, H1549,21–24, har vi indirekte vist at ikke bare AAV2, men også AAV8-vektorer induserer TLR9-avhengige medfødte immunresponser i humane pDCer, men på en mye spesifikk måte. Ettersom TLR9 er en DNA-reseptor, antydet dette at immunresponsene på "immunogene" AAV-vektorpartier ble indusert av DNA-komponenter. Selv om ddPCR-målingene våre hadde bekreftet at de samme pakkede DNA-komponentene var tilstede i både "immunogene" og "ikke-immunogene" vektorpartier, utløste ikke de "ikke-immunogene" partiene immunresponser i pDCs. I tillegg reduserte eller opphevet DNase-behandling enten de immunstimulerende egenskapene til de "immunogene" AAV-vektorpartiene, men reduserte ikke transduksjonsstyrken til disse vektorene i HEK-celler, noe som tyder på at DNase-behandling av AAV målrettet ikke-innkapslet ekstraviralt DNA i vektorsuspensjon, men påvirket ikke integriteten til vektorgenomet i det intakte kapsidet. Dette ble ytterligere bekreftet ved sammenlignende DNA-analyser av representative DNase-behandlede og falske-behandlede "immunogene" og "ikke-immunogene" vektorpartier.

cistanche tubulosa-forbedre immunsystemet

Klikk her for å se Cistanche Enhance Immunity-produkter

【Be om mer】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Samlet indikerer alle disse eksperimentene at immunresponsen til "immunogene" vektorpartier i pDC-er ikke ble orkestrert av DNA inneholdt i AAV-partiklene (dvs. vektorgenom eller potensielle DNA-urenheter pakket i AAV-kapsidene), men av tilgjengelig ekstraviralt DNA komponenter inneholdt i virussuspensjonene (dvs. DNA utenfor eller ubeskyttet av viruskapsiden). Vi observerte også at når DNA inneholdt i de virale kapsidene til et "immunogent" vektorparti ble eksponert for cellene ved varmebehandling av vektoren, var det en økning i immunresponsen. Det er ikke klart om økningen i immunstimulerende aktivitet etter åpning av kapsidene skyldtes vektorens enkelttrådede DNA eller på grunn av potensielle urenheter pakket i AAV-kapsidene som gjenværende vertscellenukleinsyrer, gjenværende hjelpe-DNA-sekvenser, ryggradssekvens. fragmenter pakket sammen med kassetten eller omvendt priming fra ITR-er som resulterer i små ryggradsfragmenter pakket inn i AAV12,25. Den nøyaktige mekanismen for ekstraviralt DNA-opptak av pDCer er fortsatt ukjent. Responsen til pDC-er overfor CpG-oligonukleotider viser at pDC-er kan reagere på fritt DNA26. Dette antyder at immunresponsen i pDC-er kan utløses av opptak av fritt kontaminerende DNA inneholdt i vektorsuspensjonen. I tillegg har det blitt vist at pDC-er kan ta opp AAV-vektorer27 alternativt antyder at potensielt kapsidbundet DNA kan transporteres inn i cellen under opptak av AAV-partikler. Tilstedeværelsen av ekstraviral DNA-kontaminering i AAV-vektorpreparater kan enten være en iboende egenskap til det respektive vektorpartiet som følge av produksjons- og renseprosessen av vektorene, eller det kan skyldes frigjøring av innkapslet DNA på grunn av upassende lagringsforhold . Alle vektorpartiene som ble undersøkt i disse eksperimentene ble oppnådd i løpet av samme tidsperiode (5 av de 8 AAV8-vektorpartiene som ble undersøkt, hvorav to var "immunogene" (A-HEK-2; A-HEK-3) og tre var "ikke-immunogene" (A-Sf9-2; B-Sf9-1; B-Sf9-2) ble til og med produsert parallelt spesielt for denne studien), partiene fra hver produsent ble sendt i de samme transportboksene, og ved mottak ble alle lotene lagret side ved side i samme skuff i en temperaturalarmbeskyttet −80 graders fryser før alikvoter av alle lotene ble tint samtidig og påført pDCene i side ved side eksperimenter. Dette tyder sterkt på at AAV-produksjons- og renseprosessen, snarere enn upassende lagring, var ansvarlig for forskjellene i ekstraviralt DNA-innhold og immunstimulerende egenskaper til disse partiene. Tidligere var AAV-vektorpartier av klinisk kvalitet produsert for genterapi (alipogen tiparvovec, Glybera) ikke lenger autorisert på grunn av høye mengder urenheter inkludert potensielt immunogen gjenværende vertscelle DNA28. Fjerning av DNA-urenheter fra virussuspensjonene utføres vanligvis under produksjonsprosessen. Her påføres Benzonase29- eller DNase30-behandling rutinemessig for å eliminere gjenværende DNA fra den endelige virale suspensjonen. Denne behandlingen, avhengig av protokollen, varer mellom 30 minutter og 3 timer, og deretter inaktiveres enzymet av kjemikalier som cesiumkloridsalter30. I våre eksperimenter ble fire av de fem AAV8-partiene avledet fra Viral Vector Core Facility ved University of Iowa, og begge AAV2-vektorpartiene fra Virovek funnet å være immunogene i pDCs. Som beskrevet i "Materialer og metoder"-delen, involverer renseprosessen til vektorpartiene fra begge disse produsentene flere rensetrinn, hvorav noen avviker sterkt fra hverandre. Dermed inkluderer renseprosessen ved Core Facility i Iowa turbonukleasebehandling, etterfulgt av iodixanol gradient ultrasentrifugering, anionbytter kolonnekromatografi, flutter sterilisering og bufferutveksling ved bruk av sentrifugalfiltre. I motsetning til dette bruker Virovek Benzonase-behandling, ultrasentrifugering i CsCl etterfulgt av avsalting og filtersterilisering. Renseprosessen til Vigene, på den annen side, omfatter ikke DNase-behandling, men, som brukes av Core Facility i Iowa, inkluderer iodixanol gradient ultrasentrifugering. Overraskende nok induserte imidlertid ingen av de tre vektorpartiene avledet fra Vigene (AAV8: C-HEK-1; AAV2: C-HEK-1 og 2) immunresponser i pDCer, noe som tyder på at "ikke-immunogene " vektorpartier kan også genereres med produksjonsprosesser som ikke involverer DNase-behandling.

cistanche supplement fordeler-hvordan styrke immunforsvaret

Samlet sett gjør de delvis like og delvis forskjellige rensetrinnene som brukes av de tre produsentene det vanskelig å koble de immunogene egenskapene til vektorene observert i pDC til et enkelt trinn i produksjonsprosessen. Kliniske studier bruker vektorer av god produksjonspraksis (GMP) som er gjenstand for strenge kvalitetskontroller. Ingen av vektorene fra de tre produsentene som er brukt i denne studien er god laboratoriepraksis (GLP)-grad og kan derfor være av lavere renhet enn klinisk-grade vektorer. Derfor er det viktig å erkjenne at GMP-vektorer brukt i kliniske studier på mennesker kan eller ikke kan vise forskjellene vi observerte i denne studien, og at relevansen av funnene våre for klinisk bruk av genterapi ikke er klar. Imidlertid kan, etter vår egen erfaring, betydelige partispesifikke forskjeller i konsentrasjonen av forurensende komponenter som vertscelleproteiner forekomme selv med GMP-grade vektorer, og selv i GMP-grad vektorer er det ingen enhetlig avtalte spesifikasjoner for hvilke nivåer som er akseptabelt 5. Samlet sett er forbedring av produksjonsprosessen av AAV-vektorer nøkkelen til å unngå tilstedeværelsen av gjenværende urenheter i virussuspensjonene for å minimere potensialet for utilsiktede immunresponser. Avslutningsvis demonstrerte vi at ekstravirale DNA-urenheter kan påvirke de immunogene egenskapene til AAV-vektorer i humane pDCer. Ytterligere studier er nødvendig for å undersøke implikasjonene av disse funnene for sikkerheten til AAV-mediert genterapi i dyremodeller eller menneskelige pasienter.

Referanser

1. Gaj, T., Epstein, BE & Schafer, DV Genomteknikk ved bruk av Adeno-assosiert virus: Grunnleggende og kliniske forskningsapplikasjoner. Mol. Ter. 24, 458–464 (2016).

2. Garita-Hernandez, M. et al. AAV-mediert genlevering til 3D retinale organoider avledet fra menneskeinduserte pluripotente stamceller. Int. J. Mol. Sci. 21, 994 (2020).

3. Russell, S. et al. Effekt og sikkerhet av voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) hos pasienter med RPE65-mediert arvelig retinal dystrofi: En randomisert, kontrollert, åpen fase 3-studie. Lancet 390, 849–860 (2017).

4. He, X., Urip, BA, Zhang, Z., Ngan, CC & Feng, B. Utvikler AAV-leverte terapier mot ultimate kurer. J. Mol. Med. 99, 1–25. https://doi.org/10.1007/s00109-020-02034-2 (2021).

5. Bucher, K., Rodríguez-Bocanegra, E., Dauletbekov, D. & Fischer, MD Immunresponser på retinal genterapi ved bruk av adeno-assosierte virale vektorer—Implikasjoner for behandlingssuksess og sikkerhet. Prog. Retin. Eye Res. 83, 100915 (2020).

6. Reichel, FF et al. AAV8 kan indusere medfødte og adaptive immunresponser i primatøyet. Mol. Ter. 25, 2648–2660 (2017).

7. Boyd, RF et al. Redusert retinal transduksjon og forbedret transgen-rettet immunogenisitet med intravitreal levering av rAAV etter posterior vitrektomi hos hunder. Gene Ter. 23, 548–556 (2016).

8. Rodríguez-Bocanegra, E. et al. Longitudinell evaluering av hyperrefektive foci i netthinnen etter subretinal levering av adeno-assosiert virus hos ikke-menneskelige primater. Overs. Vis. Sci. Teknol. 10, 15 (2021).

9. Zhu, J., Huang, X. & Yang, Y. Te TLR9-MyD88-veien er kritisk for adaptive immunresponser på adenoassosierte virusgenterapivektorer hos mus. J. Clin. Undersøk. 119, 2388–2398 (2009).

10. Hösel, M. et al. Toll-lignende reseptor 2-mediert medfødt immunrespons i humane ikke-parenkymale leverceller mot adeno-assosierte virale vektorer. Hepatology 55, 287–297 (2012).

11. Rumachik, NG et al. Metoder betyr noe: Standard produksjonsplattformer for rekombinant AAV produserer kjemisk og funksjonelt distinkte vektorer. Mol. Ter. Metoder Clin. Dev. 18, 98–118 (2020).

12. Wright, JF Produktrelaterte urenheter i rekombinante AAV-vektorer av klinisk kvalitet: Karakterisering og risikovurdering. Biomedicines 2, 80–97 (2014).

13. Clément, N. & Grieger, JC Produksjon av rekombinante adeno-assosierte virale vektorer for kliniske studier. Mol. Ter. Metoder Clin. Dev. 3, 16002 (2016).

14. Penaud-Budloo, M., François, A., Clément, N. & Ayuso, E. Farmakologi av rekombinant adeno-assosiert virusproduksjon. Mol. Ter. Metoder Clin. Dev. 8, 166–180 (2018).

15. Ye, Y., Gaugler, B., Mohty, M. & Malard, F. Plasmacytoid dendritisk cellebiologi og dens rolle i immunmedierte sykdommer. Clin. Overs. Immunol. 9, e1139 (2020).

16. Fischer, MD et al. Effekt og sikkerhet av retinal genterapi ved bruk av adeno-assosiert virusvektor for pasienter med choroideremi: En randomisert klinisk studie. JAMA Oftalmol. 137, 1247–1254 (2019).

17. Weleber, RG et al. Resultater 2 år etter genterapi for RPE65-defekt Leber medfødt amaurose og alvorlig retinal dystrofi i tidlig barndom. Oftalmology 123, 1606–1620 (2016).

18. Timmers, AM et al. Okulær inflammatorisk respons på intravitreal injeksjon av adeno-assosiert virusvektor: Relativt bidrag av genom og kapsid. Nynne. Gene Ter. 31, 80–89 (2020).

19. Ran, G. et al. Stedrettet mutagenese forbedrer transduksjonseffektiviteten til kapsidbibliotek-avledede rekombinante AAV-vektorer. Mol. Ter. Metoder Clin. Dev. 17, 545–555 (2020).

20. Ellis, BL et al. En undersøkelse av ex vivo/in vitro transduksjonseffektivitet av primære pattedyrceller og cellelinjer med ni naturlige adeno-assosierte virus (AAV1-9) og en konstruert adeno-assosiert virusserotype. Virol. J. 10, 1–10 (2013).

21. Yamada, H. et al. Effekt av undertrykkende DNA på CpG-indusert immunaktivering. J. Immunol. 169, 5590–5594 (2002).

22. Zhang, P. et al. Toll-lignende reseptor 9-antagonist undertrykker humoral immunitet i eksperimentell autoimmun myasthenia gravis. Mol. Immunol. 94, 200–208 (2018).

23. Chan, YK et al. Konstruere adeno-assosierte virale vektorer for å unngå medfødte immun- og inflammatoriske responser. Sci. Overs. Med. 13, eabd3438 (2021).

24. Bayik, D., Gursel, I. & Klinman, DM Struktur, mekanisme og terapeutisk nytte av immunsuppressive oligonukleotider. Pharmacol. Res. 105, 216–225 (2016).

25. Brimble, MA et al. 547. AAV-preparater inneholder kontaminering fra DNA-sekvenser i produksjonsplasmider direkte utenfor ITR-ene. Mol. Ter. 24, S218–S219 (2016).

26. Latz, E. et al. TLR9-signaler etter translokering fra ER til CpG DNA i lysosomet. Nat. Immunol. 5, 190–198 (2004).

27. Veron, P. et al. Store undergrupper av humane dendrittiske celler transduseres effektivt av selvkomplementære adeno-assosierte virusvektorer 1 og 2. J. Virol. 81, 5385–5394 (2007).

28. Vurderingsrapport: Glybera. https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/glybera-epar-public-assessment report_en.pdf. Åpnet 3. mars 2022 (2012)

29. Arden, E. & Metzger, J. Billig, serotype-uavhengig protokoll for naturlig og biokonstruert rekombinant adeno-assosiert virusrensing. J. Biol. Metoder 3, e38 (2016).

30. Grieger, JC, Choi, VW & Samulski, RJ Produksjon og karakterisering av adeno-assosierte virale vektorer. Nat. Protoc. 1, 1412–1428 (2006).

31. Kimura, T. et al. Produksjon av adenoassosierte virusvektorer for in vitro og in vivo applikasjoner. Sci. Rep. 9, 13601 (2019).

32. Ayuso, E. et al. Høy AAV-vektorrenhet resulterer i serotype- og vevsuavhengig forbedring av transduksjonseffektiviteten. Gene Ter. 17, 503–510 (2010).