Ekstracellulær acidose begrenser ett-karbonmetabolisme og bevarer T-cellestammen

Akkumuleringen av sure metabolske avfallsprodukter i tumormikromiljøet hemmer effektorfunksjonene til tumoroppblåsende lymfocytter (TIL). Det er imidlertid fortsatt uklart hvordan et surt miljø påvirker T-cellemetabolisme og differensiering. Her viser vi at langvarig eksponering for syre omprogrammerer T-celle intracellulær metabolisme og mitokondriell kondisjon og bevarer T-cellestammen. Mekanistisk svekker forhøyet ekstracellulær acidose metioninopptak og metabolisme via nedregulering av SLC7A5, og endrer derfor H3K27me3-avsetningen ved promotorene til nøkkelgener for T-celler. Disse endringene fremmer opprettholdelsen av en "stammelignende hukommelse"-tilstand og forbedrer langsiktig in vivo-utholdenhet og anti-tumor-effekt hos mus. Funnene våre avslører ikke bare en uventet evne til ekstracellulær acidose for å opprettholde de stammelignende egenskapene til T-celler, men fremmer også vår forståelse av hvordan metioninmetabolisme påvirker T-cellestammen.

cistanche planteøkende immunsystem

Klikk her for å se Cistanche Enhance Immunity-produkter

【Be om mer】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Adoptiv overføring av tumorantigenspesifikke T-celler representerer et stort fremskritt innen kreftbehandlingsfeltet, ettersom det har ført til fullstendig regresjon av visse maligniteter. Dens terapeutiske effekt avhenger i stor grad av utholdenhet og differensieringsstatus til de overførte T-cellene1,2. Mindre differensierte minne T-celler er den foretrukne populasjonen for adoptiv T-celleoverføring (ACT) på grunn av deres stamcellelignende egenskaper med selvfornyelse og multipotens3,4. Faktisk har bruk av stamlignende minne-T-celler for ACT vist seg å oppnå overlegne antitumorresponser5. Sammenlignet med terminalt differensierte effektor-T-celler, viser stamlignende T-celler distinkte kjennetegn6. Både menneskelige og muse stamliknende T-celler er karakterisert ved deres ekspresjon av antigen-erfarne og homing-assosierte molekyler, inkludert høye nivåer av CD62L og CCR7 (ref. 7). Vår forståelse av transkripsjonsprofilene, epigenetiske modifikasjoner og metabolske veier som regulerer stamlignende T-celler har utviklet seg dramatisk de siste årene8–10. Flere transkripsjonsfaktorer, som TCF1, KLF2 og LEF1, har blitt rapportert å spille essensielle roller i å drive eller opprettholde T-cellestammen9. Spesielt er TCF1 nøkkeltranskripsjonsfaktoren som fremmer genereringen av langlivede minne T-celler11. Under kroniske infeksjoner opprettholder en liten del av TCF1+ stamlignende T-celler T-celleresponser mot sekundær infeksjon1,12. Epigenetiske endringer gir et middel for T-celler til både å initiere de transkripsjonelle endringene som ligger til grunn for tilegnelsen av minnecellekarakteristikker og opprettholde disse transkripsjonelle uttrykksmønstrene13. Flere studier har vist at trimetylering av histon H3 ved K4 (H3K4me3), en aktiveringsassosiert modifikasjon, oppnås ved minneassosierte genloki, inkludert TCF7, KLF2, LEF1, CCR7 og SELL, under differensieringen av naiv CD{{47 }} T-celler inn i minne-T-celler, mens trimetylering av H3 ved K27 (H3K27me3), en undertrykkende modifikasjon, går tapt på disse loci13–15. Omvendt demonstrerer effektorassosierte gener (GZMB, PRF1, IFNG og TBX21) reduserte repressive og økte aktiverende epigenetiske modifikasjoner på disse lokiene i effektor-T-celler13,16. Til slutt tyder akkumulerende bevis på at metabolske kretsløp dikterer skjebnebeslutninger for T-celler og former deres epigenetiske og funksjonelle tilstander17. Kortlivede effektor-T-celler er svært glykolytiske og avhengige av ett-karbonmetabolisme18,19, mens stamlignende minne-T-celler viser distinkte metabolske profiler preget av økt fettsyreoksidasjon (FAO) og mitokondriell reserverespirasjonskapasitet (SRC), kardinal egenskaper involvert i langsiktig utholdenhet20–22. Derfor er metabolsk omprogrammering viktig for effektiv tilegnelse av stamness og langsiktig overlevelse av T-celler.

cistanche fordeler for menn styrker immunforsvaret

Det immunsuppressive tumormikromiljøet (TME), preget av lav pH, hypoksi, glukosedeprivasjon og melkesyreanrikning, er nøkkelbarrieren som hindrer riktig T-celleekspansjon, differensiering og funksjonalitet23,24. Faktisk, metabolsk stress påført av TME svekker mitokondriell kapasitet og kondisjon, og utløser intratumoral T-celle metabolsk insuffisiens og dysfunksjon25–28. Spennende nok er de fleste tumorinfiltrerende lymfocytter (TIL) dysfunksjonelle, men en liten fraksjon har stammelignende hukommelse eller forløperegenskaper7,29. Denne stammelignende TIL-undergruppen bevarer spredningspotensial og utholdenhet og er assosiert med en gunstig respons på immunkontrollpunktblokkade (ICB) og TIL-ACT hos personer med kreft11,30. Tidligere studier har vist at forhøyet ekstracellulær acidose (↑[H+]) undertrykte den cytolytiske aktiviteten til T-celler både in vitro og in vivo31–33. I tillegg har den sure TME en betydelig innflytelse på aktiviteten og differensieringen av tumorinfiltrerende myeloidceller, slik som dendritiske celler (DC) og tumorassosierte makrofager (TAMs) 34–36. Imidlertid er virkningen av ↑[H+] på T-cellestammen og metabolsk kondisjon stort sett ukjent. Her rapporterer vi at langvarig in vitro ↑[H+] eksponering letter differensieringen av menneskelige og muse stamliknende CD8+ T-celler på bekostning av terminal effektor CD8+ T-celler. Vi fant at langvarig ↑[H+]-behandling remodellerer T-cellemetabolismen og opprettholder mitokondriell respirasjonskapasitet. Videre svekker vedvarende ↑[H+]-eksponering metioninopptak og metabolisme, noe som senere resulterer i redusert H3K27me3-avsetning av hukommelsesrelaterte gener, og derved letter opprettholdelsen av en 'stammelignende hukommelse'-status. Til slutt viser adoptiv overføring av T-celler dyrket under ↑[H+]-betingelser kraftig antitumoraktivitet in vivo, i tråd med deres mindre utmattede fenotype. Dermed avslører studien vår den uventede rollen til ekstracellulær acidose i å bevare T-cellestammen via ombygging av cellulær metabolisme og epigenetiske mønstre.

Resultater

↑[H+ ]-eksponering fremmer CD8+ T-cellestamme

For å bestemme om ekstracellulært ↑[H+] påvirker stamlignende T-celledifferensiering, utførte vi flowcytometrisk analyse av nøkkelstilklignende fenotyper på humane T-celler dyrket i 12 dager i et av kontrollmediene, ↑[H+] media som inneholder 10 mM melkesyre (etterligner laktatkonsentrasjonen i patofysiologiske situasjoner23,35) eller surt medium (~pH 6,6, med saltsyre) (Fig. 1a). En høyere andel stamlignende CD8+ T-celler, inkludert tidlig hukommelse (CD45RO− CD27+) og sentralminne (CD45RO+ CD27+), ble sett i T-celler betinget i ↑ [H+] versus kontrollmedium (utvidet data fig. la). I tillegg fant vi at T-celler dyrket i ↑[H+]-medium hadde en høyere prosentandel stamlignende celler (CCR7+ CD62L+) (fig. 1b). Det er verdt å merke seg at vi la merke til en markant økt TCF1-ekspresjon, nøkkelfaktoren som driver stamlignende og sentral hukommelsesdifferensiering, på proteinnivå i både humane og muse CD8+ T-celler eksponert for ↑[H+] (fig. 1c og Utvidede data Fig. 1b). I tillegg var det en [H+]-konsentrasjonsavhengig effekt på CCR7- og TCF1-ekspresjon (utvidet data fig. 1c). I samsvar med den stilklignende fenotypen til ↑[H+]-kondisjonerte T-celler, ble produksjonen av intracellulær interferon- (IFN- ) og tumornekrosefaktor (TNF- ) signifikant redusert i disse cellene (fig. 1d).

For å undersøke T-celledifferensieringsstatusen bedre, utførte vi RNA-sekvenseringsanalyse (RNA-seq) og fant at langvarig in vitro ↑[H+] eksponering resulterte i en distinkt transkripsjonsprofil (Utvidet data Fig. 1d). Eksponering for ↑[H+] førte til bemerkelsesverdig redusert ekspresjon av gener som koder for effektormolekyler, slik som PRF1, GZMB og IFNG, og den ko-inhiberende reseptoren BTLA (fig. 1e,f og utvidede data, fig. 1e). Derimot viste ↑[H+]-dyrkede T-celler høyere ekspresjon av BACH2, CCR7, LEF1 og TCF7, som korrelerer med T-celles stamhet (fig. 1e,f og utvidede data, fig. 1e). Gensett-anrikningsanalyse (GSEA) viste at transkripsjonsmønsteret indusert av ↑[H+]-eksponering var lik det for minne-T-celler (fig. 1g og utvidede data, fig. 1f). Videre bekreftet kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR)-analyse økt mRNA-ekspresjon av BACH2, KLF2, LEF1 og TCF7 etter ↑[H+]-behandling (fig. 1h). Samlet støtter disse observasjonene det faktum at ↑[H+]-behandling i stor grad former transkripsjonsprofilene til T-celler for å etablere stamness. Bemerkelsesverdig fant vi at ↑[H+]-behandling hemmet T-celleproliferasjon og skjev cellesyklusfordelingen mot G1-fasen og bort fra S-fasen (tilleggsfigur 1a–c). Vi undersøkte deretter T-celleaktivering ved ↑[H+]-behandling under TCR-stimulering og fant at ↑[H+]-eksponering ikke har noen signifikant effekt på uttrykket av T-celleaktiveringsmarkører eller cellestørrelse (tilleggsfigur 2a,b). I tillegg bekreftet vi videre at ↑[H+] eksponering etter T-celleaktivering fortsatt kunne indusere en stamlignende tilstand av T-celler (tilleggsfigur 2c–f). Disse funnene utelukker muligheten for at T-celler eksponert for ↑[H+] ganske enkelt er motstandsdyktige mot stimulering, i motsetning til å adoptere en stammelignende tilstand.

cistanche tubulosa-forbedre immunsystemet

Tidligere rapporter har vist at det sure miljøet akutt hemmer den cytolytiske aktiviteten til T-celler både in vitro og in vivo23,31. Vi fant også at kortvarig ↑[H+]-eksponering svekket produksjonen av cytokiner, men hadde liten innvirkning på den stilklignende fenotypen i T-celler (Utvidede data Fig. 1g-i og Supplerende Fig. 3a-c). Videre er de hemmende effektene av cytokinproduksjon ved ↑[H+] eksponering forbigående og reversible fordi fjerning av ↑[H+] raskt gjenoppretter cytokinproduksjonen av T-celler (utvidet data fig. 1h). Således er hemming av T-celle-effektorfunksjonen av det sure miljøet veldig rask, mens omprogrammering av T-celle-stamhet krever langvarig ↑[H+]-eksponering. Fordi laktat er tilstede i løsning enten i sin udissosierte form (melkesyre) eller som et ionesalt (natriumlaktat), forsøkte vi deretter å finne ut om natriumlaktat viste lignende effekter på T-cellestammen og fant ut at natriumlaktat også fremmet stamhetssignaturer, selv om dens effektivitet var mye lavere enn for melkesyrebehandling (10 mM) (Utvidede data Fig. 1j,k og Supplerende Fig. 4a–f). Disse funnene antyder både viktigheten av ↑[H+] og dens forskjell fra behandling med laktation, i induksjonen av den stilklignende fenotypen til CD8+ T-celler.

Fig. 1|↑[H+ ] eksponering letter differensieringen av stamlignende CD8+ T-celler. a Skjematisk av aktivering av humane T-celler under de angitte forholdene: pH 7,4 (–↑[H+], kontroll), pH 6,6 (+↑[H+], saltsyre), eller 10 mM melkesyre (+↑[H+ ]). PBMC-er, mononukleære celler fra perifert blod. b, Representative CCR7 og CD62L ekspresjonsprofiler i humane CD8+ T-celler under forskjellige forhold på dag 12. n=3 uavhengige prøver. c, Representative histogrammer og kvantifisering av TCF1-ekspresjon i humane CD8+ T-celler under forskjellige forhold på dag 12. n=3 uavhengige prøver. MFI, gjennomsnittlig fluorescensintensitet. d, humane T-celler ble utvidet som i a i 12 dager og stimulert med forbol 12-myristat 13-acetat (PMA) inneholdende brefeldin A (BFA) i 4,5 timer. Den intracellulære ekspresjonsprofilen til IFN- og TNF- er avbildet for T-celler i tilstanden pH 7,4 (venstre), 10 mM melkesyre (midt) eller pH 6,6 (høyre). n=3 uavhengige prøver. e,f, RNA-seq-analyse av humane T-celler som ble utvidet i kontroll (pH 7,4) eller melkesyre (10 mM). Varmekart over utvalgte gener (e) og vulkanplott av alle gener der gener assosiert med hukommelse, effektor og utmattede T-celler ble merket (f). I vulkanplottet representerer x-aksen de log2-transformerte foldendringsverdiene (FC) for celler behandlet med melkesyre i forhold til kontroller på dag 12, og y-aksen representerer de justerte P-verdiene. n=4 uavhengige prøver. g, GSEA-plott som sammenligner kontroll med melkesyrekondisjonerte T-celler for effektor versus minneberikelse. NES, normalisert berikelsespoeng. h, Kvantitativ mRNA-ekspresjon av transkripsjonsfaktorer assosiert med T-celle-stamhet (BACH2, KLF2, LEF1, TCF7) i T-celler under de angitte forholdene. n=3 uavhengige prøver. Data presenteres som gjennomsnitt ± sem Statistiske analyser ble bestemt ved uparet tosidet Students t-test (b–d,h). Nominelle P-verdier og falske oppdagelsesrater (FDR) ble beregnet med standardmetoden til GSEA-programvaren (g).

Forhøyet [H+ ] utløser metabolsk omprogrammering

Utover de distinkte transkripsjonsprogrammene, får stamlignende T-celler også fortrinnsvis unike metabolske egenskaper, inkludert forhøyet FAO og begrenset glykolytisk metabolisme17,20,37. For å utforske de metabolske egenskapene til langsiktige in vitro ↑[H+]-eksponerte T-celler, utførte vi Gene Ontology (GO) anrikningsanalyse og fant betydelige forskjeller i uttrykket av gener relatert til metabolske veier, som småmolekylers metabolisme og glykolyse (fig. 2a). Faktisk viste langsiktige ↑[H+]-kondisjonerte T-celler redusert glykolyse og aminosyremetabolisme i motsetning til økt langkjedet fettsyremetabolisme (utvidet data fig. 2a,b). I motsetning til langvarig ↑[H+]-eksponering, hemmet kortvarig ↑[H+]-behandling kun glykolyse, men hadde ingen signifikant effekt på FAO (Supplerende Fig. 5a). Kvantitativ PCR-analyse bekreftet videre at glykolysegenene SLC2A1, SLC2A3 og LDHA ble signifikant redusert i ↑[H+]-eksponerte T-celler (Utvidede data Fig. 2c). Omvendt fremmet ↑[H+]-kondisjonering ekspresjonen av karnitinpalmitoyltransferase 1 (kodet av CPT1A), et hastighetsbegrensende enzym involvert i FAO (utvidet data fig. 2c). For ytterligere å belyse de metabolske endringene indusert av ↑[H+], utførte vi en objektiv metabolomikkanalyse og fant 285 distinkte mellomprodukter i T-celler dyrket med ↑[H+] versus kontroller (Utvidede data Fig. 2d). Spesielt reduserte eksponering for ↑[H+] de glykolytiske mellomproduktene og visse essensielle aminosyrer betydelig i stedet for å øke flere karnitinarter, den aktiverte formen av fettsyrer som overføres til mitokondrier for oksidasjon (Utvidede data Fig. 2e–g). Metabolsk fluksanalyse ved bruk av [13C6]glukose eller [13C16]palmitat viste at ↑[H+]-eksponering drastisk hindret [13C6]glukose-inkorporering i TCA-mellomprodukter og melkesyre, samtidig som det fremmet [13C16]palmitat-inkorporering i acetyl-CoA og notion, og støttet at ekstracellulær acidose undertrykker glykolyse og forsterker FAO i T-celler (fig. 2b–e). Disse ↑[H+]-kondisjonerte T-cellene viste begrensninger med hensyn til næringsopptak, noe som fremgår av redusert forbruk av [13C6]glukose og absorpsjon av lipidanaloger (BODIPY FL C16), et funn som kan skyldes en økt elektrokjemisk gradient (Utvidet data fig. 2h, i).

Det begrensede næringsopptaket og byttet av cellulær metabolisme kan føre til endringer i signalnettverket i T-celler. GO-anrikningsanalyse av T-celler behandlet med melkesyre viste at de fleste av de berørte genene primært er involvert med PI3K–AKT, mTOR og TCR-signalering (Utvidet data Fig. 3a). mTOR-signalering spiller en sentral rolle i å integrere immunsignaler og metabolske signaler for riktig aktivering av T-celler, og inhibering av mTOR-signalering forvrider cellene mot dannelse av minne CD8+ T-celler i stedet for effektordifferensiering38–40. Vår GSEA-analyse indikerte at aktiviteten til både AKT-mTOR og NF-кB-signalering i ↑[H+]-kondisjonerte T-celler ble redusert sammenlignet med den i kontroll-T-celler (fig. 2f og utvidede data, fig. 3b). Dette ble ytterligere bekreftet av den reduserte fosforyleringen av S6 (ved Ser235 og Ser236), 4EBP1 (ved Thr37 og Thr46), AKT (ved Ser473) og NF-кB (ved Ser536) i ↑[H+]-kondisjonerte T-celler (fig. 2g,h og utvidede data Fig. 3c). mTOR er kjent for å være en kritisk regulator av ulike biologiske prosesser, inkludert cellestørrelse, energigenerering og proteinsyntese41. Faktisk fant vi at cellestørrelsen til ↑[H+]-kondisjonerte T-celler ble redusert sammenlignet med den til kontroll-T-celler (utvidet data, fig. 3d). Vi vurderte deretter bioenergiavhengig proteinsyntese i ↑[H+]-kondisjonerte T-celler ved å bruke SCENITH, en nyutviklet metode som bruker puromycininkorporering som en avlesning av proteinsyntesenivåer42. Som forventet undertrykket ↑[H+] eksponering energikrevende proteinsyntese (fig. 2i), noe som tyder på at energimetabolismen i CD8+ T-celler ble endret. Disse resultatene stemmer overens med tidligere funn om at inhibering av mTOR-aktivitet av rapamycin økte uttrykket av stamness-assosierte transkripsjonsfaktorer (Utvidet data Fig. 3e,f). Ved å ta resultatene våre sammen, konkluderer vi med at langvarig ↑[H+]-eksponering orkestrerer en metabolsk bryter og undertrykker mTOR-aktivitet, og letter dermed anskaffelsen og vedlikeholdet av T-celle-stamme.

cistanche tubulosa-forbedre immunsystemet

↑ [H+ ]-mediert begrensning av metioninmetabolismen bevarer epigenetisk stamness

Akkumulerende bevis antyder at ett-karbonmetabolisme dikterer T-celle skjebnebeslutninger og former deres funksjonelle tilstander43,44. RNA-seq-analysen vår viste dårlig anrikning for én-karbon-metabolske prosessen og metionin-syklussignaturen i T-celler utsatt for langsiktig, snarere enn kortsiktig,↑[H+]-behandling (fig. 3a, utvidede data, fig. 4a, og tilleggsfigur 5b). Følgelig hemmet ↑[H+]-eksponering ekspresjonen av gener som koder for enzymer relatert til metioninsyklus (MTR, AHCY og BHMT) så vel som folatmetabolisme (SHMT1 og SHMT2) (utvidet data fig. 4b). Ytterligere metabolomikkanalyse viste at T-celler dyrket i melkesyre viste en markant reduksjon av intracellulære metabolitter involvert i metioninsyklusen, inkludert metionin, S-adenosylmetionin (SAM) og S-adenosylhomocystein (SAH), men økte nivåer av serin og homocystein (utvidet) Data Fig. 4c). [13C5]metioninsporing bekreftet videre at opptak og intracellulær overflod av metionin, 13C-merket intracellulær SAM (m+5), SAH (m+4) og 5'-metyltioadenosin (MTA, m +1) ble signifikant redusert i ↑[H+]-eksponerte T-celler (fig. 3b–d og utvidede data, fig. 4d). Det er verdt å merke seg at eksogen metionintilskudd gjenopprettet opptaket og intracellulær overflod av [13C5]metionin så vel som de relevante mellomproduktene i ↑[H+]-eksponerte T-celler (fig. 3c,d og utvidede data, fig. 4d), noe som tyder på at eksogent metionin tilskudd kan gjenopprette metioninopptak og metabolisme av ↑[H+]-eksponerte T-celler. Vi undersøkte deretter om metionin-restriksjon kan drive T-cellestamme. Vi fant at metionin-deprivasjon faktisk fremmet induksjonen av TCF1+ CD8+ T-cellepopulasjonen, men hadde ingen effekt på ekspresjonen av CD62L og CD44 (Utvidet data Fig. 4e,f). For ytterligere å studere rollen til metioninmetabolisme i ↑[H+]-indusert T-cellestamming, dyrket vi T-celler med ↑[H+]-medium supplert med metionin, SAM eller SAH. Fenotypen av T-cellestamme indusert av ekstracellulær acidose var faktisk delvis forbudt ved tilskudd med metionin eller SAM, men ikke SAH (fig. 3e og utvidede data fig. 4g–i). Intracellulært metionin omdannes til SAM, en viktig metylgruppedonor for DNA- og histonmetyleringsreaksjoner (Utvidet data Fig. 5a). Dermed karakteriserte vi histonmetyleringsmønstre og fant at forhøyede [H+] reduserte totale H3K27me3-nivåer i T-celler i stor grad, men hadde ikke signifikant effekt på uttrykket av andre histonmetyleringsmarkører (fig. 3f og utvidede data, fig. 5b). Som forventet gjenopprettet metionintilskudd til T-celler under ↑[H+] eksponering det totale nivået av H3K27me3-ekspresjon (fig. 3f). Den spesifikke reduksjonen av H3K27me3-nivå observert i T-celler som gjennomgikk langvarig↑[H+]-behandling, fikk oss til å anta at ↑[H+]-eksponering selektivt regulerer metyltransferasen som er spesifikk for avsetningen av H3K27me3. Faktisk observerte vi betydelig redusert ekspresjon av EZH2, en nøkkelmetyltransferase for H3K27me3, både på mRNA- og proteinnivå i ↑[H+]-eksponerte T-celler (Utvidede data Fig. 5c,d). Videre økte hemming av EZH2-aktivitet av en svært spesifikk hemmer, GSK126, uttrykket av TCF1, samt prosentandelen av CCR7+ CD62L+ CD8+ T-celler (Utvidede data Fig. 5e,f) , som var i tråd med en tidligere rapport om at EZH2 kunne regulere minne-T-cellepotensial gjennom selektive epigenetiske modifikasjoner45. For å identifisere genomomfattende endringer i epigenetiske mønstre av ↑[H+]-indusert T-cellestamme, utførte vi CUT&Tag-seq-analysen og fant minimale endringer i proporsjonaliteten til H3K4me3 og H3K27me3 avsetning blant forskjellige behandlede grupper langs promoteren, genkroppen og intergene regioner (utvidet data fig. 5g). Spesifikt avslørte epigenomisk profilering et redusert nivå av undertrykkende histonmarkør H3K27me3 ved minneassosierte genloki (for eksempel TCF7, CCR7, ID3, LEF1 og KLF2) i langtids-↑[H+]-behandlede T-celler (fig. 3g). . Det er viktig at tilsetningen av metionin under ↑[H+] eksponering delvis gjenopprettet H3K27me3-nivået ved de ovennevnte lokiene, så vel som deres genuttrykk, noe som antyder en viktig rolle for metionin i den epigenetiske moduleringen av disse minneassosierte genene (fig. 3g og Utvidede data Fig. 5h). I samsvar med en tidligere studie14, oppnådde effektorgener som PRF1, GZMB, IFNG, TBX21 og NR4A2 positivt et aktiverende histon-metyleringsmønster (H3K4me3hi og H3K27me3lo) (fig. 3g). Det er verdt å merke seg at belegget av H3K4me3 ved promoterregioner av disse effektorgenene ble svekket i T-celler dyrket under ↑[H+] eksponering og ble gjenopprettet ved metionintilskudd (fig. 3g). Samlet sett indikerer disse funnene at ↑[H+]-mediert forstyrrelse av metioninsyklusen fremmer epigenetisk bevaring av T-cellestammen.

Flere metionintransportører (SLC), inkludert SLC7A5, SLC38A1, SLC38A2 og SLC43A2, kan formidle metionintransport46. For å undersøke hvordan ↑[H+]-eksponering reduserer metioninopptak og metabolisme i T-celler, analyserte vi ekspresjonsmønstrene til distinkte SLC-er og fant at ↑[H+] dramatisk nedregulerte uttrykket av SLC7A5 og SLC38A2, men hadde liten innflytelse på SLC38A1-ekspresjonen (Extended) Data Fig. 6a,b). I tillegg reduserte ↑[H+]-eksponering uttrykket og aktiviteten til MYC (Extended Data Fig. 6c,d), som er rapportert å regulere uttrykket av metionintransportører som SLC7A5 (ref. 47). Vi demonstrerte videre en høy belegg av MYC på SLC7A5-promoteren og i mindre grad på SLC38A2-promoteren (utvidet data fig. 6e). Det er viktig at signifikant redusert MYC-binding til disse lociene ble observert i langtids-↑[H+]-behandlede T-celler (Utvidede data Fig. 6e). I samsvar med disse observasjonene, gjenopprettet overekspresjon av MYC bemerkelsesverdig uttrykket av SLC7A5 og SLC38A2 i ↑[H+]-eksponerte T-celler (Utvidede data Fig. 6f). Disse resultatene støtter den viktige rollen til MYC i redusert ekspresjon av metionintransportører ved ↑[H+] eksponering. Interessant nok fant vi at tilskudd av metionin også kan gjenopprette uttrykket av MYC og SLC7A5 i ↑[H+]-eksponerte T-celler (utvidet data, fig. 6g), noe som tyder på at metionintilskudd kan gjenopprette metioninopptaksevnen til T-celler ved å oppregulerer metionintransportør SLC7A5-ekspresjon på en MYC-avhengig måte. En tidligere studie har vist at SLC7A5 er den mest tallrike metionintransportøren i aktiverte T-celler47. Dette, sammen med våre tidligere funn, antyder at SLC7A5 kan spille en viktig rolle i ↑[H+]-indusert metioninbegrensning og opprettholdelse av en stammelignende tilstand. Faktisk fant vi at overekspresjon av SLC7A5 delvis svekket den ↑[H+]-induserte stammelignende fenotypen (utvidet data Fig. 6h, i), noe som ytterligere støttet involveringen av metionintransportøren SLC7A5 i ↑[H+]-indusert T-celleminne -lignende fenotype. Ved å analysere forskjellige tumorinfiltrerende CD8+ T-cellesubpopulasjoner fant vi redusert ekspresjon av både MYC og SLC7A5 i minnelignende CD8+ TIL-er (utvidet data fig. 7a,b), som er på linje med våre in vitro funn. Dermed antyder disse funnene at MYC – SLC7A5 – metionin-aksen potensielt kan bidra til å bevare den minnelignende statusen til TIL-er.

Fig. 2|↑[H+] eksponering utløser metabolsk omprogrammering og undertrykker mTOR-signalering. a, GO-analyse ved bruk av RNA-seq-data, som viser representative differensielt uttrykte metabolske gener i kontroll- og melkesyrekondisjonerte humane T-celler (justert P-verdi < 4,23 × 10–2). b, Skjematisk av [13C6]glukose eller [13C16]palmitatmerkingsmønstre. c, prosentandel av det angitte m+3 laktatet av totalt laktat eller av m+3 pyruvat av totalt pyruvat i T-celler. n=3 uavhengige prøver. d, prosentandel av isotopomer for TCA-mellomproduktene, slik som sitrat (m+2), malat (m+2) og succinat (m+2), avledet fra [13C6]glukose. n=3 uavhengige prøver. e, prosentandel av indikert m+2 acetyl-CoA av total acetyl-CoA eller av m+2 sitratisotop av total sitrat i T-celler fra [13C16] palmitat. n=4 uavhengige prøver. f, GSEA med statistisk analyse av gensettet assosiert med mTORC1-signalering i kontroll versus melkesyrekondisjonerte (venstre) eller pH 6.6-kondisjonerte (høyre) humane T-celler. g,h, Flowcytometrisk analyse og kvantifisering for S6 fosforylert ved Ser235 og Ser236 (g) og 4EBP1 fosforylert ved Thr37 og Thr46 (h) i humane CD8+ T-celler under de angitte forholdene. n=3 uavhengige prøver. I, Flowcytometrisk analyse og kvantifisering av energikrevende proteinsyntese i kontroller eller melkesyre- eller pH 6.6-kondisjonerte humane T-celler. n=3 uavhengige prøver. Data presenteres som gjennomsnitt ± sem Statistiske analyser ble bestemt ved ensidig Fisher eksakt test med Benjamini–Hochberg multiple-sammenligningstest (a) eller uparet tosidet Students t-test (c–e,g–i). Nominelle P-verdier og FDR-er ble beregnet med standardmetoden i GSEA-programvaren (f).

Fig. 3|Økt [H+] endrer T-cellens metioninmetabolisme for å bevare epigenetisk stamme. et GSEA-plott av gensettet assosiert med ett-karbonmetabolisme og cystein- og metioninmetabolisme i kontroll versus melkesyrekondisjonerte humane T-celler. b, Skjematisk av [13C5]metioninmerkingsmønstre. c, prosentandel av intracellulær SAM (m+5), SAH (m+4) og MTA (m+1) ​​avledet fra [13C5]metionin, av deres respektive totale samlinger, i T-celler dyrket under kontrollbetingelser eller med 10 mM melkesyre eller 10 mM melkesyre supplert med metionin (10 mM + Met). n=3 uavhengige prøver. d, Relativ overflod av [12C5]metionin og [13C5]metionin i T-celler. e, representativt histogram og kvantifisering av TCF1 i humane CD8+ T-celler dyrket under forskjellige forhold. n=3 uavhengige prøver. f, Effekter av metionintilskudd på histonmetylering i humane T-celler. H3K4me3, histon H3 trimetylert ved K4; H3K79me2, H3 dimetylert ved K79; H3K27me3, H3 trimetylert ved K27; H3K9me2, H3 dimetylert ved K9. n=3 uavhengige prøver. g, genomsporvisning av representative genloki som viser H3K27me3 (rød, over linjen) eller H3K4me3 (blå, under linjen) topper. CUT&Tag-seq-data er fra to uavhengige prøver. Data presenteres som gjennomsnitt ± sem Nominelle P-verdier og FDR-er ble beregnet med standardmetoden til GSEA-programvaren (a). Statistiske analyser ble gjort ved å bruke toveis variansanalyse (ANOVA) med Tukeys multiple-comparison test (c–f).

Eksponering for ↑[H+ ] opprettholder mitokondriell kondisjon 

Gitt den reduserte energikrevende proteinsyntesen i ↑[H+]-kondisjonerte T-celler, antok vi at langvarig eksponering for ↑[H+] kan resultere i betydelige endringer i cellulær energimetabolisme. Både kontroll- og ↑[H+]-kondisjonerte T-celler ble analysert ved bruk av SCENITH42 for å beregne glukoseavhengighet, mitokondriell avhengighet, glykolytisk kapasitet og FAO- og aminosyreoksidasjonskapasitet (fig. 4a og utvidede data, fig. 8a). I samsvar med våre metabolomikk- og isotopsporingsresultater, observerte vi økt mitokondriell metabolisme i ↑[H+]-eksponerte T-celler, mens glykolysehastigheter ble redusert (fig. 4b,c og utvidede data fig. 8b), noe som indikerer en omprogrammering av intracellulært energisk metabolisme i ↑[H+]-kondisjonerte T-celler. Sjøhestanalyse avslørte videre at ↑[H+ ]-kondisjonerte T-celler viste en høyere oksygenforbrukshastighet (OCR) så vel som SRC, et kardinaltrekk ved CD{20}} T-celler med lang levetid og en lavere ekstracellulær surhetsgrad ( ECAR) (fig. 4d–h og utvidede data fig. 8c–f). Ettersom økt mitokondriell masse/fusjon og redusert mitokondriell membranpotensial (Δψm) er viktig for opprettholdelse av T-cellestammen48–50, undersøkte vi videre mengden og kvaliteten på mitokondriene til ↑[H+]-kondisjonerte T-celler og fant at ↑[H+ ] behandling forbedret mitokondriell masse i både menneskelige og muse T-celler (fig. 4i, j og utvidede data fig. 8g, h), som også opprettholder en lavere Δψm (fig. 4k og utvidede data fig. 8i). Ultrastrukturanalyse ved elektronmikroskopi (EM) avslørte at ↑[H+]-eksponerte T-celler hadde store, tettpakkede mitokondrier spredt i cytoplasmaet og hadde mange tette, smale cristae sammenlignet med kontroll-T-celler, noe som er i tråd med publiserte resultater relatert til til mitokondriermorfologi i minne T-celler (fig. 4l,m). I samsvar med dette funnet observerte vi også økt genekspresjon av flere kritiske regulatorer av mitokondriell fusjon i ↑[H+]-kondisjonerte T-celler (Utvidede data Fig. 8j), som har blitt foreslått å spille en nødvendig rolle for generering av minne T-celler50. Til sammen indikerer disse funnene at ↑[H+] eksponering forbedrer mitokondriell masse/fusjon og egnethet for å fremme dannelsen av stamlignende T-celler.

cistanche planteøkende immunsystem

↑[H+ ] eksponering forbedrer CD8+ T-celle antitumoraktivitet 

Stamlignende T-celler favoriserer engraftment, ekspansjon og anti-tumor-effekt i adoptiv immunterapi51. For å undersøke om langsiktige in vitro ↑[H+ ]-opprettholdte CD8+ T-celler viser økt ekspansjon eller persistens ved overføring, CD45.1+ OT-I T-celler som ble utvidet i kontroll eller ↑[ H+]-kondisjonert medium ble adoptivt overført til CD45.2+C57BL/6N-mus uten implantert tumor (fig. 5a). Selv om noe økt antall apoptotiske celler ble detektert ved ↑[H+]-kondisjonering (Utvidet Data Fig. 9a), var det en signifikant høyere prosentandel av T-celler i det perifere blodet til mus overført med T-celler utvidet i ↑[H+]-tilstanden sammenlignet med de ekspanderte i kontrollmedium (kontroll-T-celler) (fig. 5b). På samme måte ble signifikant høyere frekvenser av T-celler i milten og lymfeknuter (LNs) oppdaget (Utvidede data Fig. 9b,c). I tillegg fant vi signifikant økt T-celleakkumulering i svulster, milt og drenerende lymfeknuter hos B16-OVA-svulstbærende mus hvor ↑[H+]-ekspanderte celler hadde blitt adoptivt overført sammenlignet med det hos mus som mottatt kontrollceller, noe som tyder på at CD8+ T-celler opprettholdt i ↑[H+] har forbedret utholdenhet (fig. 5c–e og utvidede data, fig. 9d). I tråd med disse funnene ble prosentandelen av minne-T-celler betydelig økt i miltene og LN-ene til mus som mottok ↑[H+]-kondisjonerte T-celler (fig. 5f og utvidede data, fig. 9e). Spesielt viste ↑[H+]-ekspanderte OT-I T-celler betydelig forsinket tumorvekst sammenlignet med kontroll-T-celler (fig. 5g). Vi undersøkte deretter den terapeutiske effekten av ↑[H+]-ekspanderte CD19 kimære-antigen-reseptor-modifiserte (CAR) T-celler med en in vivo tumormodell der CD19-K562 tumorceller ble subkutant injisert i flankene til NCG-mus (fig. 5h). Vi fant at ↑[H+]-eksponering også fremmet CAR-T-cellestamhet, men hadde ingen effekt på apoptose (Utvidede data Fig. 9f), som bevist av de betydelig økte prosentene av CCR7+ CD62L+ stamlignende CAR-T celler så vel som det oppregulerte uttrykket av TCF1 (Utvidet data Fig. 9g,h). I tillegg var det en høyere hastighet av CAR-T-celleakkumulering i tumorsteder og milter hos NCG-mus etter infusjon med ↑[H+]-kondisjonerte T-celler (fig. 5i). Som forventet viste NCG-mus som ble adoptivt overført med CAR-T-celler som hadde blitt utvidet i ↑[H+] en større clearance av implantert CD19+-svulst sammenlignet med de som mottok CAR-T-celler som hadde blitt utvidet i kontrollmedium (fig. 5j). Til sammen viste disse dataene at ↑[H+]-behandling fremmer in vivo persistens og antitumoraktivitet av T-celler.

Eksponering for ↑[H+ ] begrenser utmattelse av T-celler

For ytterligere å utforske effekten av vedvarende ↑[H+]-eksponering på T-celleutmattelse in vitro, målte vi LAG-3- og TIM-3-ekspresjon i ↑[H+]-primede humane T-celler som gjennomgikk flere runder med ytterligere stimulering med anti-CD3-antistoffer og ble kondisjonert i kontrollmedium (fig. 6a). Vi fant at både LAG-3- og TIM-3-ekspresjon ble redusert i ↑[H+]-eksponerte T-celler (fig. 6b og utvidede data, fig. 10a), noe som indikerer at ↑[H+]-behandling resulterer i redusert T-celle utmattelse. Videre fant vi at en høy konsentrasjon av metionin fører til en økning i uttrykket av hemmende markører, som PD-1, LAG-3 og TIM-3, mens behandling med lav metioninkonsentrasjon reduserte uttrykket av disse markørene litt (tilleggsfigur 6a–c). Spesielt ved langvarig in vitro ↑[H+ ] eksponering, var frekvensen av TIM-3+ LAG-3+ infiltrerende OT-I T-celler og CD19-CAR T-celler i svulstene i stor grad redusert etter adoptiv overføring (fig. 6c–e og utvidede data fig. 10b), noe som er i samsvar med deres lavere utmattelse in vitro og forbedret tumorkontrollkapasitet in vivo. Videre viste vi at langsiktige ↑[H+]-kondisjonerte T-celler viste signifikant redusert TOX-ekspresjon både in vitro og in vivo (fig. 6f, g og utvidede data, fig. 10c, d). Som beskrevet tidligere, kan utmattede T-celler generelt deles inn i en progenitor-utmattet eller terminalt utmattet undergruppe, som bestemt av TCF1 og TIM-3-uttrykk52,53. Som sådan målte vi ekspresjonsmønsteret til TCF1 og TIM-3 i CD45.1+ TIL-er og la merke til at frekvensen av TCF1− TIM-3+ terminalt utmattede T-celler i stor grad ble redusert, med en betydelig økt prosentandel av TCF1+ TIM-3– progenitor-T-celler under ↑[H+]-kondisjonering (fig. 6h). I tillegg demonstrerte vi en økt LY108+ TIM-3– progenitor T-cellepopulasjon (Utvidet data Fig. 10e) samt en økt frekvens av IFN- + TNF- + T celler (Utvidet data Fig. 10f), som ytterligere støtter det faktum at langsiktige in vitro ↑[H+]-ekspanderte adoptivt overførte T-celler begrenser utmattelse og bevarer stamheten.

Diskusjon

Tumorspesifikk ACT er en lovende tilnærming for behandling av individer med refraktære svulster, men de terapeutiske effektene er i stor grad begrenset av T-celledysfunksjon i TME. Nylig har det blitt viet betydelig oppmerksomhet til prekondisjonering av T-celler med forbigående glukosesult, glutaminrestriksjon eller forhøyet ekstracellulært kalium (↑[K+]) under in vitro-kultur for å bevare T-cellestammen og forbedre terapeutiske resultater54–56. I denne studien demonstrerte vi at dyrking av CD8+ T-celler under høye nivåer av [H+] under priming overraskende fremmet oppkjøpet av T-cellestamme og økt motstand mot utmattelse av T-celler, noe som i stor grad forbedret antitumoreffektene av adoptivt overførte T-celler.

Overdreven melkesyreakkumulering i TME har lenge vært ansett som en nøkkelfaktor i tumorimmuneflukt. For eksempel har melkesyre og den sure TME blitt vist å undertrykke CD{{0}} T-celle cytolytisk aktivitet og cytokinproduksjon31–33,57. I tråd med disse funnene fant vi også at kortvarig eksponering for ↑[H+] in vitro var nok til å hemme effektorcytokinproduksjonen dypt, men hadde ingen effekt på TCF1-ekspresjon eller stamnessassosierte metabolske funksjoner. Likevel fremmet langvarig ↑[H+]-behandling uventet TCF1-ekspresjon og opprettholdt fenotypen til stamlignende T-celler gjennom metabolsk omprogrammering og epigenetisk ombygging. Eksponering av T-celler for ↑[H+ ] etter deres fulle aktivering kan også indusere en stammelignende fenotype, og dermed utelukke muligheten for at T-celler utsatt for lav pH ganske enkelt har blitt refraktære mot stimulering, i stedet for å ha adoptert en stammelignende tilstand. Den fysiologiske melkesyrekonsentrasjonen i blodet til friske individer er rundt 1,5–3,0 mM, men den kan stige til 10 mM til 40 mM i TME35,58. Ved å bruke en vedvarende anti-CD3/CD28-stimuleringsmodell, Feng et al. har nylig rapportert at en høy konsentrasjon av natriumlaktat øker H3K27ac-nivåene ved TCF7 super-enhancer locus gjennom hemming av histondeacetylaseaktivitet, noe som fører til økt TCF1-ekspresjon og fremme av CD8+ T-cellestamme59. Derimot fant vi at langvarig eksponering for en relativt lav konsentrasjon av melkesyre (10 mM), men ikke natriumlaktat, lett kan utløse en stammelignende signatur av T-celler gjennom begrensning av metioninmetabolisme og regulering av H3K27me3 avsetning ved stamnessassosierte genloki, som tydelig støtter distinkt epigenetisk regulering av natriumlaktat og melkesyre. Behandling med lav surhet (pH 6,9) har imidlertid ingen signifikant innvirkning på TCF1-ekspresjon under vedvarende anti-CD3/CD28-stimulering, noe som tyder på at de stammelignende signaturene til CD8+ T-celler indusert av ↑[H+ ] eksponering kan overstyres av TCR-stimulering. TCR-aktivering kan øke metioninopptaket og omprogrammere metioninmetabolismen for å hjelpe T-celleaktivering19,60. Vi spekulerte i at TCR-stimulering kan forsterke opptaket av metionin i ↑[H+]-behandlede T-celler, som hadde begrenset metioninmetabolisme, og derfor forstyrret ↑[H+]-indusert epigenetisk stamhet. I tillegg kan T-celler bruke laktationer som en ekstracellulær karbonkilde for å lette anskaffelsen av stamness i nærvær eller fravær av vedvarende TCR-stimulering. Metabolsk aktivitet er nært assosiert med T-celledifferensiering, og visse metabolske intervensjoner kan i stor grad fremme langvarig minne-T-celledannelse21,37,61,62. Følgelig støtter våre metabolomikk- og isotopsporingsanalyser forestillingen om at langvarig ↑[H+] eksponering fører til slående metabolsk omprogrammering, som redusert opptak av glukose og redusert glykolyse og TCA-syklusmetabolisme. Flere studier har vist at CD8+ T-minneceller bruker FAO for å dekke energibehovet deres, selv om dette sannsynligvis er en tilpasning for differensieringen av minnelinjen, og overekspresjon av Cpt1 fremmer T-cellenes levetid21,22,63,64. Imidlertid, i deres modell av T-cellespesifikk genetisk sletting av Cpt1a, Raud et al. nylig demonstrert at LC-FAO stort sett er unødvendig for T-celleaktivering og dannelse av CD8+ T-minneceller65. Det er fortsatt en utfordring å forklare et slikt avvik. I sammenheng med studien vår spekulerer vi i at omprogrammering av fettsyremetabolisme drevet av ekstracellulær acidose sannsynligvis er assosiert med generering av minne T-celler, selv om den nøyaktige mekanismen som ligger til grunn for denne hypotesen krever ytterligere undersøkelser. Videre fant vi at ↑[H+] eksponering hemmet mTOR-aktivitet, som kan induseres av glykolytisk hemming. Spesielt kan undertrykkelse av mTOR-signalering også bidra til det metabolske skiftet fra glykolyse til mitokondriell respirasjon. Faktisk viste disse ↑[H+]-ekspanderte T-cellene forbedret mitokondriell kondisjon, som bevist av markert økt SRC og mitokondriell masse og redusert Δψm. Disse mitokondrielle signaturene, som er beriket i stamlignende T-celler og er relatert til lang levetid og overlegen antitumoraktivitet in vivo, er tett modulert av mitokondriell fusjon og fisjonsdynamikk22,48,50. Mitokondriell indre membranfusjonsprotein OPA1 spiller en uunnværlig rolle i generering av minne-T-celler50. I samsvar med det fant vi at ekstracellulær acidose også fremmet OPA1-ekspresjon i T-celler, noe som til slutt resulterte i morfologisk likevekt mot fusjon i T-celler. Mange cellulære metabolitter har vist seg å direkte bidra til epigenetiske modifikasjoner. For eksempel kan en-karbonmetabolisme generere den universelle metyldonoren SAM for histonmetylering66.

Fig. 4|Mitokondriell kondisjon opprettholdes i T-celler utsatt for ↑[H+]. en SCENITH-analyse av de menneskelige T-cellene i kontroll- eller melkesyrekondisjonerte T-celler. Et representativt oversettelsesnivå (anti-Puro) vises (n=3 uavhengige prøver). Den stiplede linjen representerer bakgrunnsnivået oppnådd etter 2-deoksy-d-glukose + oligomycin (2-DG+O) behandling. b,c, Kvantitativ analyse av glykolytisk kapasitet (b) og mitokondriell avhengighet (c) innenfor a. n=3 uavhengige prøver. d–f, OCR (d) av kontroll- og melkesyrekondisjonerte T-celler ble målt i sanntid under basale forhold som respons på de indikerte inhibitorene. FCCP, karbonylcyanid-p-trifluormetoksyfenylhydrazon; ROT/AA, rotenon og antimycin A. Representativ statistisk analyse av basal OCR (e), maksimal respirasjon (e) og SRC (f). n=9 tester; 3 uavhengige prøver ble analysert og hver prøve ble målt 3 ganger. g, h, ECAR (g) av kontroll- eller melkesyrekondisjonerte T-celler målt som respons på de indikerte inhibitorene. Representativ statistisk analyse av basal ECAR og stresset ECAR (h). n=9 tester; 3 uavhengige prøver ble påvist og hver prøve ble målt 3 ganger. i, Immunoblot-analyse av COXIV og TIM23 i humane T-celler under de angitte forholdene. Aktin ble brukt som belastningskontroll. j,k, Representative histogrammer eller konturplott og statistisk analyse av henholdsvis mitokondriell masse (MTG) (j) og mitokondriell membranpotensial (TMRM) (k), i kontrollen eller melkesyre- eller pH 6.{{30} }kondisjonerte humane T-celler. n=3 uavhengige prøver. l,m, Representativ mitokondriell morfologi av T-celler dyrket i kontrolltilstanden, melkesyre eller pH 6,6-tilstand i 12 dager, analysert med EM (skala bar, 1 μM) (l). Arealet av individuelle mitokondrier i T-celler (m), n=45 celler. Data presenteres som gjennomsnitt ± sem Statistiske analyser ble utført ved bruk av uparet to-halet Students t-test.

Fig. 5|↑[H+]-ekspanderte T-celler viser forbedret antitumoraktivitet. a,b, kontroll eller melkesyre-ekspanderte CD8+ T-celler ble analysert for utholdenhet etter adoptiv overføring (n=6 mus). Nyisolert muse-CD45.1+ OT-I T-celler ble aktivert med muse-IL-2 og platebundne antimuse-CD3- og anti-muse-CD28-antistoffer i 2 dager og deretter holdt i et kulturmedium med mus IL-2 til adoptivoverføring (CD3&CD28+IL-2). Et skjema over dyreforsøket (a) samt representative FACS-plott og statistisk analyse av CD45.1+ og CD45.2+ T-celler i blodet er vist i (b). c–g, CD45.1+ OT-I T-celler ble ekspandert i kontroll- eller melkesyremedium i 7 dager og overført til B16-OVA-tumorbærende mus, og infiltrasjonsforholdet ble evaluert (n=5 mus). Et skjema over dyreforsøket med B16-OVA-tumorbærende mus (c), samt representative FACS-plott (til venstre) og statistikk for antall (til høyre) overførte CD45.1+ OT- I T-celler i svulsten (d). sc, subkutan injeksjon. Statistikk for prosentandelen av CD45.1+ T-celler (e) og representative data (venstre) og statistikk for prosentandelen (høyre) av CD62L+ CD44+ CD45.1+ T-celler (f ) i milten er vist. Tumorvekstkurve (g) (n=5 mus, dag 14). h–j, CD19-CAR T-celler ble ekspandert i kontroll- eller melkesyremedium i 12 dager og overført til CD19-overuttrykkende K562 tumorbærende NCG-mus, og infiltrasjonsforholdet i tumor og milt var evaluert (n=6 mus). Et skjema over dyreforsøket (h), en representativ prosentandel av overførte T-celler i svulsten og milten (i), og tumorvekstkurver (j) er vist (n=6 mus, dag 10). Data presenteres som gjennomsnitt ± sem Statistiske analyser ble utført ved bruk av uparet to-halet Students t-test.

Fig. 6|↑[H+] eksponering begrenser utmattelse av T-celler. et skjema over kronisk stimulering av humane T-celler in vitro. b, Representative FACS-plott for LAG-3 og TIM-3 i kronisk stimulerte humane T-celler dyrket under kontroll- eller melkesyreforhold. n=3 uavhengige prøver. c, uttrykket av LAG-3 og TIM-3 i CD45.1+ TIL-er fra B16-OVA-svulstbærende C57BL/6N-mus (n=5-mus ). d, Kvantifisering av uttrykket av LAG-3, TIM-3 og PD-1 i CD45.1+ TIL-er fra B16-OVA-tumorbærende C57BL/ 6N mus (n=5 mus). e, uttrykket av LAG-3 og TIM-3 i tumorinfiltrerende CD19-CAR T-celler fra CD19-K562 tumorbærende NCG-mus, bestemt ved flowcytometri (n=6 mus). f, uttrykket av TOX i CD45.1+ TIL-er fra B16-OVA-tumorbærende C57BL/6N-mus (n=5-mus). g, histogrammene og statistisk analyse av TOX i tumorinfiltrerende CD19-CAR T-celler fra CD19-K562 tumorbærende NCG-mus (n=6-mus). h, venstre, representative flowcytometriplott for TIM-3 og TCF1 i CD45.1+ TIL-er fra B16-OVA-svulstbærende C57BL/6N-mus (n=5-mus) . Høyre, prosentandelen av TCF1+ TIM-3– eller TCF1– TIM-3+-populasjoner. Data presenteres som gjennomsnitt ± sem Statistiske analyser ble utført ved bruk av uparet to-halet Students t-test.

Metabolitter, som S-2-hydroksiglutarat og -hydroksybutyrat, har blitt rapportert å fungere som epigenetiske regulatorer av minne-T-celledifferensiering67,68. Resultatene våre viste at vedvarende ↑[H+]-behandling begrenser metioninopptak og metioninmetabolisme med redusert intracellulær metionin, SAM og SAH gjennom hemming av uttrykket av metionintransportører. Disse resultatene kan delvis forklare hvorfor T-celler ikke er i stand til å utkonkurrere tumorceller for metioninopptak i TME69. Mekanistisk demonstrerte vi at ↑[H+]-eksponering dramatisk reduserte MYC-ekspresjonen og dens binding til SLC7A5-promoteren, som følgelig resulterte i redusert SLC7A5-ekspresjon og svekket metioninmetabolisme i T-celler. Interessant nok kan metionintilskudd gjenopprette uttrykket av MYC og SLC7A5, så vel som fluksen av metioninsyklusen i ↑[H+]-eksponerte T-celler, noe som tyder på at gjenopprettingen av metioninopptaksevnen sannsynligvis skyldtes oppregulering av metionintransportøren. SLC7A5 på en MYC-avhengig måte. mTOR-aktivitet er rapportert å regulere MYC-oversettelse70. Følgelig spekulerte vi i at ↑[H+]-indusert nedregulering av MYC sannsynligvis skyldes translasjonsundertrykkelse gjennom den progressive hemmingen av mTOR og svekket opptak av metionin. Slik undertrykkelse kan reverseres ved eksogent metionintilskudd, selv om den nøyaktige mekanismen trenger ytterligere studier. SAM avledet fra metioninsyklusen har blitt ansett for å mediere histonmetylering og epigenetisk ombygging under effektor-T-celledifferensiering8,71. I samsvar med reduksjonen av intracellulær SAM i ↑[H+]-ekspanderte T-celler, fant vi at den totale overfloden av H3K27me3 og dens okkupasjon ved promotoren av T-cellestamme-loci begge ble sterkt redusert. H3K27me3 og H3K4me3 er selektivt modifisert på en måte som korrelerer med ekspresjonen av gener som er sentrale i effektor- eller stamness-programmet til T-celler14. Faktisk var det en lavere berikelse av H3K4me3 innenfor effektor-gen-promotere i ↑[H+]-ekspanderte T-celler. Dermed fører de reduserte nivåene av metyldonor SAM som følge av nedsatt metioninopptak og metabolisme under ↑[H+]-tilstanden til epigenetiske endringer som til slutt favoriserer T-celledifferensiering til minnestatus. Interessant nok redder tilsetning av metionin under ↑[H+]-eksponering ikke bare uttrykket av MYC og SLC7A5 i ↑[H+]-eksponerte T-celler, men gjenoppretter også det totale nivået av H3K27me3-ekspresjon, og støtter en viktig rolle for MYC–SLC7A5 –metioninmetabolismeakse for å regulere ↑[H+]-indusert epigenetisk stamhet. Faktisk fant vi at overekspresjon av SLC7A5 delvis svekket den ↑[H+]-induserte stamness-lignende fenotypen, noe som ytterligere støttet den kritiske rollen til metionintransportøren SLC7A5 i anskaffelsen av den T-celle minnelignende fenotypen under ↑[H+] eksponering.

De fleste TIL-er har historisk vært antatt å være utmattet på grunn av kontinuerlig TCR-eksponering i svulster, men paradoksalt nok beholder en liten undergruppe av T-celleklonotyper i TIL-er som uttrykker transkripsjonsfaktoren TCF1 stamcelle-lignende egenskaper. Våre funn avslørte at eksponering for ↑[H+] oppveier T-celle-effektorfunksjonen og bevarer T-cellestammen via MYC–SLC7A5–metionin-metabolismeaksen, noe som gir en mulig forklaring på det nåværende paradokset på hvorfor en liten brøkdel av TIL-er fortsatt har stam- som minne eller forløperegenskaper. Det er faktisk rapportert om lignende funn der kaliumioner i TME har en dobbel rolle som påvirker både T-celleeffektorfunksjonen og stammen56,72, og støtter ytterligere de komplekse effektene av TME immunsuppressive faktorer (for eksempel kronisk TCR-stimulering, hypoksi og lav glukose) på T-cellefunksjon og differensiering. I tillegg er de sure områdene i svulster svært dynamiske og både romlig og tidsmessig regulert, og egnetheten til T-celler tilpasset ekstracellulær acidose blir sannsynligvis overskygget når de møter andre harde TME-faktorer som kan påvirke intratumoral T-celle effektorfunksjon og differensiering. I tillegg observerte vi høyere ekspresjon av MYC i terminalt utmattede T-celler (LY108− TIM-3+) enn i progenitor-utmattede T-celler (LY108+ TIM-3–), som er i tråd med tidligere rapporter om at MYClo T-celler fortrinnsvis får minneskjebnen73. I samsvar med redusert SLC7A5-ekspresjon og metioninopptak i ↑[H+ ]-eksponerte T-celler, ble ekspresjonen av SLC7A5 også betydelig redusert i LY108+ TIM-3–progenitor-utmattet T-cellepopulasjon i svulster, noe som antyder at reguleringsaksen MYC – SLC7A5 – metionin også kan fungere in vivo. Det er nå tydelig at mindre differensierte stamlignende minne T-celler har overlegne antitumorterapeutiske effekter på grunn av deres langsiktige utholdenhet og motstand mot utvikling av dysfunksjon51,74. Vi har her gitt overbevisende bevis på at langsiktige ↑[H+ ]-kondisjonerte CD8+ T-celler viste forbedret utholdenhet og overlegen antitumorevne in vivo, med en redusert terminalt utmattet T-cellepopulasjon (TCF1− TIM{ {39}} ) og økt stammelignende progenitor-undergruppe (TCF1+ TIM-3– ) i svulster. Avslutningsvis gir vår nåværende studie innsikt i de flerdimensjonale effektene av ↑[H+]-eksponering på undertrykkelsen av T-celle-effektorfunksjonen og dens sammenfallende innflytelse på T-cellestammen.

Metoder

Mus og cellelinjer

Alle dyreforsøk ble utført med godkjenning fra Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Suzhou Institute of Systems Medicine (ISM-IACUC-0151-R), og dyrene ble holdt i spesifikke patogenfrie museanlegg. Musene ble holdt i standardforhold, med 12-t/12-t lys/mørke-sykluser og en kontrollert temperatur på 22–24 grader og fuktighet på 60 %, med ubegrenset mat og vann tilgjengelighet, og ble undersøkt daglig. Alle tumorbyrder oversteg ikke tillatelsen som ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Suzhou Institute of Systems Medicine. CD45.1+ OT-I TCR-transgene hunnmus på en C57BL/6N-bakgrunn ble holdt sammen. CD45.2+ C57BL/6N hunnmus i alderen 6–8 uker ble kjøpt fra Vital River som mottakere. Hunn NCG (NOD/ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Gpt) mus i alderen 6–8 uker ble kjøpt fra GemPharmatech. For ett uavhengig eksperiment in vivo ble CD45.1+- og CD45.2+-musene (6–12 uker) kjønnsmatchet. HEK-293T-celler fra American Type Culture Collection (ATCC) ble opprettholdt i DMEM-medium supplert med 10 % føtalt bovint serum (FBS) og 1 % penicillin-streptomycin. Musemelanomcellelinjen B16, fra ATCC, ble transdusert for å uttrykke OVA og opprettholdt i DMEM-medium supplert med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin. K562-celler fra ATCC ble transdusert for å uttrykke human CD19 og dyrket i RPMI 1640-medium supplert med 10 % FBS, 1 % penicillin-streptomycin, 1 % GlutaMAX, 0,1 M HEPES, 1 % ikke-essensielle aminosyrer, 1 mM natriumpyruvat og 500 pyruvat μM -merkaptoetanol. Alle de ovennevnte reagensene ble kjøpt fra Gibco.

Primær T-celleisolering, aktivering og retroviral transduksjon

Muse-CD{{0}} T-lymfocytter ble isolert fra milten til 6–12 ukers hann- eller hunn-OT-I-mus ved å bruke et CD8-naivt T-celleisolasjonssett (BioLegend) og dyrket i RPMI{{5} } medium supplert med 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin, 1% ikke-essensielle aminosyrer, 1% GlutaMAX, 1 mM natriumpyruvat, 0,1 M HEPES og 50 μM -merkaptoetanol i nærvær av mus IL -2 (20 U/ml, Peprotech). For ett uavhengig eksperiment in vitro ble hann- og hunnmusene (6–12 uker) brukt kjønnsmatchet. Rensede celler ble aktivert av anti-mus CD3 (2 ug/ml, BioLegend) og anti-mus CD28 (1 ug/ml, BioLegend) antistoffer i 48 timer. Humane perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra friske givere ble kjøpt fra Sailybio og dyrket i RMPI-1640-medium supplert med 5 % Human Serum AB (Gemini), 1 % penicillin-streptomycin, 1 % ikke-essensielle aminosyrer, 1 % GlutaMAX, 1 mM natriumpyruvat, 0,1 M HEPES og 50 μM -merkaptoetanol i nærvær av human IL-2 (100 U/ml, Peprotech). Anti-human CD3 (1 ug/ml, BioLegend) og anti-human CD28 (1 ug/ml, BioLegend) monoklonale antistoffer ble brukt for å aktivere PBMCs i 3 dager. Rensede muse- og humane T-celler ble aktivert og ekspandert under de angitte kulturbetingelsene: pH 7,4, pH 6,6, melkesyre (Sangon) eller natriumlaktat (Sangon). Følgende metabolitter ble brukt for å supplere pH 6,6 eller melkesyremedium (10 mM): metionin 800 μM (MCE), SAM 100 μΜ (MCE) eller SAH 100 μM (Sigma). For viral transduksjon ble 1 × 106 PBMC-er aktivert per brønn i 24-brønnplater. Etter 48 timers aktivering ble størstedelen av mediet erstattet med en ukonsentrert retroviral supernatant med 10 ug/ml polybren (Santa Cruz). Etter sentrifugering ved 600 g i 90 minutter ved 30 grader, ble cellene dyrket i inkubatoren i 24 timer med friskt medium. Transduksjonen ble gjentatt 24 timer senere og deretter returnert til et friskt medium for dyrking. Lavaffinitetsnervevekstfaktorreseptor (LNGFR) ble brukt for å kvantifisere infeksjonseffektiviteten.

Flowcytometri

Celler ble farget med fluorescerende antistoffer og deretter analysert ved flowcytometri. For overflatemarkørfarging ble cellene farget med fluorescerende konjugerte antistoffer og Live/Dead Fixable Dead Cell Stain Kit (Invitrogen) i FACS-buffer (fosfatbufret saltvann (PBS) med 2 % FBS), deretter fiksert med 2 % paraformaldehyd (Casmart) i 20 minutter ved romtemperatur. For intracellulær farging av fosfoproteiner ble forhåndsfargede celler fiksert med en fikseringsbuffer (BioLegend) og deretter farget med fosfospesifikke antistoffer i en permeabiliseringsbuffer (Invitrogen). For påvisning av intracellulære cytokiner ble celler stimulert med phorbolmyristatacetat (PMA) i nærvær av Brefeldin A (BFA) (BioLegend) i 4,5 timer. Deretter ble de forhåndsfargede cellene fiksert og farget med cytokinantistoffer i en permeabiliseringsbuffer. For intracellulær transkripsjonsfaktorfarging ble cellene forhåndsfarget med Live/Dead Fixable Dead Cell Stain Kit og fluorescerende konjugerte antistoffer i FACS-buffer for å oppdage overflatemarkører. Cellene ble deretter fiksert i 30 minutter på is ved bruk av FOXP3/Transkripsjonsfaktorfikseringsbuffer (Invitrogen) og farget med transkripsjonsfaktorantistoffer i permeabiliseringsbuffer. Etter farging ble cellene resuspendert i FACS-buffer for flowcytometri. Flowcytometridata ble samlet inn av BD LSR Fortessa og BD FACSDiva (v8.0.2), og analysert med FlowJo (v10.4) programvare. Representative gatingstrategier er gitt i utvidede data, figur 10b.

RNA-sekvensering

RNA-seq-analyse ble utført ved å bruke 12-dag-ekspanderte T-celler dyrket under de angitte forholdene som vist i fig. 1a. Kort fortalt, 12 dager etter T-celleekspansjon, ble totalt RNA ekstrahert ved homogenisering i TRIzol (Takara) og frysing i RNase-frie rør med flytende nitrogen. RNA-integriteten ble evaluert med Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent). Bibliotekene ble konstruert ved å bruke TruSeq RNA-prøveforberedelsessettet (FC-122-1001, Illumina). Bibliotekene ble deretter sekvensert ved å bruke en Illumina NovaSeq 6000 (PE150)-plattform, og omtrent 40 millioner parede avlesninger ble generert (Novogene). De rå lesetellingene ble ekstrahert og deretter normalisert av deres bibliotekstørrelsesfaktorer ved bruk av DESeq2 (v1.28.1). Den regulerte logaritmen (r-log) transformasjonen ble brukt for å stabilisere variansen på tvers av prøvene. GO og KEGG pathway anrikningsanalyse av differensielt uttrykte gener ble utført med klyngeprofil (v3.16.0). Ekspresjonsvarmekart ble generert med R-pakken 'pheatmap' (v1.0.12). GSEA v.4.0 ble brukt for GSEA-analyse.

CUT&Tag-seq

CUT&Tag-seq ble utført som tidligere beskrevet75, ved bruk av Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina (TD903, Vazyme). Kort fortalt ble humane T-celler utvidet i 12 dager under kontrollforhold, melkesyre eller melkesyre med 800 μM metionin. Deretter ble 1 × 105 T-celler lysert for ekstraksjon av nukleinmaterialer og ble inkubert med ConA-kuler ved romtemperatur i 10 minutter. Celler ble resuspendert i 50 µL antistoffbuffer forhåndsblandet med primært antistoff (anti-H3K27me3 eller anti-H3K4me3) og inkubert over natten ved 4 grader. Prøvene ble inkubert med det sekundære antistoffet ved romtemperatur i 30 minutter og ble deretter co-inkubert med proteinet A/G-Tn5 transposase ved romtemperatur i 1 time for å forstyrre DNA-fragmenteringen. Renset DNA ble brukt for bibliotekpreparering og sekvensert ved bruk av PE150 av Illumina Nova6000-sekvenseringsapparat.

CUT&Tag-seq analyse

FastQC (v{{0}}.11.4) (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) ble brukt til å sjekke sekvenseringslesekvaliteten. Avlesningene ble kvalitetstrimmet til minimum Phred-poengsum på 20 ved bruk av trimmomatic (v0.39) (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) . Alle avlesninger produsert av CUT&Tag-seq av H3K27me3 og H3K4me3 ble justert til det humane hg38-genomet ved å bruke Bowtie2 (v2.2.8) (https:// bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml) med alternativer: –local– very-sensitive-local–no-unal–no-mixed–no-discordant–phred33 -I 10 -X 700. Prøvene uten spike-in DNA ble normalisert ved hjelp av ChIPseqSpikeInFree-metoden, som er en ny normaliseringsmetode for effektivt å bestemme skaleringsfaktorer for prøver på tvers av ulike tilstander og behandlinger76. For H3K27me3 ble topper kalt ved bruk av MACS2 (v2.2.6) (https://hbctraining.github.io/Intro-to-ChIPseq/lessons/05_ peak_calling_macs .html) med alternativene '-g hs -f BAMPE–keep-dup all– broad–broad-cutoff 0.1'. For H3K4me3 brukte peak calling MACS2 med parameterne '-g hs -q 0.01 -f BAMPE–keep-dup all'. Topper ble kommentert med ChIPseeker (v1.22.1) (https://guangchuangyu.github.io/software/ ChIPseeker/), og visualiseringer ble laget ved hjelp av deepTools (v3.5.1) (https://deeptools.readthedocs.io/en /develop/) og pyGenomeTracks (v3.7) (https://pygenometracks.readthedocs.io/en/latest/).

QRT–PCR

Totalt RNA ble isolert med TRIzol (Takara) og revers transkribert til cDNA med HiScript Reverse Transcriptase (Vazyme), i henhold til produsentens instruksjoner. For kvantitativ sanntids PCR ble ABI prisme 7500 sanntids PCR System (Thermo Fisher) og 2×SYBR Green qPCR Master Mix (Bimake) brukt i henhold til produsentens instruksjoner. ACTB ble brukt som intern standard. Det relative uttrykket av mRNA ble beregnet ved å bruke 2−ΔΔCT-metoden. Primersekvenser brukt for qPCR kan finnes i tilleggstabell 1.

Western blotting

For proteinekspresjonsanalyse ble celler samlet og vasket med kald PBS, og det totale proteinet ble ekstrahert ved å bruke 1% SDS (Sangon) på is. Proteinkonsentrasjonen ble målt med et BCA-proteinanalysesett (Merck). Proteinprøver ble separert med SDS-PAGE-geler og deretter overført til PVDF-membraner (Millipore). Membraner ble blokkert med 5 % fettfri melk i PBS som inneholdt Tween20. Etter blokkering ble membraner inkubert med primære antistoffer over natten ved 4 grader og HRP-koblede sekundære antistoffer i 2 timer ved romtemperatur. HRP-signalet ble utviklet ved elektrokjemiluminescens (ChemeMINI610) og samlet inn av Sage Capture (v2.19.12). Dataanalyse ble utført ved bruk av ImageJ (v1.8.0) programvare.

Mitokondriell morfologianalyse

I hver brønn i {{0}}brønnplater ble PBMC-er aktivert av humane anti-CD3- og anti-CD28-antistoffer i 3 dager og ble dyrket i RPMI-1640-medium under forskjellige forhold i 12 dager. Deretter ble 1 × 106 PBMC-er samlet og fiksert i en forhåndskjølt fikseringsbuffer (2,5 % glutaraldehyd, 0,1 M fosfatbuffer (PB), pH 7,4) over natten ved 4 grader. Etter å ha blitt vasket med PBS tre ganger, ble cellene etterfiksert i 1 % osmiumtetroksid i PBS i 2 timer, dehydrert og innebygd i Spurrs harpiks, i henhold til standardprosedyren. Ultratynne seksjoner ble farget med uranylacetat og blycitrat. Mitokondriell morfologi ble avbildet ved bruk av Hitachi HT-7800 transmisjonselektronmikroskopi (TEM) (v01.20) og AMT-XR81DIR-kamera.

Antistoffer og reagenser

Antistoffer brukt for flowcytometrisk analyse var som følger. APC anti-human NGFR (kat. nr. 345108, 1:1,000 for FACS), FITC anti-human CD4 (kat. nr. 357406, 1:200 for FACS), Pacific Blue anti-human CD8 (kat. nr. 300928, 1:200 for FACS), APC-Cy7 anti-human/mus CD44 (kat. nr. 103028, 1:200 for FACS), PE anti-human CCR7 (kat. nr. 353204, 1 :200 for FACS), PE anti-human TNF- (kat. nr. 502909, 1:200 for FACS), PE-Cy7 anti-human CD45RO (kat. nr. 304230, 1:200 for FACS), APC anti- human IFN- (kat. nr. 502512, 1:200 for FACS), PE-Cy7 anti-human LAG-3 (kat. nr. 369310, 1:200 for FACS), PE anti-human TIM{{ 52}} (kat. nr. 345006, 1:200 for FACS), BV711 anti-human PD-1 (kat. nr. 329928, 1:200 for FACS), Percp-Cy5.5 anti-human CD62L (kat. nr. 304824, 1:200 for FACS), APC anti-human CD27 (kat. nr. 302810, 1:200 for FACS), BV711 anti-mus CD8 (kat. nr. 100748, 1:200 for FACS ), PE-Cy7 anti-mus CD62L (kat. nr. 104418, 1:200 for FACS), APC-Cy7 anti-mus CD45.2 (kat. nr. 830789, 1:200 for FACS), Pacific Blue anti- mus CD45.1 (kat. nr. 110722, 1:200 for FACS), APC anti-mus Ly108 (kat. Nei. 134610, 1:200 for FACS), PE anti-mus LAG-3 (kat. nr. 125207, 1:200 for FACS), Alexa Fluor 488 anti-c-MYC Antibody (kat. nr. 626811, 1 :200 for FACS), PE anti-mus TNF- (kat. nr. 506306, 1:200 for FACS), og APC anti-mus IFN- (kat. nr. 505810, 1:200 for FACS) ble kjøpt fra BioLegend . Live/Dead Fixable Dead Cell Stain Kit, PerCP-eFluor710 anti-mus PD-1 (kat.nr. 46-9981-82, 1:200 for FACS), PE fosfor-S6 (Ser235/236) (kat. . nr. 12-9007-42, 1:200 for FACS), PE anti-menneske/mus TOX (kat. nr. 12-6502-82, 1:200 for FACS), og PE-Cy7 anti-mus TIM{ {149}} (kat.nr. 25-5870-82, 1:200 for FACS) ble kjøpt fra Thermo Fisher. Alexa Fluor 647 anti-TCF1 (kat. nr. 6709, 1:200 for FACS) og fosfor{159}}E-BP1 (Thr37/46) (kat. nr. 2846, 1:200 for FACS) ble kjøpt fra Cellesignalteknologi. Alexa Fluor 647 anti-puromycin (kat.nr. MABE343-AF647, 1:800 for FACS) ble kjøpt fra Merck. Antistoffer brukt for western blots var som følger. Kanin anti-fosfo-Akt (Ser473) (kat. nr. 4060, 1:1,000 for IB), anti-fosfo-NF-κB p65 (Ser536) (kat. nr. 3033, 1:1 ,000 for IB), anti-c-MYC (kat. nr. 18583, 1:1,000 for IB), anti-EZH2 (kat. nr. 5246, 1:1,{ {200}} for IB), anti-tri-metyl-histon H3 (Lys27) (kat.nr. 9733, 1:1,000 for IB), anti-tri-metyl-histon H3 (Lys4) (kat.nr. 9751, 1:1,000 for IB), anti-di-metylhiston H3 (Lys9) (kat.nr. 4658, 1:1,000 for IB) , anti-di-metyl-histon H3 (Lys79) (kat. nr. 5427, 1:1,000 for IB), anti-histon H3 (kat. nr. 9715, 1:1,{{242 }} for IB), anti-COXIV (kat. nr. 850, 1:1,000 for IB), anti-kanin IgG (HRP-koblet) (kat. nr. 7074, 1:2,{ {253}} for IB), og anti-mus IgG (HRP-koblet) (kat.nr. 7076, 1:2,000 for IB) ble kjøpt fra Cell Signaling Technology. Mus anti-Tim23 (kat.nr. 611223, 1:1,000 for IB) var fra BD Biosciences. Muse-anti- -aktin (kat.nr. 66009-1-Ig, 1:5,000 for IB), anti-SLC7A5 (kat.nr. 67951-1-Ig, 1: 1,000 for IB), og kanin-anti-SLC38A1 (kat.nr. 12039-1-AP, 1:1,000 for IB) var fra Proteintech. Kanin anti-SLC38A2 (kat.nr. BMP081, 1:1,000 for IB) ble kjøpt fra Medical & Biological Laboratories.

T-celle metabolsk analyse

For å sjekke BODIPY FL C16-opptaket i kontroll- eller ↑[H+ ]-behandlede T-celler, ble T-celler dyrket med nyoppløst 1 μM BODIPY FL C16 (Invitrogen) i 1 time, deretter vasket to ganger med PBS før overflatefarging. For ytterligere å utforske den metabolske avhengigheten i forskjellige behandlingsgrupper, ble eksperimenter utført ved bruk av SCENITH-metoden (enkeltcelle energisk metabolisme ved profilering av translasjonshemming)42. Kort fortalt ble T-celler sådd i 96-brønnplater med 1 × 106 celler/ml. Deretter ble cellene behandlet med kontroll (Ctrl), 2-deoksy-d-glukose (sluttkonsentrasjon 100 mM), oligomycin (sluttkonsentrasjon 5 μM), eller en blanding av inhibitorene ved sluttkonsentrasjonene i 40 minutter ved 37 grad. Puromycin (sluttkonsentrasjon 10 ug/ml) ble tilsatt i løpet av de siste 30 min. Etter puromycinbehandling ble cellene vasket med kald PBS og forhåndsfarget med Live/Dead Fixable Dead Cell Stain Kit og antistoffer mot overflatemarkører. Fargingen av intracellulært puromycin ble fulgt av fargeprosessen for intracellulære transkripsjonsfaktorer.

Metabolomisk analyse med LC-MS/MS

Metabolomisk analyse og prøvetaking ble utført som i tidligere rapporter77. Kort fortalt ble PBMC-er aktivert individuelt i 24-brønnplater av humant anti-CD3/CD28 i 3 dager og ble dyrket i RPMI 1640-medium med kontroll eller melkesyre til dag 12. Deretter 8 × 106 celler per prøve (n=4 uavhengige prøver per gruppe) ble samlet og overført til et 1.5-ml rør for sentrifugering ved 300 g i 5 minutter ved 4 grader og deretter vasket med kald PBS. Etter sentrifugering ved 300 g i 5 minutter igjen, ble 80 % kald metanol tilsatt og virvlet kraftig for å forstyrre cellepelleten fullstendig, og deretter ble cellene overført til en fryser ved -80 grader. Prøver ble sentrifugert ved 12,000 g i 10 minutter ved 4 grader. Supernatanten ble samlet. Til slutt ble ekstraktene lyofilisert og analysert ved UHPLC-MS/MS i Novogene. Rådatafilene generert av UHPLC–MS/MS ble behandlet med Compound Discoverer (v3.1, Thermo Fisher) for å utføre toppjustering, toppplukking og kvantifisering for hver metabolitt. Metaboanalytiker (v5.0) programvare ble brukt for videre dataanalyse, og deretter ble signifikant berikede veier valgt ved bruk av P < 0,05.

Eksperimenter med stabilisotopmerking

Den 13C metabolske fluksen ble utført på T-celler ved å bruke tidligere beskrevne metoder60,78,79. Kort fortalt ble PBMC-er aktivert per brønn i 24-brønnplater med human anti-CD3/CD28 i 3 dager, som beskrevet ovenfor. For [13C6] glukosesporing ble mediet byttet etter 11 dager til glukosefri RPMI (Gibco) supplert med 10 % dialysert FBS (Thermo Fisher Scientific), 1 % penicillin-streptomycin, 1 % ikke-essensielle aminosyrer, 50 μM -merkaptoetanol og 0,1 M HEPES, inneholdende 11 mM [13C6]glukose (Cambridge Isotope Laboratories) med kontroll eller 10 mM melkesyre, i 24 timer. For [13C16]palmitatsporing ble 2 × 107 T-celler aktivert og plassert i et komplett medium med kontroll eller 10 mM melkesyrebetingelser som beskrevet ovenfor på dag 12, inneholdende 200 μM [13C16]palmitat (Cambridge Isotope Laboratories), i 8 h. For [13C5]metioninsporing ble T-celler utvidet under kontroll, melkesyre eller melkesyre med 800 μM metioninbetingelser i 12 dager. Deretter ble 4 × 107 T-celler byttet til metioninfritt komplett RPMI-medium (Gibco) og dyrket under kontrollforhold, melkesyre eller melkesyre supplert med metionin (inneholdende 100 μM, 100 μM eller 800 μM [13C5]metionin) (Cambridge Isotope Laboratories), i 8 timer. De respektive supernatantene ble samlet og deretter lagret ved -80 grader. Celler ble pelletert ved sentrifugering (300 g, 4 grader, 5 minutter), vasket to ganger med saltvann og umiddelbart hurtigfryst i flytende nitrogen og lagret ved -80 grader. Metabolitter ble ekstrahert ved å bruke iskald HPLC-kvalitet 80% metanol og vortexet kort, etterfulgt av tilsetning av 200 ml HPLC-kvalitet vann, deretter 500 ml HPLC-kvalitet kloroform (metanol:vann:kloroformforhold, 5:2:5 ). Blandingen ble vortexet og sentrifugert for å oppnå faseseparasjon. Supernatantene ble tørket ved vakuumspinn for påfølgende derivatisering, og deretter inkubert med 2% (vekt/vol) metoksyaminhydroklorid (226904, Sigma-Aldrich) i pyridin i 60 minutter ved 37 grader, og silylert med N-metyl-N-( tert-butyldimetylsilyl) trifluoracetamid med 1 % tert-butyldimetylklorsilan (TBDMS, 18162-48-6, Regis Technologies) i 30 minutter ved 45 grader. [13C6]glukosederivatene ble analysert med GC-HRMS, Trace 1310 gasskromatografen (Thermo Fisher) med DB–35MS kolonnen (Agilent Technologies), og Q Exactive GC Orbitrap GC–MS/MS-systemet (Thermo Fisher). GC–MS/MS metabolomiske analyser ble utført av Metabo-Profile. Metabolittene ble identifisert og kvantifisert av Xcalibur (v4.1) og TraceFinder (v5.1) (Thermo Fisher), inkludert retensjonstid, ladning-til-masse-forhold mellom ionefragmenter og toppintensitet. [13C16]palmitat og [13C5]metioninderivatene ble analysert med ultrahøytrykks væskekromatografi – trippelt kvadrupol massespektrometer (UPLC–TQMS). Rådataene fra UPLC–TQMS ble analysert ved bruk av Waters MassLynx-programvare (v4.1, Waters) for toppekstraksjon, integrasjon, identifikasjon og kvantifisering av metabolittene. R-språk (v4.1.1) ble brukt for påfølgende statistisk analyse.

B16 tumormodell og adoptiv celleoverføringsimmunterapi

For å undersøke antitumoraktiviteten til T-celler in vivo, ble 0.2 × 106 B16-OVA melanomceller subkutant injisert i C57BL/6N hunnmus. Ni dager etter tumorimplantasjon ble mus injisert intravenøst ​​med 5 × 106 T-celler fra OT-I hunnmus ekspandert i 7 dager under forskjellige forhold. Tumorbærende mus mottok 5 Gy subletal bestråling før ACT. Svulstområdet ble målt annenhver dag og beregnet som lengde (mm) × bredde (mm). Mus med et tumorområde som nærmet seg 300 mm2 ble avlivet. For å utforske utholdenheten til utvidede T-celler under forskjellige forhold, ble 4 × 106 CD45.1+ T-celler fra OT-I hunnmus overført adoptivt til C57BL/6N hunnmus. En uke senere ble mus avlivet og cellene fra isolert blod, milter og lymfeknuter ble talt. Andelen overførte T-celler ble bestemt ved gating på T-celler som uttrykker CD45.1+ og CD45.2+ gjennom flowcytometri.

NCG-musemodell og CD19-CAR-T-terapi

NCG-hunnmus ble implantert subkutant med 1 × 106 CD19-K562-celler. Når tumorvolumet nådde 75 mm3, mottok mus 5 × 106 ikke-transduserte T-celler og CD19-CAR T-celler dyrket i kontroll eller 10 mM melkesyreholdig medium. Tumorvekst ble målt annenhver dag med elektroniske skyvelære og beregnet etter lengde (mm) × bredde (mm). Mus med et tumorareal større enn 300 mm2 ble avlivet. Svulstene ble samlet, fordøyd og behandlet med Percoll (Sigma), og deretter ble T-cellefunksjonen og fenotypen bestemt ved hjelp av flowcytometri.

Basal oksygenforbrukshastighet og ekstracellulær forsuringshastighetsanalyse

For analyse av metabolske egenskaper ble OCR og ECAR vurdert av sjøhest XF24 analysator (Agilent). Kort fortalt ble humane T-celler dyrket med forskjellige betingelser i 12 dager forbehandlet med ikke-bufret XF-medium (ikke-bufret RPMI 1640 inneholdende 10 mM glukose 1 mM natriumpyruvat og 2 mM glutamin) . Deretter ble humane T-celler sådd med 0,5 × 106 celler per brønn i en XF24-cellekulturmikroplate og inkubert i en ikke-CO2-inkubator i 1 time ved 37 grader. For å forbedre cellevedhengen ble platene sentrifugert ved romtemperatur i 5 minutter ved 100 g med null brems. Oksygenforbruk og ekstracellulær surgjøring ble analysert under basale forhold og som respons på 1,25 μM oligomycin, 50 mM 2-deoksy-d-glukose, 1,5 μM FCCP, 0,5 μM rotenon og 0,5 μM antimycin A. SRC ble beregnet ved å subtrahere basal OCR fra maksimal OCR.

Chip–qPCR

Kromatinimmunutfelling (ChIP) ble utført etter produsentens instruksjoner som fulgte med ChIP-IT express enzymatiske skjæresett (Active Motif). Kort fortalt ble 15 millioner humane T-celler dyrket under kontroll eller 10 mM melkesyrebetingelser fiksert med formaldehyd i 10 minutter ved romtemperatur, og fikseringsreaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 1 x glycin. Faste celler ble pelletert med PMSF og proteininhiberingscocktail og lagret ved -80 grader før cellelyse. Deretter ble den tinte pelleten resuspendert i 1 ml iskald lyseringsbuffer med PMSF og proteininhiberingscocktail på is i 30 minutter for å oppnå kjernefysisk materiale. Kjernepelleten ble deretter resuspendert og fordøyd med en enzymatisk cocktail for å skjære kromatin i 15 minutter ved 37 grader. Skjært kromatin ble inkubert med protein G magnetiske perler med anti-c-MYC (CST, kat.nr. 18583, 1:100 for ChIP) og anti-IgG (CST, kat. nr. 2729, 1:100 for ChIP) kl. 4 grader over natten. Deretter ble magnetiske kuler vasket med ChIP-buffere fire ganger og eluert med 50 ul elueringsbuffer. Det eluerte DNA ble omvendt tverrbundet i 2,5 timer ved 65 grader og deretter renset ved fenol-kloroform-ekstraksjon. Det rensede DNAet ble brukt til å utføre ChIP-qPCR for å oppdage anrikningen av MYC ved målgenenes promotere. Primerne som brukes for ChIP–qPCR kan finnes i tilleggstabell 2.

Mitokondriell masse og membranpotensialanalyse

Mitokondriell masse og membranpotensial ble analysert ved bruk av MitoTracker Green og tetramethyrhodamine methyl ester (TMRM). Celler ble farget med 250 nM MitoTracker Green (Thermo Fisher) eller 50 nM TMRM (Thermo Fisher) i en inkubator ved 37 grader (5 % CO2) i 1 time før celleoverflatefarging. Celler ble vasket med FACS-buffer tre ganger, etterfulgt av overflatemarkører-farging for videre FACS-analyse.

Statistisk analyse

Statistisk analyse ble utført med GraphPad Prism versjon 8.0. Resultatene vises som gjennomsnitt ± sem Two-tailed Students t-test ble brukt til å sammenligne behandlinger med kontrollgrupper. Toveis ANOVA med Tukeys Sidaks eller Dunnetts multiple-sammenligningstest ble brukt for flere sammenligninger. P < 0.05 ble ansett for å være statistisk signifikant.

Referanser

1. Gattinoni, L., Speiser, DE, Lichterfeld, M. & Bonini, C. T minnestamceller i helse og sykdom. Nat. Med. 23, 18–27 (2017).

2. Gao, S. et al. Stamcelle-lignende minne T-celler: et perspektiv fra den mørke siden. Cell Immunol. 361, 104273 (2021).

3. Rosenberg, SA & Restifo, NP Adoptiv celleoverføring som personlig immunterapi for kreft hos mennesker. Science 348, 62–68 (2015).

4. Ribas, A. & Wolchok, JD Kreftimmunterapi ved bruk av sjekkpunktblokade. Science 359, 1350–1355 (2018).

5. Lugli, E., Galletti, G., Boi, SK & Youngblood, BA Stam-, effektor- og hybridtilstander av minne CD{1}} T-celler. Trender Immunol. 41, 17–28 (2020).

6. Galletti, G. et al. To undergrupper av stam-lignende CD8+ minne T-celle stamceller med distinkte skjebneforpliktelser hos mennesker. Nat. Immunol. 21, 1552–1562 (2020).

7. Gattinoni, L. et al. En human hukommelse T-celle undergruppe med stamcelle-lignende egenskaper. Nat. Med. 17, 1290–1297 (2011).

8. Franco, F., Jaccard, A., Romero, P., Yu, YR & Ho, PC Metabolsk og epigenetisk regulering av utmattelse av T-celler. Nat. Metab. 2, 1001–1012 (2020).

9. Kaech, SM & Cui, W. Transkripsjonskontroll av effektor- og minne-CD8+ T-celledifferensiering. Nat. Rev. Immunol. 12, 749–761 (2012).

10. Huang, Q. et al. Primordial differensiering av tumorspesifikke minne CD8+ T-celler som reagert på PD-1/PD-L1-blokkering i drenerende lymfeknuter. Cell 185, 4049–4066 (2022).

11. Siddiqui, I. et al. Intratumoral Tcf1+ PD-1+ CD8+ T-celler med stammelignende egenskaper fremmer svulstkontroll som respons på vaksinasjon og immunterapi for sjekkpunktblokkering. Immunity 50, 195–211 (2019).

12. Jeannet, G. et al. Essensiell rolle til Wnt-baneeffektoren Tcf-1 for etablering av funksjonelt CD8 T-celleminne. Proc. Natl Acad. Sci. USA 107, 9777–9782 (2010).

13. Henning, AN, Roychoudhuri, R. & Restifo, NP Epigenetisk kontroll av CD8+ T-celledifferensiering. Nat. Rev. Immunol. 18, 340–356 (2018).

14. Crompton, JG et al. Avstamningsforholdet til CD8+ T-celleundersett avsløres av progressive endringer i det epigenetiske landskapet. Cell Mol. Immunol. 13, 502–513 (2016).

15. Yu, B. et al. Epigenetiske landskap avslører transkripsjonsfaktorer som regulerer CD8+ T-celledifferensiering. Nat. Immunol. 18, 573–582 (2017).

16. Araki, Y. et al. Genomomfattende analyse av histonmetylering avslører kromatintilstandsbasert regulering av gentranskripsjon og funksjon av minne CD8+ T-celler. Immunity 30, 912–925 (2009).

17. Møller, SH, Hsueh, PC, Yu, YR, Zhang, L. & Ho, PC Metabolske programmer skreddersyr T-celleimmunitet ved virusinfeksjon, kreft og aldring. Cell Metab. 34, 378–395 (2022).

18. Phan, AT et al. Konstitutiv glykolytisk metabolisme støtter CD8+ T-celleeffektminnedifferensiering under virusinfeksjon. Immunity 45, 1024–1037 (2016).

19. Sinclair, LV et al. Antigenreseptorkontroll av metioninmetabolisme i T-celler. eLife 8, e44210 (2019).

20. O'Sullivan, D. et al. Memory CD8+ T-celler bruker celle-intrinsic lipolyse for å støtte den metabolske programmeringen som er nødvendig for utvikling. Immunity 41, 75–88 (2014).

21. Pearce, EL et al. Forbedrer CD8 T-celle minne ved å modulere fettsyremetabolismen. Nature 460, 103–107 (2009).

22. Van der Windt, GJ et al. Mitokondriell respirasjonskapasitet er en kritisk regulator for utvikling av CD8+ T-celleminne. Immunity 36, 68–78 (2012). 23. Boedtkjer, E. & Pedersen, SF Det sure tumormikromiljøet som driver for kreft. Annu. Rev. Physiol. 82, 103–126 (2020). 24. Thommen, DS & Schumacher, TN T-celledysfunksjon ved kreft. Cancer Cell 33, 547–562 (2018).

25. Scharping, NE et al. Tumormikromiljøet undertrykker t-celle mitokondriell biogenese for å drive intratumoral t-celle metabolsk insuffisiens og dysfunksjon. Immunity 45, 374–388 (2016).

26. Yu, YR et al. Forstyrret mitokondriell dynamikk i CD8+ TIL-er forsterker utmattelse av T-celler. Nat. Immunol. 21, 1540–1551 (2020).

27. Chang, CH et al. Metabolsk konkurranse i tumormikromiljøet er en driver for kreftprogresjon. Cell 162, 1229–1241 (2015).

28. Scharping, NE et al. Mitokondrielt stress indusert av kontinuerlig stimulering under hypoksi driver raskt utmattelse av T-celler. Nat. Immunol. 22, 205–215 (2021).

29. Jansen, CS et al. En intratumoral nisje opprettholder og differensierer stamlignende CD8 T-celler. Nature 576, 465–470 (2019).

30. Im, SJ et al. Definere CD8+ T-celler som gir den proliferative utbruddet etter PD-1-behandling. Nature 537, 417–421 (2016).

31. Haas, R. et al. Laktat regulerer metabolske og pro-inflammatoriske kretser i kontroll av T-celle-migrasjon og effektorfunksjoner. PLoS Biol. 13, e1002202 (2015).

32. Wu, H. et al. T-celler produserer sure nisjer i lymfeknuter for å undertrykke sine egne effektorfunksjoner. Nat. Commun. 11, 4113 (2020).

33. Calcinotto, A. et al. Modulering av surhet i mikromiljøet reverserer anergi i humane og murine tumorinfiltrerende T-lymfocytter. Cancer Res. 72, 2746–2756 (2012). 34. Gottfried, E. et al. Tumor-avledet melkesyre modulerer dendrittiske celleaktivering og antigenekspresjon. Blood 107, 2013–2021 (2006).

35. Colegio, OR et al. Funksjonell polarisering av tumorassosierte makrofager av tumoravledet melkesyre. Nature 513, 559–563 (2014).

36. Erra Diaz, F. et al. Ekstracellulær acidose og mTOR-hemming driver differensieringen av humane monocyttavledede dendrittiske celler. Cell Rep. 31, 107613 (2020).

37. Sukumar, M. et al. Hemming av glykolytisk metabolisme forbedrer CD8+ T-celleminne og antitumorfunksjon. J. Clin. Investere. 123, 4479–4488 (2013).

38. Scholz, G. et al. Modulering av mTOR-signalering utløser dannelsen av stamcelle-lignende minne T-celler. EBioMedicine 4, 50–61 (2016).

39. Pollizzi, KN et al. mTORC1 og mTORC2 regulerer selektivt CD8+ T-celledifferensiering. J. Clin. Investere. 125, 2090–2108 (2015).

40. Zhang, L. et al. Pattedyrmål for rapamycinkompleks 2 kontrollerer CD8 T-celleminnedifferensiering på en Foxo1-avhengig måte. Cell Rep. 14, 1206–1217 (2016).

41. Zhou, H. & Huang, S. Rollen til mTOR-signalering i tumorcellemotilitet, invasjon og metastase. Curr. Protein Pept. Sci. 12, 30–42 (2011).

42. Arguello, RJ et al. SCENITH: en flowcytometri-basert metode for funksjonell profilering av energimetabolisme med enkeltcelleoppløsning. Cell Metab. 32, 1063–1075 (2020).

43. Ron-Harel, N. et al. Mitokondriell biogenese og proteomremodellering fremmer ett-karbonmetabolisme for T-celleaktivering. Cell Metab. 24, 104–117 (2016).

44. Han, C., Ge, M., Ho, PC & Zhang, L. Fueling T-celle antitumor immunitet: aminosyremetabolisme revisited. Cancer Immunol. Res. 9, 1373–1382 (2021).

45. Kakaradov, B. et al. Tidlig transkripsjonell og epigenetisk regulering av CD8+ T-celledifferensiering avslørt ved encellet RNA-sekvensering. Nat. Immunol. 18, 422–432 (2017).

46. ​​Wang, W. & Zou, W. Aminosyrer og deres transportører i T-celleimmunitet og kreftterapi. Mol. Cell 80, 384–395 (2020).

47. Marchingo, JM, Sinclair, LV, Howden, AJ & Cantrell, DA Kvantitativ analyse av hvordan Myc kontrollerer T-celleproteomer og metabolske veier under T-celleaktivering. eLife 9, e53725 (2020).

48. Sukumar, M. et al. Mitokondriell membranpotensial identifiserer celler med forbedret stamness for cellulær terapi. Cell Metab. 23, 63–76 (2016).

49. Alizadeh, D. et al. IL15 forbedrer CAR-T-celle antitumoraktivitet ved å redusere mTORC1-aktivitet og bevare deres stamcelleminne-fenotype. Cancer Immunol. Res. 7, 759–772 (2019).

50. Buck, MD et al. Mitokondriell dynamikk styrer T-celle skjebne gjennom metabolsk programmering. Cell 166, 63–76 (2016).

51. Krishna, S. et al. Stamlignende CD8 T-celler medierer responsen til adoptivcelleimmunterapi mot kreft hos mennesker. Science 370, 1328–1334 (2020).

52. Burger, ML et al. Antigendominanshierarkier former TCF1+ stamfader CD8 T-cellefenotyper i svulster. Cell 184, 4996–5014 (2021).

53. Guo, Y. et al. Metabolsk omprogrammering av terminalt utmattede CD8+ T-celler av IL-10 forbedrer antitumorimmunitet. Nat. Immunol. 22, 746–756 (2021).

54. Klein Geltink, RI et al. Metabolsk kondisjonering av CD8+ efektor T-celler for adoptiv celleterapi. Nat. Metab. 2, 703–716 (2020).

55. Suzuki, J., Nabe, S., Yasukawa, M. & Yamashita, M. Glutamin regulerer antitumoraktiviteten til CD8 T-celler. Gan To Kagaku Ryoho 47, 11–15 (2020).

56. Vodnala, SK et al. T-cellestamme og dysfunksjon i svulster utløses av en vanlig mekanisme. Science 363, eaau0135 (2019).

57. Bosticardo, M. et al. Forvrengt aktivering av humane T-lymfocytter på grunn av lav ekstracellulær pH ​​antagoniseres av B7/CD28-kostimulering. Eur. J. Immunol. 31, 2829–2838 (2001).

58. Pucino, V. et al. Laktatoppbygging på stedet for kronisk betennelse fremmer sykdom ved å indusere CD4+ T-celle metabolsk omledning. Cell Metab. 30, 1055–1074 (2019).

59. Feng, Q. et al. Laktat øker stammen til CD8+ T-celler for å øke antitumorimmuniteten. Nat. Commun. 13, 4981 (2022).

60. Roy, DG et al. Metioninmetabolisme former T-hjelpecelleresponser gjennom regulering av epigenetisk omprogrammering. Cell Metab. 31, 250–266 (2020).

61. Zhang, L. & Romero, P. Metabolsk kontroll av CD8+ T-celle skjebnebeslutninger og antitumorimmunitet. Trender Mol. Med. 24, 30–48 (2018).

62. Cham, CM, Driessens, G., O'Keefe, JP & Gajewski, TF Glukosedeprivasjon hemmer flere nøkkelgenekspresjonshendelser og effektorfunksjoner i CD8+ T-celler. Eur. J. Immunol.38, 2438-2450 (2008).

63. O'Sullivan, D. et al. Memory CD8+ T-celler bruker celle-intrinsic lipolyse for å støtte den metabolske programmeringen som er nødvendig for utvikling. Immunity 49, 375–376 (2018).

64. Lin, R. et al. Fettsyreoksidasjon kontrollerer overlevelse av CD8+ vevsresident minne t-celle i gastrisk adenokarsinom. Cancer Immunol. Res 8, 479–492 (2020).

65. Raud, B. et al. Etomoksir-virkninger på regulatoriske og minne T-celler er uavhengige av Cpt1a-mediert fettsyreoksidasjon. Cell Metab. 28, 504–515 (2018).

66. Sharma, U. & Rando, OJ Metabolske innganger til epigenomet. Cell Metab. 25, 544–558 (2017).

67. Tyrakis, PA et al. S-2-hydroksiglutarat regulerer CD8+ T-lymfocytts skjebne. Nature 540, 236–241 (2016).

68. Zhang, H. et al. Ketogenese-generert beta-hydroksybutyrat er en epigenetisk regulator av CD8+ T-celleminneutvikling. Nat. Cell Biol. 22, 18–25 (2020).

69. Bian, Y. et al. Kreft SLC43A2 endrer T-celle metioninmetabolisme og histonmetylering. Nature 585, 277–282 (2020).

70. Wall, M. et al. Translasjonskontroll av c-MYC med rapamycin fremmer terminal myeloid differensiering. Blood 112, 2305–2317 (2008).

71. Yerinde, C., Siegmund, B., Glauben, R. & Weidinger, C. Metabolsk kontroll av epigenetikk og dens rolle i CD8+ T-celledifferensiering og funksjon. Front. Immunol. 10, 2718 (2019).

72. Eil, R. et al. Ionisk immunundertrykkelse innenfor tumormikromiljøet begrenser T-celleeffektorfunksjonen. Nature 537, 539–543 (2016).

73. Guo, A. et al. cBAF komplekse komponenter og MYC samarbeider tidlig i CD8+ T-cellenes skjebne. Nature 607, 135–141 (2022).

74. Raynor, JL, Chapman, NM & Chi, H. Metabolsk kontroll av minne T-celle generasjon og stamness. Cold Spring Harb. Perspektiv. Biol. 13, a037770 (2021).

75. Kaya-Okur, HS et al. CUT&Tag for effektiv epigenomisk profilering av små prøver og enkeltceller. Nat. Commun. 10, 1930 (2019).

76. Jin, H. et al. ChIPseqSpikeInFree: en ChIP-seq-normaliseringstilnærming for å avsløre globale endringer i histonmodifikasjoner uten spike-in. Bioinformatics 36, 1270–1272 (2020).

77. Sellick, CA, Hansen, R., Stephens, GM, Goodacre, R. & Dickson, AJ Metabolittekstraksjon fra suspensjonsdyrkede pattedyrceller for global metabolittprofilering. Nat. Protoc. 6, 1241–1249 (2011).

78. Li, C. et al. Aminosyrekatabolisme regulerer hematopoietisk stamcelleproteostase via en GCN2–eIF2-akse. Cell Stamcelle 29, 1119–1134 (2022).

79. Wenes, M. et al. Den mitokondrielle pyruvatbæreren regulerer minne T-celledifferensiering og antitumorfunksjon. Cell Metab. 34, 731–746 (2022).