Ekstraksjon av fenyletanoidglykosider fra Cistanche Tubulosa ved høyhastighets skjæringshomogeniseringsekstraksjon

Bakgrunn:

Cistanche tubulosa er en kjent tradisjonell kinesisk medisin med opprinnelse i Xinjiang. Den er vidt distribuert i Nord-Afrika, India osv. Mål: Den viktigste bioaktive komponenten i C. tubulosa erfenyletanoidglykosider (PhGs). Echinakosid og akteosid er de veiledende komponentene for bestemmelse av PhG og brukes hovedsakelig til leverbeskyttelse, immunbeskyttelse osv. Derfor er det svært viktig å trekke ut PhG fra C. tubulosa. Metoder: I denne studien ble metoder for ultralydsassistert ekstraksjon (UAE), mikrobølgeassistert ekstraksjon (MAE) og høyhastighets skjærhomogeniseringsekstraksjon (HSHE) sammenlignet. Videre ble ekstraksjonsforholdene til HSHE-metoden optimalisert. Resultater: Resultatene viste at HSHE-metoden var bedre enn både UAE- og MAE-metodene, og de optimale ekstraksjonsparametrene til HSHE var en etanolkonsentrasjon på 50 %, en ekstraksjonstemperatur på 70 grader, en rotasjonshastighet på 16000 rpm, en ekstraksjon tid på 2 minutter, et fast-til-væske-forhold på 1:9, og en ekstraksjonssyklus. Utbyttet avechinakosid og akteosidvar henholdsvis 1,366 og 0.519 %, og overføringshastighetene for echinacosid og acteosid nådde henholdsvis 87 og 94 %. Konklusjoner: Det kan konkluderes med at HSHE-metoden er en enkel, rask og effektiv teknikk for å trekke ut PhG fra C. tubulosa. Høydepunkter: En effektiv og miljøvennlig HSHE-metode har blitt undersøkt for utvinning av PhG fra C. tubulosa. De optimale betingelsene for HSHE-metoden for ekstraksjon av PhG fra C. tubulosa ble oppnådd. Denne forskningen gir en ny metode for industriell utvinning av PhG fra C. tubulosa.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA FOR FORBEDRING AV SEKSUELL FUNKSJON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Cistanche tubulosaer en vanlig tradisjonell kinesisk medisin som har sin opprinnelse i Xinjiang. Det er vidt distribuert i Nord-Afrika, denDen arabiske halvøy, Pakistan og India og ble offisielt registrert i den kinesiske farmakopéen i 2010. Den viktigste bioaktive komponenten i C. tubulosaer fenyletanoidglykosider (PhGs), en klasse vannløselige naturprodukter, inkludertechinacoside, acteosid, isoacteosidog 2-acetylakteosid (1, 2). Strukturen til PhGs består av kanelsyre- og hydroksyfenyletylgrupper, som begge er festet til en -glukopyranose gjennom esterog glykosidbindinger, henholdsvis (3). Farmakologiske studier har vist at PhGs avC. tubulosahar mange medisinske funksjoner, som antifatigue (4), nevrobeskyttende (5–7), leverbeskyttende (8–10) og immunbeskyttende effekter (11). Derfor er den effektive utvinningen av PhG fraC. tubulosahar stor betydning for utvikling og utnyttelse av naturprodukter.

De nåværende tradisjonelle ekstraksjonsmetodene for PhG-er er varmerefluksekstraksjon, ultralydassistert ekstraksjon (UAE) og mikrobølgeassistert ekstraksjon (MAE; 12–16). Disse metodene har forskjellige ulemper, som lav virkningsgrad, lange utvinningstider og høye kostnader. Sammenlignet med de tradisjonelle metodene er metoden for høyhastighets skjærhomogeniseringsekstraksjon (HSHE) en fremvoksende, ny ekstraksjonsmetode og har fordelene med raskere ekstraksjonstider, mindre løsemiddelavfall, høyere utbytte, enklere enheter og enklere drift (17). Arbeidsprinsippet til HSHE-metoden er basert på en roterende indre kutter drevet av en høyhastighetsmotor. En kraftig skjærkraft produseres av de indre og ytre kutterne for å forstyrre og blande prøvene. I mellomtiden forårsaker kutteren med høyhastighetsrotasjon trykkforskjeller mellom de indre og ytre hulrommene til kutteren, noe som resulterer i en masseoverføring mellom prøvene og løsningsmidlene. Med kombinasjonen av høy skjærkraft, kollisjonskraft, trykk og andre krefter, kan en løselig balanse mellom faste prøver og løsemidler raskt oppnås (18). Dermed kan utvinningsprosessen til HSHE fullføres på noen få minutter, og til og med så raskt som dusinvis av sekunder (19–22).

Nylig har HSHE blitt utforsket i utvinning av bioaktive komponenter fra ulike naturlige produkter (23–25). Cheng et al. brukte HSHE til å trekke ut fem lignaner fra frukten til Schisandra chinensis (26). Resultatene viste at de optimale forholdene var en etanolkonsentrasjon på 75 %, en ekstraksjonstid på 1 min, et fast-til-væske-forhold på 1:19, en ekstraksjonsspenning på 180 V og en prøvepartikkel størrelse på 120 masker. Det totale utbyttet av de fem lignane var 13,89 ± 0,014 mg/g under de optimaliserte forholdene. Tang et al. brukte HSHE for å få bioaktiv olje fra perillafrø (27). De optimale forholdene var en ekstraksjonstid på 2 minutter, et fast-til-væske-forhold på 1:10, en ekstraksjonsspenning på 150 V og to ekstraksjonssykluser. Utbyttet av perilla frøolje nådde 59,3%. Resultatene ovenfor indikerer at HSHE har fordelene med korte utvinningstider, lave kostnader og høye utbytter. Imidlertid er det mangel på forskning på utvinning av PhGs av HSHE.

I denne studien ble HSHE brukt til å utforske dens potensielle anvendelse i utvinning av PhG fra C. tubulosa. Utbyttet av PhGs ble bestemt ved HPLC. De tre ekstraksjonsmetodene, HSHE, UAE og MAE, ble sammenlignet under de samme forholdene. Effektene av etanolkonsentrasjon, ekstraksjonstemperatur, rotasjonshastighet, ekstraksjonstid, fast-til-væske-forhold og antall ekstraksjonssykluser av utbyttet ble undersøkt. Fordeler og ulemper med dette arbeidet og referansene sammenlignes og diskuteres.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA KINESISK TRADISJONELL MEDISINPHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materialer og metoder

Materiale og kjemiske reagenser

C. tubulosa ble kjøpt fra Xinjiang Congrongtang Biological Technology Co., Ltd (Xinjiang, Kina). Standardene for echinacoside (renheter større enn eller lik 98%) og akteosid (renheter større enn eller lik 98%) ble kjøpt fra Shanghai Standard Biological Technology Co., Ltd (Shanghai, Kina). Acetonitril, metanol og eddiksyre var av HPLC-kvalitet (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ). Etanolen av analytisk kvalitet ble kjøpt fra Tianjin Yongsheng Fine Chemical Co., Ltd (Tianjin, Kina). Avionisert vann ble brukt gjennom hele forsøkene.

HPLC-analyse

En HPLC-analyse ble utført på en Waters e2695 væskekromatograf (Waters, Milford, MA) utstyrt med en 2489 UV/Visible Detector og en Symmetry C18 Column (Waters), 250 × 4,6 mm, 5 μm partikkelstørrelse. Konsentrasjonene av echinacosid og acteosid ble analysert ved HPLC-metoden. Den mobile fasen besto av (1) acetonitril og (2) en 2% vandig iseddikløsning. Gradientelueringsprogrammet er presentert i tabell 1.

Den detekterte bølgelengden var 330 nm, strømningshastigheten var 1 mL/min, injeksjonsvolumet var 10 μL, og ovnstemperaturen ble satt til 30 grader. Den kromatografiske toppen av analytten ble bekreftet ved å sammenligne dens retensjonstid med den for standardene. Kvantifisering ble utført ved å integrere toppen ved hjelp av en ekstern standardmetode.

Presisjonstesten ble utført ved å injisere de samme ekstraksjonsprøvene fem ganger. For stabilitetstesten ble de samme prøvene analysert i trinn på 0, 1, 2, 4, 12, 24 og 48 timer.

Utvinningstestene av echinacosid og acteosid ble utført ved å tilsette standardene i ekstraksjonsprøvene. Alle topparealer og retensjonstider for echinacoside og acteosid ble registrert. Resultatene av kalibreringskurvene for echinakosid og akteosid er oppført i tabell 2.

Beregning av utbytte

Echinakosid og akteosid ble brukt som veiledende komponenter for bestemmelse av PhG. Utbyttet av echinacosid eller acteosid ble beregnet ved å bruke følgende ligning:

hvor Y=utbytte av echinakosid eller akteosid (%); C=konsentrasjoner av echinakosid eller akteosid (mg/ml); V=volum av ekstraksjonsløsningen (ml); og W=vekt av C. tubulosa-pulveret (mg).

Ekstraksjonsmetoder for PhGs Stilkene til C. tubulosa ble først malt av en elektrisk kvern (JC-500g; Yongkang Kaiyuan Industry & Trade Co., Ltd, Yongkang, Kina) og filtrert med en filtersikt (omtrent 380 μm) ). Deretter ble C. tubulosa-pulveret tørket i ovnen ved 70 grader inntil vekten var konstant. Fem gram C. tubulosa-pulver ble blandet med ekstraksjonsløsningsmidlet og plassert i en ekstraksjonsflaske. Deretter ble den flytende blandingen forvarmet (30–80 grader) i 5 minutter i et vannbad med konstant temperatur (DF-101S; Jintan Analytical Instrument Co., Ltd, Jintan, Kina).

(a) HSHE-metoden.-HSHE ​​ble utført av et FA25-system (FLUKO Co., Ltd, Shanghai, Kina), som besto av den roterende kutteren, høyhastighetsmotoren og kontrolleren. Rotasjonshastigheten til den indre kutteren ble regulert i området 10000–28000 rpm, og ekstraksjonstidene ble justert i området 2–15 min.

(b) UAE-metoden.-Fem gram tørket prøve og 300 ml metanol ble nøyaktig veid og tilsatt i en ekstraksjonsflaske. Ekstraksjonsflasken ble nedsenket i et ultralydbad og utført ved en ultralydeffekt på 300 W i 10 minutter. Ekstraksjonstemperaturen ble satt til 30 grader.

(c) MAE-metode.-Fem gram tørket prøve og 300 ml metanol ble nøyaktig veid og tilsatt i en ekstraksjonsflaske. Ekstraksjonsflasken ble satt inn i mikrobølgereaktoren og utført ved 180 W i 10 min. Ekstraksjonstemperaturen ble satt til 30 grader.

HSHE-metoden ble sammenlignet med UAE- og MAE-metodene med samme ekstraksjonsløsningsmiddel, ekstraksjonstid, ekstraksjonstemperatur, fast-til-væske-forhold og ekstraksjonssyklusnummer. Ekstraksjonsløsningen ble filtrert av en 0.22 μm membran og analysert via HPLC for å bestemme konsentrasjonene av echinacosid og acteosid. Alle ekstraksjonsprosessene ble gjentatt tre ganger.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FOR FORBEDRING AV IMMUNITET PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Fastsettelse av overføringssatser

Basert på standardmetoden i 2015 China Pharmacopoeia, ble echinakosid- og acteosidinnholdet i C. tubulosa-pulver bestemt (28). Ett gram C. tubulosa-pulver og 50 ml 50 % metanol ble nøyaktig veid og tilsatt i en 50 ml brun målekolbe. Den flytende blandingen ble veid og bløtlagt i 30 min. Deretter ble den brune volumetriske kolben nedsenket i et ultralydbad og utført ved en ultralydeffekt på 250 W og frekvens på 35 kHz i 40 minutter. Den flytende blandingen ble veid på nytt, og 50% metanol ble tilsatt for å tilføre løsningsmiddeltapet. Ekstraksjonsløsningen ble filtrert av en 0,22 μm membran og ble analysert ved hjelp av HPLC for å bestemme konsentrasjonene av echinacosid og acteosid. Ekstraksjonsprosessene ble gjentatt tre ganger.

Overføringshastighetene til echinacosid eller acteosid ble beregnet ved å bruke følgende ligning:

hvor X=overføringshastighet av echinakosid eller akteosid (%); M1=kvalitet av echinakosid eller akteosid i ekstraktet (mg); og M2 =-kvaliteten til echinakosid eller akteosid i C. tubulosa-pulver (mg).

Resultater og diskusjon

Validering av HPLC-metoden

HPLC-profilene til echinakosid og acteosid fra C. tubulosa ved bruk av HSHE er vist i figur 1. RSD for toppområdene til echinacoside og acteosid var henholdsvis 1,89 og 1,40 %. Resultatene viste at HPLC-metoden har god presisjon i den kvantitative analysen av echinacoside og acteoside. På forskjellige tidspunkter (0–48 timer) var RSD-ene for toppområdene av echinacoside og acteosid henholdsvis 1,71 og 1,70 %, noe som indikerer at prøven var stabil i 48 timer. Utvinningen av echinacosid og acteosid var henholdsvis 99,3 og 99,1 %, og deres RSD var henholdsvis 0,70 og 0,67 %, noe som bekreftet HPLC-metodens pålitelighet.

Sammenligning av de forskjellige ekstraksjonsmetodene En sammenligning av HSHE-metoden med MAE- og UAE-metodene angående utbyttene av echinakosid og acteosid ble

utført, hvis resultater er vist i figur 2. Det ble observert at utbyttene av echinacosid og acteosid oppnådd ved HSHE var høyere enn de oppnådd av både MAE og UAE. Sammenlignet med MAE var utbyttene av echinacosid og acteosid oppnådd ved HSHE høyere med henholdsvis 20,5 og 20,8 %. Og sammenlignet med UAE, var utbyttene av echinacosid og acteosid oppnådd av HSHE høyere med henholdsvis 6,6 og 7,4 %. Disse resultatene indikerer at HSHE kan øke utbyttet av PhGs betydelig.

Optimalisering av HSHE-metoden

Ekstraksjonsparametrene til PhGs av HSHE inkluderer etanolkonsentrasjon, ekstraksjonstemperatur, rotasjonshastighet, ekstraksjonstid, fast-til-væske-forhold og antall ekstraksjonssykluser (26, 29)

Effekt av etanolkonsentrasjon på utvinning av PhGs

Etanolkonsentrasjon er en viktig faktor som påvirker utbyttet av PhG. Som vist i figur 3 ble utbyttene av echinacosid og acteosid fra C. tubulosa under forskjellige etanolkonsentrasjoner undersøkt. Den viste at utbyttet av echinacosid økte fra 0 til 30 % og deretter redusert fra 30 til 90 % med økende etanolkonsentrasjoner. Utbyttet av akteosid økte fra 0 til 70 % og sank deretter fra 70 til 90 % med økende etanolkonsentrasjoner. Når etanolkonsentrasjonen

var 50 %, var summen av echinakosid- og akteosid-utbyttet på sitt maksimum. De ulike etanolkonsentrasjonene har ulike polariteter, noe som fører til ulike løseligheter av echinacoside og acteosid. Dermed var den optimale etanolkonsentrasjonen 50 %.

Effekt av ekstraksjonstemperatur på ekstraksjon av PhGs

For å evaluere effekten av ekstraksjonstemperaturen på utbyttet av PhG, ble forskjellige ekstraksjonstemperaturer (30–80 grader) studert. Utbyttet av echinacosid og acteosid under forskjellige temperaturer er vist i figur 4. Det kan observeres at når ekstraksjonstemperaturen økte fra 30 til 70 grader, økte utbyttene av echinacosid og acteosid. Når temperaturen økte til 80 grader, sank utbyttet av echinacosid og acteosid. Dette tilskrives en høyere temperatur som akselererer nedbrytningen av PhG. Derfor var den optimale ekstraksjonstemperaturen 70 grader.

Effekt av rotasjonshastighet på utvinning av PhGs

Figur 5 viser effekten av ulike rotasjonshastigheter på utbyttet av PhG. Utbyttet av echinakosid og akteosid økte med økende rotasjonshastigheter. Økningen i rotasjonshastighet kan øke skjærkraften til den indre og ytre kutteren, og dermed øke utbyttet av PhGs. Den optimale rotasjonshastigheten var 16000 rpm.

Effekt av ekstraksjonstid på utvinning av PhGs

Utbyttet av echinacosid og acteosid under de forskjellige ekstraksjonstidene er vist i figur 6. Utbyttet av echinacosid og acteosid var stabile med økende ekstraksjonstider. Det kan derfor konkluderes med at PhG kan ekstraheres fullstendig fra C. tubulosa på 2 min, og optimal ekstraksjonstid var 2 min.

Effekt av fast-til-væske-forhold på utvinning av PhGs

Som vist i figur 7, ble utbyttene av echinacosid og acteosid under de forskjellige fast-til-væske-forhold diskutert. Utbyttet av echinakosid og acteosid økte fra 1:3 til 1:9 og ble stabile fra 1:9 til 1:24. Fordi en liten mengde ekstraksjonsløsningsmiddel ikke fullstendig kan oppløse echinacosid og acteosid, ble masseoverføringshastighetene redusert. Den overdrevne utvinningen av løsemidler forårsaket unødvendig avfall. Derfor var det optimale fast-til-væske-forholdet 1:9.

Effekt av antall ekstraksjonssykluser på utvinning av PhGs

Figur 8 viser effekten av en rekke ekstraksjonssykluser på utbyttet av PhG. Utbyttet av echinacosid og acteosid økte med det økende antallet ekstraksjonssykluser. Imidlertid økte ekstraksjonstidene bemerkelsesverdig med økende ekstraksjonssykluser, og mer energi ble forbrukt. Det optimale antallet ekstraksjonssykluser var én.

Sammenligning av HSHE-metoden med andre ekstraksjonsmetoder for utvinning av PhG-er

Resultatene av HSHE-metoden sammenlignet med andre utvinningsmetoder fortrekke ut PhG fra C. tubulosaer oppført i tabell 3. HSHE er enklere og enklere enn koblingsmetodene som ultralydsassistert vannholdig tofaseekstraksjon og ultralydmikrobølgeekstraksjonsteknologi. I tillegg er ekstraksjonstrykket til HSHE lavere enn trykkvæskeekstraksjonsmetoden, og driftsforholdene til førstnevnte er sikrere. Enda viktigere, det kan ses av tabell 3 at HSHE viser den korteste ekstraksjonstiden og minst løsemiddelforbruket blant alle ekstraksjonsmetodene. Det kan konkluderes med at HSHE-metoden har mange fordeler som høy effektivitet, milde driftsforhold, lavt forbruksnivå, enkelt utstyr og enkel betjening for utvinning av naturprodukter.

Konklusjoner

I denne studien har en effektiv og miljøvennlig HSHE-metode blitt undersøkt for utvinning av PhG fra C. tubulosa. Sammenlignet med UAE- og MAE-metodene, gir den nye HSHE-metoden et høyere utbytte av PhG under de samme forholdene. Sammenlignet med MAE-metoden er utbyttet avechinakosid og akteosidble økt med henholdsvis 20,5 og 20,8 %. Og sammenlignet med UAE ble utbyttene av echinacosid og acteosid økt med henholdsvis 6,6 og 7,4 %. Ekstraksjonsparametrene til HSHE av PhGs fra C. tubulosa ble optimalisert. Under de optimaliserte parameterne nådde utbyttene av echinakosid og akteosid henholdsvis 1,366 og 0,519 %, og overføringshastighetene for echinakosid og akteosid nådde henholdsvis 87 og 94 %. HSHE-metoden har fordelene med høy effektivitet, milde driftsforhold, lave forbruksnivåer, enkelt utstyr, enkel betjening og lave kostnader. Denne forskningen gir en ny metode for industriell utvinning av PhG fra C. tubulosa.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE URTER PHGS75% ECH 30% ACT 12%