Blomsterekstrakter som multifunksjonelle fargestoffer i kosmetikkindustrien del 2

Vær så snill og kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mer informasjon

Mange naturlige produkter brukes i tradisjonelle medisinske systemer for å behandle lindring av symptomer fra smerte og betennelse, [61] derfor ble effekten av ekstraktene som ble analysert på hemming av lipoksygenase- og proteinaseaktivitet undersøkt. I konsentrasjonsområdet som ble analysert (100-500 ug/mL), viste CTE-vannekstrakt den sterkeste evnen til å hemme proteinase (figur 4) (ved 57 prosent for en konsentrasjon på 500 ug/mL). Denne aktiviteten ble sammenlignet med den velkjente proteinasehemmeren diklofenak, brukt som kontroll (ca. 89 prosent hemming ved den høyeste testede konsentrasjonen). Imidlertid ble lignende resultater oppnådd for GGE- og KTE-ekstrakt (henholdsvis omtrent 56 prosent og 53 prosent for de høyeste konsentrasjonene). Lavere proteinasehemming ble observert for PRE- og PGE-ekstrakter. I en ytterligere test som måler evnen til å hemme lipoksygenase, viser de vandige ekstraktene fra KTE og CTE de høyeste verdiene (henholdsvis ca. 67 prosent og 64 prosent inhibering for en konsentrasjon på 500 ug/mL). Diklofenak ble også brukt som kontroll. GGE-, PGE- og PRE-ekstrakter har også betydelig høye verdier (henholdsvis 60 prosent, 57 prosent og 54 prosent). Det ble også bemerket at evnen til å hemme LOX- og proteinaseenzymer avhenger av ekstraktkonsentrasjonen (Figur 5).

Tidligere studier indikerte at mange polyfenoliske forbindelser i betydelig grad bidro til de antiinflammatoriske aktivitetene til mange planteekstrakter [62]. Studier har vist involvering av ROS i den inflammatoriske prosessen, og fenoliske forbindelser som gallussyre og kininsyre kan blokkere arakidonsyremetabolismen ved å hemme aktiviteten til lipoksygenaseaktivitet, eller de kan tjene som fjernende reaktive frie radikaler, som produseres under arakidonsyre [63]. Resultatene oppnådd av BenSaad et al. indikerer at ellaginsyre, gallussyre og punicalagin A&B isolert fra P. granatum hemmet produksjonen av nitrogenoksid (NO), prostaglandin E2(PGE2) og interleukin 6 (IL-6) i lipopolysakkarid (LPS)-indusert RAW 267.4 makrofager. Hvorvidt disse forbindelsene fungerer som eneste midler eller har en synergistisk effekt er fortsatt et spørsmål [64]. Siden mange flavonoider viser anti-inflammatoriske egenskaper, på grunn av deres iboende antioksidantoppførsel, har de vært involvert i forskjellige inflammatoriske lidelser.flavonoid ekstraksjonsmetode pdf,Spesielt er quercetin det mest interessante molekylet fordi det forstyrrer spesifikke biologiske veier. Studier tyder dessuten på at det kan redusere den inflammatoriske prosessen involvert i flere modeller gjennom forskjellige mekanismer [65]. Spesielt resulterer den AMP-aktiverte proteinkinasen og histon/protein deacetylase (AMPK/SIRT1)-veien i mer interessant betennelsesbehandling. Dermed kan AMPK-aktivatorer redusere makrofagbetennelse. Quercetin og andre flavonoider, som aktivatorer av AMPK og SIRT1, kan redusere betennelse ved å forstyrre denne veien [66]. Det er også vist at quercetin og quercetin monoglukosider utøver et høyere LOX-hemmingspotensial [67]Nair et al. har vist antiinflammatoriske egenskaper til KTE-ekstrakt ved å evaluere tilstedeværelsen av flavonoler med quercetin-delen som manghaslin Qu 3-[2G] rhamnosylrutinosid, Qu 3-O-dirhamnosid og rutin. Disse molekylene har vist sterk hemming av COX-2-aktivitet og delvis ROS-undertrykkelse. Generelt viste polyfenoler tilstede i CTE antiinflammatoriske egenskaper i LPS-indusert betennelse i RAW 264.7 makrofagceller [68].

Klikk her for å vite mer

2.5. Cytotoksisitetsvurdering

Ved å lage nye kosmetiske råvarer er en av de viktigste egenskapene deres brukssikkerhet. Stoffer dedikert til bruk i kosmetikk må være giftfrie, spesielt i forhold til hudceller, som keratinocytter og fibroblaster. To typer tester har blitt brukt for å bestemme toksisiteten til de analyserte ekstraktene på HaCaT- og BJ-celler.flavonoiderDen første studien, som bruker den nøytrale røde opptaksanalysen, gjør oss i stand til å vurdere levedyktigheten til cellene behandlet med de analyserte ekstraktene. Dette fargestoffet går inn i lysosomene til en levende celle og frigjøres i cytoplasmaet til døde celler. Det ble observert (figur 6) at CTE-ekstraktet har den høyeste evnen til å øke spredningen av både HaCaT- og BJ-cellene. Sammenlignet med kontrollen oppnådde dette ekstraktet omtrent 20 prosent og 40 prosent høyere verdier enn den testede parameteren ved konsentrasjonen på henholdsvis 250 μL/mL (HaCaT og B】) og 500 μL/mL (BJ-celler). GGE-ekstraktet i konsentrasjoner på 100 og 250 μL/mL og KTE-ekstraktet i konsentrasjonen 500 μL/mL var preget av en liten toksisk effekt på BJ-celler. Andre ekstrakter hadde en positiv innvirkning på levedyktigheten til disse cellene. PRE- og PGE-ekstraktene ved en konsentrasjon på 100 μL/mL skilte seg ikke vesentlig fra kontrollen, og de økte proliferasjonen av BJ-celler med omtrent 10-15 prosent sammenlignet med kontrollen ved konsentrasjonen på 250 og 500 μL/ ml. Når det gjelder keratinocytter, ble ingen reduksjon i cellelevedyktighet observert. For PGE-, PRE- og CTE-ekstrakter ble det observert en økning i proliferasjon med økende konsentrasjon, mens en reduksjon i cellelevedyktighet ble påvist med økende konsentrasjon av KTE- og GGE-ekstraktene.

Den andre testen utført for å bestemme cytotoksisiteten til de testede ekstraktene var resazurin-testen (Alamar Blue). Det er vist (figur 7) at levedyktigheten til celler avhenger av konsentrasjonen av ekstraktet som cellene ble inkubert med. Når det gjelder fibroblaster, forårsaker PRE-, PGE- og CTE-ekstraktene høyere celleproliferasjon med en økning i konsentrasjonen. Ved den høyeste analyserte konsentrasjonen (500 μL/mL) ble det observert ca. 20 prosent høyere spredning sammenlignet med kontrollen.hesperidin brukerNår det gjelder KTE- og GGE-ekstrakter, ble en reduksjon i cellelevedyktighet observert med en økning i konsentrasjonen av ekstrakter. Disse ekstraktene viste en liten toksisk effekt på BJ ved konsentrasjoner på 250 og 500 μL/mL. Når det gjelder keratinocytter, ble en lignende effekt av de analyserte ekstraktene observert på hudcellene, men deres evne til å formere seg var ikke like sterk som i tilfellet med fibroblaster. Den høyeste evnen til å øke keratinocyttproliferasjonen ble observert for CTE-ekstraktet i hele området av analyserte konsentrasjoner. Lignende verdier ble oppnådd for PRE-ekstraktet ved en konsentrasjon på 250 μL/mL og for PGE-ekstraktet ved en konsentrasjon på 500 μL/mL. KTE-ekstraktet viste en betydelig høyere toksisk effekt på HaCa-celler enn GGE-ekstraktet.

De analyserte ekstraktene har ikke blitt grundig testet for deres giftighet for hudceller tidligere. Det er bare noen få cytotoksisitetsstudier på ekstrakter eller deres viktigste aktive ingredienser, spesielt mot kreftceller. Forfatterne av tidligere studier indikerte at disse ekstraktene generelt ikke har en giftig effekt på hudceller, og deres evne til å øke celleproliferasjon tilskrives oftest det høye innholdet av polyfenoler, antocyaniner og flavonoider [45,69-73 ]. Noen forfattere indikerte også at de individuelle komponentene i ekstraktene kan ha en giftig effekt på hudceller, mens ekstraktet som helhet ikke gjør det. Ali Hijazi et al. [69] viste at alkaloider utvunnet fra Punica granatum er giftige for normale cellelinjer og kreftcellelinjer, mens hele ekstraktet er mindre giftig. Studien til Nasiri et al. [70] indikerer at Punica granatum blomsterekstrakt kan være nyttig for å akselerere sårhelingsprosessen på grunn av dens evne til å øke spredningen av hudceller. I vår tidligere forskning [45] ble det vist at de vann-etanoliske ekstraktene oppnådd fra de analyserte plantene var preget av en høyere evne til å øke spredningen av BJ-celler, og KTE- og GGE-ekstraktene viste en lavere toksisk effekt på disse cellene .tapt imperium cistancheEffekten av vann-etanolekstrakter på HaCaT-celler var lik den for rene vandige ekstrakter, men i tilfellet med ekstrakter oppnådd med etanol ble det observert litt mer gunstige spredningsegenskaper enn for vandige ekstrakter. Forskjellene mellom sammensetningen av begge typer analyserte ekstrakter kan forårsake forskjeller i deres toksisitet. Som vist er vannekstrakter ikke så rike på bioaktive ingredienser som vann-etanolekstrakter. De største forskjellene er observert i innholdet av rutin og isoquercitrin.

Cistanche kan anti-aldring

2.6. Bestemmelse av solbeskyttelsesfaktor

De ugunstige effektene av UV-stråling på huden kan avsløres både kort tid etter eksponering og til og med år senere. Solstråling har en immundempende effekt som akselererer aldringsprosessen av huden med alle konsekvensene forbundet med det, inkludert økt karsinogenese[74]. De nå observerte trendene indikerer et økende behov for å utvikle produkter som ikke bare kjennetegnes av svært høy sikkerhet i bruk, men også multifunksjonalitet i den forstand at produktene vil ha hudens anti-strålebeskyttelse med et bredere virkeområde enn det som er brukt hittil. Noen plantestoffer spiller en uvurderlig rolle i dette aspektet, som ikke bare er i stand til å gi solbeskyttelse, men også nøytralisere de allerede eksisterende negative effektene av solstråling på huden [75-77]. Den utførte forskningen viste at de analyserte planteekstraktene PRE, PGE, KTE, CTE og GGE er preget av høye SPF-koeffisienter.

Analysen av koeffisientene (SPF) ble utført for de oppnådde vannekstraktene fra de ovennevnte plantene i konsentrasjoner på 10 og 50 mg/ml. For hver undersøkt plante resulterte høyere konsentrasjon av ekstraktet i en betydelig høyere verdi av SPF.mikronisert renset flavonoidfraksjon 1000 mg brukerSammenligning mellom ekstrakter viser at de høyeste verdiene av SPF ble observert for KTE-ekstraktet, som gjelder for begge undersøkte konsentrasjonene. En annen interessant observasjon er at selv i de lavere undersøkte konsentrasjonene viste KTE-ekstraktet fortsatt høy SPF, mens verdiene for andre ekstrakter sank merkbart. Dette er tydelig når vi analyserer hvor mye resultatet for KTE var høyere enn andre ekstrakter. For konsentrasjonen på 50 mg/ml var SPF høyere med faktoren 1,2 (sammenlignet med PGE, CTE) til faktoren nesten 1,9 (sammenlignet med PRE, GE). Den samme beregningen for konsentrasjonen på 10 mg/mL vil gi faktorer fra 1,4 (sammenlignet med PGE) til faktorer i området 2-3 (sammenlignet med CTE, GGE), selv opp til faktorer som 10 sammenlignet med PRE. Når man fokuserer på KTE-ekstraktet, kan man legge merke til at en synkende konsentrasjon av ekstraktet med faktor 5 (fra en verdi på 50 mg/mL til verdien på 10 mL/mL) resulterer i en reduksjon av SPF-verdien med faktor 3,4 , som betyr at SPF synker langsommere enn konsentrasjonen. Ovenstående viser at KTE-ekstraktet kan være effektivt selv når det påføres i lave konsentrasjoner (Figur 8).

2.7. Transepidermalt vanntap (TEWL) og hudhydreringsmålinger

På grunn av det brede spekteret av biologisk og farmakologisk aktivitet til planteråvarer, har plantestoffer som finnes i ekstrakter en betydelig innvirkning på hudens tilstand. Spesielt snakker vi her om påvirkningen av sekundære metabolitter på tilstanden til huden vår [78,79].

I neste fase av forskningen ble analysene av hydrering og TEWL utført. Effekten av de testede ekstraktene på huden ble vurdert. Målinger ble gjort med to-tidsintervaller på 60 og 360 minutter for ekstraktkonsentrasjonen på 10 mg/ml. For TEWL-målingen ble den største prosentvise nedgangen vist for PGE-ekstrakt, hvor kontrollverdien på 13,9 falt til 8,71, noe som resulterte i en prosentvis nedgang på 37 prosent. Det er også verdt å analysere KTE-ekstraktet fra det perspektivet, siden dette var den som viste de høyeste SPF-verdiene. For KTE-ekstraktet sank TEWL-kontrollverdien til verdien 10,22, som betyr en reduksjon på 26 prosent (Figur 9A).

Ved den andre instrumentmålingen ble det imidlertid vist at de analyserte ekstraktene gir en økning i fuktighet i forhold til kontrollprøven, både etter 60 og etter 360 min.

Som et resultat av analysene ble det funnet at de analyserte PRE-, PGE-, KTE-, CTE- og GGE-ekstraktene øker hudens fuktighet (Figur 9B). En økning i fuktighetsgivende egenskaper ble observert sammen med en økning i konsentrasjonen av ekstraktet i preparatene. De sterkeste fuktighetsgivende egenskapene er observert for PRE- og PGE-ekstrakter som tilsvarer 32 prosent og 29 prosent etter 60 minutter og tilsvarer 21 prosent og 22 prosent etter 360 minutter. Det laveste nivået av hudhydrering er imidlertid funnet for KTE-ekstrakt som tilsvarer 18 prosent etter 60 minutter og nær 3 prosent etter 360 minutter.

2.8. Applikasjonsanalyse

2.8.1. Bestemmelse av fargeparametrene til ekstrakter

På grunn av deres naturlige farge kan de aktive ingrediensene i planteblomster brukes som naturlige fargestoffer i mange kommersielle produkter, som kosmetikk og mat. Fargeanalyse ble utført for de oppnådde ekstraktene (tabell 5).

PRE-, KTE- og CTE-ekstrakter ble funnet å ha det høyeste potensialet som naturlige kosmetiske pigmenter. Imidlertid ble de høyeste kromaverdiene (C*) observert for CTE. Basert på verdien av h-gradsparameteren ble det funnet at det er den gule fargen på dette ekstraktet som er observert og synlig for det blotte øye. Når det gjelder KTE- og PRE-ekstrakter, til tross for den lave C*-verdien (2,8), kan fargen på disse ekstraktene tydelig sees med det blotte øye og ble spesifisert som rød-lilla for PRE og blåfiolett for KTE-ekstrakt. Vannekstraktene av PGE og GGE var rødlige og svakt oransje i fargen, og de oppnådde kromaverdiene var på nivået 1,3. For denne fargen var disse verdiene ikke signifikant merkbare for det blotte øye.

2.8.2. Bestemmelse av fargeparametrene til kosmetikk basert på ekstraktene

De siste årene har det vært et sterkt behov for å utvikle nye fargestoffer av naturlig opprinnelse, spesielt i næringsmiddel- og kosmetikkindustrien. Sammenlignet med fargestoffer oppnådd syntetisk, kan de ha en lavere negativ innvirkning på menneskers helse og miljøet [80]. De oppnådde ekstraktene ble brukt i formuleringen av en modell av micellær sminkefjerner. I hver formulering ble de brukt i en konsentrasjon på 1 prosent. Resultatene av fargeparametrene til modellkosmetikk er presentert i tabell 6.

Det ble observert at tilsetning av 1 prosent vannekstrakter fra PRE, PGE, CTE og GGE påvirket fargen på sminkefjerneren betydelig. Hver prøve var tydelig synlig for det blotte øye i fargen. PRE-ekstraktet endret fargen på kosmetikken til oransje, og PGE-, CTE- og GGE-ekstraktet endret det til gult.

Muligheten for å bruke de analyserte ekstraktene som potensielle fargestoffer bekreftes av de relativt høye verdiene av △Sminkefjerner med ekstrakt/grunnsminkefjerner, som indikerer en betydelig endring i fargen på modellkosmetikk med tillegg av ekstraktet sammenlignet med til basisprøven (uten tilsetning av ekstraktene). Litteraturdata [73] viser at hvis AE-verdier er høyere enn 5, blir fargen oppfattet av den nakne kvelden og oppfattet som en fargeeffekt. For sminkefjernere som inneholder PRE-, KTE- og CTE-ekstrakter ble AE-verdiene på henholdsvis 8,83, 9,17 og 8,14 oppnådd. Når det gjelder produkter med ekstraktene av PGE og GGE, ble det ikke observert noen signifikant påvirkning i ekstraktet på preparatets farge. Verdiene til AE er i området 2.51-2.82. Dette betyr at forskjellen i farge kun er merkbar for en erfaren observatør [80,81].

3. Materialer og metoder

3.1. Plantemateriale og utvinningsprosedyre

Plantematerialet som ble brukt i forskningen var tørre blomster av P. rhoeas L., P.granatum L., C.ternatea L., C.tinctorius L. og G.globosa L., som ble hentet fra den lokale urtebutikken . Ekstraksjonsprosessen ble utført i et ultralydbad (Digital Mgtrasonic Cleaner, Berlin, Tyskland), som ble utført ved bruk av metoden beskrevet av Yang et al.[82]. 10 gram tørre blomster og 100 g vann ble brukt til å tilberede vannekstrakter av de testede plantene. Prosessen ble utført i 20 minutter ved romtemperatur. De oppnådde ekstraktene ble deretter samlet og filtrert tre ganger gjennom Whatman nr. 1 filterpapir. Etter filtrering ble ekstraktene inndampet under redusert trykk ved 40 grader. En stamløsning med en konsentrasjon på 100 mg/ml ble fremstilt fra de tørkede ekstraktene og ble lagret i mørke ved 4 grader inntil videre analyse. Følgende forkortelser brukes: PRE—Papaver rhoeas-ekstrakt, PGE—Punica granatum-ekstrakt, GGE—Gomphrena globosa-ekstrakt, CTE—Carthamus tinctorius-ekstrakt, KTE—Clitoria ternatea-ekstrakt.

3.2. Bestemmelse av bioaktive forbindelser ved HPLC-UV-ESI-MS

De oppnådde ekstraktene ble analysert for å bestemme deres bioaktive hovedforbindelser ved å bruke en HPLC(DionexUltiMate 300{{20}} RS Thermo Fisher Scientific, Sunnyvale, CA, USA), koblet med et massespektrometer (4000 QTRAP, AB Sciex, Concord, ON, Canada), utstyrt med en elektrospray-ioniseringskilde (ESI) og en trippel quadrupole-ion fellemasse analysator. Kromatografisk separasjon ble oppnådd med et gradient omvendt fasesystem. Videre ble 100×4,6 mm kromatografikolonne Kinetex 3,5 μm XB-C18 100 A med iso-butylsidekjeder og med TMS endeavsluttende stasjonær fase brukt med en lignende sammensetningsbeskyttelseskolonne kjøpt fra Phenomenex og holdt ved 30 grader . Et binært løsningsmiddelsystem omfattende 0,1 prosent (o/v) vandig maursyre som løsningsmiddel A og metanol som løsningsmiddel B ble brukt under gradientmodus i løpet av 19,1 minutter av kjøretiden. Elueringsbetingelsene som ble brukt var som følger:0.0-15.0 min 25-100 prosent B,15.0-17.0 min 100 prosent B,17.0-17.1 min 100-25 prosent B,17.1-19.1 min 25 prosent B. Strømningshastigheten til den mobile fasen var 0,6 mL/min og injeksjonsvolumet var 10 μL. Eluenten ble overvåket med elektrosprayionemassespektrometer (ESI-MS) under negativ ionemodus og skannet fra m/z 20 til 1000 Da. For kvantifiseringsanalyse jobbet den trippel-kvadrupol MS-detektoren i skannemodus for flere reaksjoner (MRM). Optimale masseanalysatorforhold og valg av produktioner for individuelle forbindelser ble bestemt eksperimentelt. For dette formålet ble standardløsninger av undersøkte forbindelser (1 ng/ml) i mobilfasesammensetning introdusert ved bruk av en infusjonspumpe som opererer i konstant prøvelevering. Etter å ha sikret at riktig forløperion ble valgt, ble declustering potential (DP), inngangspotensial (EP), kollisjonscelleutgangspotensial (CXP) og kollisjonsenergi (CE) optimalisert for hver MRM-overgang (tabell S1). To MRM-overganger ble overvåket, en for kvantifisering og en for bekreftelse. MS-parametrene ble satt som følger: kapillærtemperatur på 600 C, gardingass ved 35 psi, forstøvergass ved 60 psi og tørkegass ved 50 psi. Negativ ioniseringsmoduskildespenning -4500 V ble brukt for å bestemme bioaktive forbindelser. Nitrogen ble brukt som gardin og kollisjonsgass. Dataanalyse ble behandlet med programvaren Analyst 1.5.1. Identifikasjonen av utvalgte forbindelser ble gjort ved molekylmasse og fragment av anioninnføringer av hver enkelt forbindelse og bekreftet ved MS2-fragmentering. Identiteten til ni forbindelser ble bestemt sammen med deres kjemiske formel, deprotonerte molekylære ioner og de karakteristiske fragmentionene for hver enkelt topp. Seks forbindelser ble kvantifisert basert på kalibreringskurven generert ved bruk av toppområder for de mest intense MRM-overgangene av analytiske standarder. Lineariteten til detektorresponsen for kvantifiserte forbindelser ble demonstrert ved injeksjon av kalibreringsstandarder ved åtte konsentrasjonsnivåer fra 0,01 ug/mL til 2 ug/mL. Kalibreringskurver var lineære med korrelasjonskoeffisientene (R) større enn 0,99. I tilfelle prøvene ikke falt i det lineære området til CMS-detektoren, ble prøvene fortynnet.

Analytiske standarder for kininsyre, gallussyre, koffeinsyre, caffeoylquinic syrer (CQA, to isomerer:3- og 5-CQA), og quercetin ble kjøpt fra Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA ). Alle standarder som ble brukt var av analytisk kvalitet (2 større enn eller lik 99 prosent renhet).

Standard stamløsninger ble fremstilt ved nøyaktig veiing og oppløsning av 20 mg av hver standard i 10 mL LC-MS-grad metanol for å gi en konsentrasjon på 2 mg/ml. Seriefortynninger på 2,{{10}} ug/mL, 1,5 ug/mL,1.0 ug/mL, 0.5ug/mL,0 0,1 ug/ml, 0,05 ug/mL, 0,02 ug/ml og 0,01 ug/ml ble deretter laget ved bruk av metanolløsning av LC-MS-kvalitet. Kvantifiseringsgrensen (LOQ) ble definert som 0,01 ug/ml.

LC-MS/MS-analyse ble utført i tre eksemplarer. Innhentede data ble presentert som gjennomsnitt ± standardavvik.

3.3. Bestemmelse av antioksidantegenskaper

3.3.1.ABTS· pluss scavenging assay

Først ble ABTS-løsningen fremstilt ved å blande 19,5 mg ABTS og 3,3 mg kaliumpersulfat med 7mL fosfatbuffer (pH=7.4) og oppløst i 16 timer i mørke. Deretter ble løsningen fortynnet til absorbansen ved et nivå på ca. 1.0. Absorbanser ble målt ved bølgelengde 入=734 nm. Deretter ble 20 ml KTE-, PGE-, PRE-, CTE- og GGE-ekstrakter (10.100.250.500 ug/mL) blandet med 980 ml fortynnet ABTSe ​​pluss-løsning og deretter inkubert i 10 minutter i mørke. I neste trinn ble absorbansen til de forberedte prøvene målt ved 入=734 nm ved bruk av et UV/VIS-spektrofotometer Aquamate Helion (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Destillert vann ble brukt som blank. ABTS pluss-rensing ble beregnet fra ligning (1):

hvor: As—prøvens absorpsjon; Ac—absorbans av kontrollprøven. Målinger ble utført i tre eksemplarer for hver ekstrahert prøve. Prosedyren ble beskrevet av Gawel-Beben et al. [83].

3.3.2.DPPH Radical Scavenging Assay

Ekstraktenes evne til å fange frie radikaler ble utført ved å bruke metoden beskrevet av Brand-Williams et al. [84]. Den er basert på bruken av 1,1-difenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radikalet. Først ble 33 μL vandige løsninger av ekstrakter i konsentrasjoner på 100 ug/mL blandet med 167 μL metanolløsning av DPPH (4 mM) og overført til en 96-brønnplate, deretter blandet ved risting. Etterpå ble absorbansen til prøvene målt ved en bølgelengde på 517 nm. Målinger ble utført hvert 5. minutt i 30 minutter på et UV-VIS Filter Max入=5 spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Tre uavhengige replikater ble utført for hvert ekstrakt. Vann med en DPPH-løsning ble brukt som kontroll. Antioksidantkapasiteten ble uttrykt som en prosentandel av DPPH-hemming ved bruk av ligning (2):

hvor: As—prøvens absorpsjon; Ac—absorbans av kontrollprøven. Målinger ble utført i tre eksemplarer for hver ekstrahert prøve.

3.3.3. Påvisning av intracellulære nivåer av reaktive oksygenarter (ROS)

For å bestemme evnen til de analyserte ekstraktene til å generere den intracellulære produksjonen av reaktive oksygenarter i HaCaT- og BJ-celler, ble et fluorogent H, DCFDA-fargestoff brukt. Denne forbindelsen har evnen til å gå inn i celler ved passiv diffusjon, hvor den deacetyleres av intracellulære esteraser til en ikke-fluorescerende forbindelse. Hvis reaktive oksygenarter er tilstede i cellen, omdannes denne forbindelsen til sterkt fluorescerende DCF. For å bestemme det intracellulære nivået av ROS i HaCaTs og BJ, ble celler sådd i 96-brønnplater. Deretter ble cellene dyrket i en inkubator i 24 timer. DMEM-medium ble fjernet og erstattet med 10 μM H2DCFDA (Sigma Aldrich, St.Louis, MO, USA) oppløst i serumfritt DMEM-medium. HaCaT- og BJ-celler ble inkubert i H, DCFDA i 45 minutter og deretter inkubert med ekstraktene i konsentrasjonene ∶ på 100, 250 og 500 ug/ml. Celler behandlet med 1 mM hydrogenperoksid (H2O2) ble brukt som positive kontroller. Kontrollprøvene var celler ubehandlet med de testede ekstraktene. DCF-fluorescens ble målt hvert 90. minutt ved bruk av en FilterMax F5 mikroplateleser (Thermo Fisher Scientific) ved en maksimal eksitasjon på 485 nm og emisjonsspektra på 530 nm [85].

3.4. Vurdering av hemming av matrisemetallopeptidaser

3.4.1. Bestemmelse av anti-elastaseaktivitet

For å bestemme muligheten for å hemme matrisemetalloproteinase, nøytrofil elastase (NE), ble et fluorometrisk sett (Abcam, ab118971) brukt. Testen ble utført i samsvar med instruksjonene vedlagt settet og med prosedyren beskrevet av Niziol-Lukaszewska et al. [86]. Analyser ble utført i en standard 96-brønnplate med en klar flat bunn. For analysen ble det brukt planteekstrakter i en konsentrasjon på 100 og 250 ug/mL. Opprinnelig ble NE-enzymløsninger, et NE-substrat og en inhibitorkontroll (SPCK) fremstilt i henhold til instruksjonene. Fortynnet NE-løsning ble tilsatt til alle brønner, og deretter ble testprøver, inhibitorkontrollen og enzymkontrollen (analysebuffer) tilsatt til påfølgende brønner. Etterpå ble prøver blandet og inkubert ved 37 grader i 5 minutter. I mellomtiden ble en reaksjonsblanding fremstilt ved å blande analysebufferen og NE-substratet. Blandingen ble tilsatt til hver brønn og blandet grundig. Fluorescens ble målt umiddelbart ved eksitasjonsbølgelengde 入=400 nm og emisjon 入=505 nm ved bruk av en mikroplateleser (FilterMax F5, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) Evnen til å hemme NE-aktiviteten til de analyserte prøver ble beregnet fra ligning (3):

Det endelige resultatet var det aritmetiske gjennomsnittet av tre uavhengige målinger.

3.4.2. Bestemmelse av anti-kollagenaseaktivitet

For å vurdere evnen til de oppnådde ekstraktene til å hemme kollagenaseaktivitet, ble et fluormetrisk sett (Abcam, Cambridge, UK, ab211108) brukt. Testen ble utført i samsvar med instruksjonene vedlagt settet og med prosedyren beskrevet av Niziol-Lukaszewska et al. [86]. Analyser ble utført i en standard 96-brønnplate med en klar flat bunn. For analysen ble det brukt planteekstrakter i en konsentrasjon på 100 og 250 ug/mL. Først ble kollagenase (COL) oppløst i en kollagenaseanalysebuffer (CAB). Deretter ble analyserte prøver lagt til COL og CAB. Inhibitorkontrollprøver ble fremstilt ved å blande kollagenasehemmeren(1,10-fenantrolin(80 mM) med kollagenase og CAB-buffer. Enzymkontrollbrønner ble fremstilt ved å blande fortynnet COL med CAB. CAB-bufferen ble brukt som bakgrunnskontroll Deretter ble prøvene inkubert ved romtemperatur i 15 min. En reaksjonsblanding ble fremstilt ved å blande kollagenasesubstratet med CAB. Reaksjonsblandingen fremstilt på denne måten ble tilsatt alle analyserte prøver og blandet grundig. Deretter ble fluorescens målt ved en eksitasjonsbølgelengde på 490 nm og emisjon på 520 nm. Målingen ble utført i kinetisk modus i 60 minutter ved 37 C. Evnen til å hemme COL-aktiviteten til oppnådde ekstrakter ble beregnet ved ligning (4):

3.5. Bestemmelse av anti-inflammatoriske egenskaper

3.5.1. Hemming av proteindenaturering

Proteinasehemmende aktivitet av PRE-, PGE-, KTE-, CTE- og GGEekstrakter ble utført i henhold til metoden til Sakat et al. [87], som ble modifisert av Gunathilake et al. [88]. Kort fortalt besto reaksjonsløsningen (2 mL) av 1 mL 1 prosent trypsin i 2{{10}} mM Tris-HCl-buffer (pH7,4) og 1 mL testprøve ({{17} },02 ml ekstrakt 0,980 ml vann). Løsningen ble inkubert (37 grader i 5 minutter), og deretter ble 1 ml 0,8 prosent (vekt/volum) kasein tilsatt og blandingen ble videre inkubert i 20 minutter. Ved slutten av inkubasjonen ble 2 ml 70 prosent perklorsyre tilsatt for å fullføre reaksjonen. Blandingen ble sentrifugert, og absorbansen til supernatanten ble målt ved 210 nm mot bufferen som en blindprøve. Fosfatbufferløsningen ble brukt som kontroll. Prosentvis hemming av proteindenaturering ble beregnet ved å bruke følgende formel:

hvor A1= absorpsjon av kontrollprøven, og A2= absorpsjon av testprøven.

3.5.2. Hemming av lipoksygenaseaktivitet

Evnen til oppnådde ekstrakter til å inhibere lipoksygenaseaktivitet ble bestemt ved å bruke metoden beskrevet av Sarvesvaran et al. 【89】. Først ble 10 μL planteekstrakter i forskjellige konsentrasjoner (100, 250 og 500 ug/mL) blandet i en 96-brønnplate med 160 μL 100 mM PBS og 20 μL soyabønnelipoksygenase-løsning (167 U/167). ml). Prøver ble inkubert ved 25 grader i 10 minutter og etter denne tiden ble 10 μL natriumlinolsyre tilsatt for å starte reaksjonen. Deretter ble absorbansen til prøvene målt ved 234 nm over en periode på 3 minutter i hvert minutt ved bruk av en FilterMax F5 mikroplate-leser (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Diklofenak ble brukt som en positiv kontroll. Prosenten av hemming av lipoksygenaseaktivitet ble beregnet fra ligning (6):

hvor: Som absorbansen til den testede prøven, er Ac absorbansen til den negative kontrollen.

Det endelige resultatet var det aritmetiske gjennomsnittet av tre uavhengige målinger.

3.6. Cytotoksisitetsanalyse

3.6.1. Cellekultur

I denne studien ble to hudcellelinjer brukt: normale humane keratinocytter (HaCaT) og fibroblaster (BJ). HaCaTs ble hentet fra CLSCell Lines Service (CLS Cell Lines Service GmbH, Eppelheim, Tyskland) og BJs fra American Type Culture Collection ( Manassas, VA, USA). Celler ble dyrket i Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM, Biological Industries, Cromwell, CO, USA) med natriumpyruvat, L-glutamin og høyt glukoseinnhold (4,5 g/l). Mediet ble også beriket med 10 prosent føtalt bovint serum (Gibco, Waltham, MA, USA) og 1 prosent med antibiotika (100 U/mL penicillin og 1000 ug/mL streptomycin, Gibco) for å forhindre mikrobiell kontaminering. Celler ble dyrket i en inkubator ved 37 grader i en fuktet atmosfære med 95 prosent luft og 5 prosent karbondioksid.

3.6.2. Alamar Blue Assay

Etter at de dyrkede cellene (HaCaT og BJ) hadde nådd ønsket konfluens, ble DMEM-mediet aspirert i kulturkolbene. De bunnfestede cellene ble vasket to ganger med sterilt fosfatbufret saltvann. Cellelaget ble løsnet med trypsin og deretter ble cellene plassert i et friskt DMEM-medium. Celler ble sådd ut i 96-brønnflatbunnsplater (VWR, Radnor, PE, USA) og etter festing til bunnen av platene ble cellene behandlet med ekstrakter (100, 250 og 500 ug/mL). Celler ble inkubert i 24 timer.

Cytotoksisitetstesten ble utført med Alamar Blue-analysen (Sigma, R7017, Life Technologies, Bleiswijk, Nederland). Etter inkubering ble en resazurinløsning i en konsentrasjon på 60 uM tilsatt til brønnene, deretter ble platene plassert i en inkubator ved 37 grader i 2 timer. Etter denne tiden har fluorescens blitt målt (入=570nm). Hver ekstraktkonsentrasjon ble utført i tre replikasjoner.

3.6.3. Nøytral rød opptaksanalyse

Neutral Red Uptake Assay er den andre testen som brukes til å bestemme cytotoksisiteten til PRE, PGE, KTE, CTE og GGE. Først ble96-plater med flat bunn forberedt som beskrevet i forrige avsnitt. Etter 24 timers eksponering av cellene for ekstraktene, ble de aspirert og erstattet med nøytralt rødt fargestoff (40 ug/ml) og inkubert i 2 timer. Etter denne tiden ble cellene vasket med fosfatbufret saltvann. I neste trinn ble avfargingsbuffer (150 μL) tilsatt brønnene. Deretter ble opptak av nøytral rød dve bestemt ved å måle den optiske tettheten (OD) ved 540 nm. Hver ekstraktkonsentrasjon ble utført i tre replikasjoner.

3.7. Bestemmelse av solbeskyttelsesfaktor (in vitro)

Solbeskyttelsesfaktoren (SPF) ble bestemt ved å måle absorbansen til en vandig løsning av ekstrakter i konsentrasjoner på 10 ug/mL og 50 ug/mL, innenfor bølgelengdeområdet fra 290 til 320 nm med 5-nm-intervaller. Fra de oppnådde resultatene ble SPF beregnet fra Mansur-ligningen [90]: hvor∶ EE（λ）—erytemisk effektspektrum, I（入）—solintensitetsspektrum, ABS（入）—absorbansen av solkremproduktet, CF— korreksjonsfaktor (=10), E（N）×I（λ）—verdier bestemt av Sayre ble brukt [91].

3.8. Transepidermalt vanntap (TEWL) og målinger av hudhydrering

TEWL- og hudhydreringsmålinger ble utført med en TEWAmeter TM 300-probe og Corneometer CM 825-sonde koblet til en MPA-adapter (Courage plus Khazaka Electronic, Köln, Tyskland). Fem frivillige deltok i studien. På underarmen. hud, seks områder (2 × 2 cm i størrelse) ble markert. En mengde på 0,2 mL av de testede planteekstraktene ble påført fem steder, den sjette plassen var kontrollen (ikke behandlet med noen prøver) Etter 60 og 360 min. , ble hydreringsnivået og TEWL-målinger tatt. Det endelige resultatet var det aritmetiske gjennomsnittet (fra hver frivillig) av fem uavhengige målinger (hudhydrering) og 20 målinger (TEWL).

3.9.Forberedelse av modellkosmetikk (sminkefjerner) som inneholder ekstrakter

En modellkosmetikk (sminkefjerner) ble utarbeidet. Alle komponentene som ble brukt var i tråd med EcoCert- og COSMOS-kravene. Formuleringen er vist i tabell 7.

Produktet ble fremstilt ved å blande ingrediensene (fra punkt 1 til punkt 6) ved romtemperatur inntil en homogen væske ble oppnådd. I det siste trinnet ble pH i formuleringen justert. Sminkefjerneren ble delt opp i porsjoner. En mengde på 1 % av stamløsningene av ekstraktet ble tilsatt til hver porsjon og blandet grundig.

3.10. Bestemmelse av fargeparametrene for ekstrakter og kosmetikk (sminkefjernere) som inneholder ekstrakter

Prøver av ekstrakter og kosmetikk med ekstrakter ble testet ved romtemperatur, 48 timer etter tilberedning. ET CHROMA METER CR-400(Konica Minolta, Sensing Inc., Tokyo, Japan) ble brukt til å evaluere fargeparametrene (CIELAB-koordinater). CIELAB-systemet ble definert av den internasjonale belysningskommisjonen i 1978. Det er basert på tre fargeattributter: L*, a*,b, hvor L* er en lysstyrkevariabel proporsjonal med verdien i Munsell-systemet, og a* og b* er kromatiske koordinater. a*- og b*-koordinatene indikerer posisjoner på henholdsvis rød/grønn og gul/blå akse ( pluss en=rød, -a=grønn; pluss b=gul, - b =blå).

Basert på dataene som ble oppnådd: L*, a* og b*, ble følgende fargeparametere beregnet: kroma (C*) og fargetone (h). Følgende ligninger ble brukt:

4. Konklusjoner

Basert på de oppnådde resultatene kan det konkluderes med at de testede planteekstraktene viser flere positive egenskaper, takket være hvilke de kan brukes i produksjon av kosmetikk som deres trygge og bioaktive ingrediens. Det har vist seg at disse plantene er en rik kilde til polyfenoler, noe som gir dem antioksidantegenskaper. PRE viste best evne til å rense frie radikaler, noe som sannsynligvis er fordi den inneholder flest polyfenoler sammenlignet med andre planter. PGE og PRE viste den beste evnen til å redusere ROS-produksjon i celler. Planter viser dessuten ingen cytotoksisk aktivitet. Alle testede ekstrakter viste en hemmende effekt på elastase- og kollagenase-enzymene, med P. granatum og GGE som hadde den største hemmende effekten. Dette kan tyde på at disse plantene kan brukes i kosmetikk som stoffer som bremser aldringsprosessene. Dessuten indikerer de oppnådde resultatene at disse plantene har anti-inflammatoriske egenskaper. I dette tilfellet så CTE og KTE ut til å være best. KTE og PGE viste en beskyttende effekt mot UV-stråling, selv ved lave konsentrasjoner. Ved høyere konsentrasjoner hadde alle planter en UV-beskyttende effekt. Videre hadde plantene en positiv effekt på hudens fuktighet og reduserte transepidermalt vanntap. PRE-, KTE- og CTE-ekstrakter kan brukes som effektive fargestoffer i kosmetikkprodukter. Modellvæsken for sminkefjerning som inneholdt de ovennevnte ekstraktene var preget av en intens og stabil farge over tid. Fargen på kosmetikk med PGE- og GGE-ekstrakter kan bare merkes av erfarne observatører, og de skiller seg ikke vesentlig fra den blanke kosmetiske prøven, uten tilsetning av ekstraktet. Tatt i betraktning alle de oppnådde resultatene, kan det konkluderes med at Papaver rhoeas, Clitoria ternatea og Carthamus tinctorius med hell kan brukes som kilder til gule, oransje, blå og lilla fargestoffer i produksjon av kosmetikk som vil være trygge å bruke, og, hva mer, vil ha en positiv effekt på huden.

Denne artikkelen er hentet fra Molecules 2022, 27, 922. https://doi.org/10.3390/molecules27030922 https://www.mdpi.com/journal/molecules