Ekstracellulære vesikler som nye spillere i nyresykdom

"Urin kan gi oss dag for dag, måned for måned og år for år en seriehistorie om de viktigste hendelsene i nyren." Dr. Thomas Addis, pioneren innen nyrefysiologi, kom til denne konklusjonen i 1948. Oppdagelsen av ekstracellulære urinvesikler (uEV) som molekylære etterligninger av nyreceller har tatt hans syn til et nytt nivå (Figur 1). uEV-er inkluderer vesikler i nanostørrelse som spirer utover fra celleplasmamembranen til friske eller døende celler (henholdsvis mikrovesikler eller apoptotiske legemer) eller skilles ut via multivesikulære legemer i en regulert prosess (eksosomer). I tråd med Dr. Addis' syn inneholder uEV-er sykdoms- og stedsspesifikke markører fra celler i nyrenes tubuli og urinveier1, noe som gjør dem til et uvurderlig tillegg til markører for nyredysfunksjon som serumkreatinin og proteinuri, som er uspesifikke og sene. å manifestere. Utviklende bevis viser uEVs potensial til å forutsi sykdom tidligere enn konvensjonelle markører. Faktisk ble den første uEV-baserte biomarkøren nylig godkjent av Food and Drug Administration innen urologi, der en uEV RNA-signatur fungerer som en ikke-invasiv screeningmetode for prostatakreft. Annet enn deres rolle i diagnose og prognose, blir uEV-er i økende grad studert som nye budbringere i nyresykdomsmekanismer og i sammenheng med regenerativ medisin. Nylig ble en posisjonserklæring publisert av Urine Task Force til International Society of Extracellular Vesicles for å fremme strenghet og standardisering av uEV-analyse og akselerere den kliniske anvendelsen av uEV-er.

Klikk til saltvann cistanche for nyre

1 uEVs FOR DIAGNOSE OG PROGNOSE

Bruken av uEV-er for diagnose og prognose i flytende biopsier avhenger av det faktum at ekstracellulære vesikler (EV-er) beholder egenskapene til cellen de er dannet fra. uEV diagnostiske studier kan grovt deles inn i to tilnærminger: (1) tilnærminger fokusert på enkelt-EV-analyse (for eksempel ved nanopartikkelsporingsanalyse eller flowcytometri) og (2) tilnærminger fokusert på bulk-EV-analyse, som proteomikk eller RNA-profilering . Fokus for enkelt-EV-tilnærminger er generelt oppregning av uEV-er og målrettet fenotyping, for eksempel å oppdage EVs opprinnelsescelle og spesifikk last fra glomerulære og rørformede celler. Tidlige studier antydet at økninger i uEV-nivåer kan være indikasjoner på underliggende sykdom. For eksempel ble urinpodocytt-EV-er økt ved diabetisk nyresykdom i forkant av albuminuri,2 og økninger i uEV-subpopulasjoner ble rapportert ved preeklampsi.3 Mange tidlige studier er bemerkelsesverdige for heterogenitet i metodikk og påfølgende utfordringer med ekstern validering. Flere bruker suboptimale instrumenter, mangler passende kontroller eller antistoffvalidering, og unnlater å inkludere ortogonale tilnærminger for å bekrefte vesikkelisolasjon. En fersk studie viser frem en moderne tilnærming for uEV-vurdering ved hjelp av flowcytometri, som vil være avgjørende for overgangen fra et forskningsverktøy til en klinisk test.4

En omfattende validering av vesikkelisolering brukes inkludert flere proteinmarkører. Forfatterne etablerte også nøkkelkontroller: buffer, buffer pluss reagenser, uEV-er uten reagenser og et lysert vesikkelpreparat for å redusere falske positive så vel som "molekyler av ekvivalente løselige fluorokrom"-kuler for å standardisere fluorescerende intensitetsenheter. Disse nøkkeltrinnene vil tillate interlaboratorisk sammenligning av resultater uavhengig av instrument eller programvare. Den andre tilnærmingen til uEV-diagnostikk er en massevurdering av uEV-innhold. En banebrytende studie av Pisitkun et al.5 fra 2004 etablerte gjennomførbarheten av proteomisk vurdering av uEV-er og identifiserte grunnleggende utfordringer, slik som interferens av Tamm–Horsfall-protein. Lignende tilnærminger til EV-lastvurdering er beskrevet for EV-bundne nukleinsyrer, lipider og metabolitter. En nøkkelantakelse når man utleder endringer i nyrene fra de som sees i uEV-er, er at den molekylære sammensetningen av uEV-er speiler nyrenes. Nyere arbeid av Wu et al.6 ser ut til å støtte dette. Ved å bruke en proteomisk tilnærming, viste forfatterne sterke korrelasjoner mellom uEV-proteiner og de som finnes i hele nyrer. Endringer i proteinuttrykk i hele nyrer etter en fysiologisk stimulering (høy K1) ble reflektert i uEV-er som ga sterk støtte for bruk av uEV-er som surrogatmål for nyrepatologi.

uEVS FOR FUNKSJON OG REGENERERING

Det er økende interesse for den funksjonelle og regenererende rollen til uEV-er. Celler er i stand til å kommunisere ved å frigjøre EV-er, som modulerer prosesser i mottakerceller.7–9 Tre typer slik kommunikasjon er beskrevet i nyrene: (1) intranefronkommunikasjon som kan forklare hvordan glomerulær (f.eks. podocyttskade med proteinuri) og tubulær skade (f.eks. hypoksi) forårsaker interstitiell fibrose,9 (2) intratubulær kommunikasjon (mellom tubulære segmenter),7 og (3) sirkulasjon til nyrekommunikasjon, som ble påvist hos pasienter med aktiv vaskulitt og vist å bære B{{7} }kininreseptorer.8 Å forstå uEV-avledede signalveier kan til slutt føre til nye terapeutiske mål ved nyresykdom. For funksjonelle studier er det imidlertid viktig å studere rene EV-preparater og kontrastere disse fraksjonene med isolert ikke-EV-materiale ("EV-korona" eller ikke-EV-eluat).1

Forskeren begynner å oversette in vitro-funnene til in vivo-modeller, inkludert bruk av merkede eller merkede elbiler, og å validere funn i menneskelige kohorter. For eksempel brukte Lv et al.10 et transwell-kultursystem for å demonstrere at tubulære epitelceller stimulert av albumin produserer EV-er som inneholder de inflammatoriske cytokinene CC Motif Chemokine Ligand 2 (CCL2). EV-er fra disse albuminbehandlede tubulære epitelcellene ble injisert i mus og indusert tubulær skade i en in vivo-modell. I tillegg ble CCL2-messenger-RNA i uEV-er funnet hos pasienter med proteinurisk IgA-nefropati, noe som støtter translasjonspotensialet.10 Den terapeutiske rollen til stamcelle-avledede EV-er har lenge vært studert ved akutt nyresykdom og CKD. Svært nylig ble den regenererende rollen til uEV-er fra friske givere demonstrert i en glyserolindusert AKI-modell.11 uEV-er forbedret nyregjenoppretting, stimulerte tubulær celleproliferasjon og reduserte uttrykk for inflammatoriske og skademarkører, og gjenopprettet endogent Klotho-tap. Forfatterne utførte ekstra rensetrinn for å oppnå rene EV-er, grundig EV-karakterisering av EV (CD81, CD63) og ikke-EV-relaterte proteiner (calreticulin). Forfatterne inkluderte også flere nøkkelkontroller, inkludert ikke-EV-fraksjoner og EV-er fra ikke-renale kilder.

FREMTIDIGE RETNINGER

uEV-er har blitt studert i 0,17 år siden kjennetegnet publikasjonen av Pisitkun et al.5 i 2004. Hvorfor øker interessen for uEV-er som nye aktører i nyresykdom? Faktisk lanserte 2004 en æra med økende strenghet i uEV-studier, der feltet gradvis overvant viktige veisperringer for klinisk anvendelse. Biologi og lasting av elbiler ble etablert; nye isolasjonsmetoder ble utviklet, noe som førte til renere EV-isolater.1 Kvalitetsmarkører ble utviklet, normaliseringsmetoder for uEV-er ble undersøkt og validert, og 12 og minimale rapporteringskrav ble satt på plass (gjennomgått i ref. 1). I mellomtiden har uEV-forskning noen gang økt på grunn av løftene som uEV-er holder. Det viktigste er at uEV-er er berikede "kurver" med informasjon om molekylære prosesser og veier som kan spores tilbake til én celletype. Dermed er de potensielt mer følsomme enn utskilte proteiner eller RNA i urin, og de kan også være mer spesifikke. Faktisk er det gjort flere forsøk på å studere elbiler som er spesifikke for visse tubulussegmenter. Dette er imidlertid fortsatt utfordrende, ettersom mange proteinmarkører bare gjenkjenner intracellulære epitoper, noe som kan nødvendiggjøre permeabilisering av uEV-er av vaskemidler.12 En liste over proteiner som kan brukes til dette formålet, som skissert i det nylig publiserte uEV-posisjonspapiret.1 Selv om isolasjonen av uEV-er er fortsatt svært tidkrevende og arbeidskrevende. UEV-karakteriseringsmetoder med høy gjennomstrømning utvikles og karakteriseres12 med potensial til å fremskynde prosessen med å få nyrebiomarkører klinisk anvendelige, for eksempel markører for transplantasjonsavvisning som kan omgå behovet for nyrebiopsi.13 Mange av disse fremskrittene har økt kompleksiteten til informasjon som kan hentes fra uEV-er. Derfor har de nåværende utfordringene skiftet fra å finne isolasjon og karakteriseringsmetoder som er sensitive nok til å studere disse nye budbringerne til å forbedre spesifisiteten ved å (ytterligere) optimalisere normaliseringsmetoder, kvalitetskontroll og grundig rapportering. Her utvider vi anbefalinger fra uEV-posisjonspapiret1 med en utvalgt samling av ressurser for uEV-forskning (tabell 1). Til syvende og sist vil håndtering av disse utfordringene føre til de raske og nøyaktige metodene med lav variasjon som er nødvendig for klinisk anvendelse. Disse neste trinnene kan gjøre det mulig for uEV-baserte tilnærminger å erstatte nyrebiopsier i løpet av det neste tiåret.

for mer informasjon:ali.ma@wecistanche.com