FOXO regulerer uttrykket av antimikrobielle peptider og fremmer fagocytose av hemocytter i antibakteriell immunitet for reker

Abstrakt

Virvelløse dyr er avhengige av medfødt immunitet, inkludert humoral og cellulær immunitet, for å motstå patogen infeksjon. Tidligere studier viste at gaffelboks-transkripsjonsfaktor O (FOXO) deltar i slimhinneimmunresponsene til pattedyr og den humorale immunreguleringen av invertebrater. Hvorvidt FOXO er involvert i systemisk og cellulær immunitetsregulering hos virvelløse dyr er fortsatt ukjent. I denne studien identifiserte vi en FOXO fra reker (Marsupenaeus japonicus) og fant at den ble uttrykt ved relativt basale nivåer i normale reker, men ble oppregulert betydelig i reker utfordret av Vibrio anguillarum. FOXO spilte en kritisk rolle i å opprettholde hemolymfe og intestinal mikrobiota homeostase ved å fremme uttrykket av Relish, transkripsjonsfaktoren til immunsvikt (IMD)-veien for ekspresjon av antimikrobielle peptider (AMP) i reker. Vi fant også at patogeninfeksjon aktiverte FOXO og induserte dens nukleære translokasjon ved å redusere serin/treoninkinase AKT-aktivitet. I kjernen regulerte aktivert FOXO direkte uttrykket av mål-Amp- og Relish-genene mot bakteriell infeksjon. Videre ble FOXO identifisert som involvert i cellulær immunitet ved å fremme fagocytose av hemocytter gjennom å oppregulere ekspresjonen av den fagocytotiske reseptorfangerreseptoren C (Src), og to små GTPaser, Rab5 og Rab7, som er relatert til fagosomhandel til lysosomet i cytoplasmaet. Samlet indikerte resultatene våre at FOXO utøver sine effekter på homeostasen til hemolymfe og den enteriske mikrobiotaen ved å aktivere IMD-banen i normale reker, og direkte eller indirekte fremme AMP-ekspresjon og forsterke fagocytose av hemocytter mot patogener i bakterieinfiserte reker. Denne studien avslørte de forskjellige funksjonene til FOXO i slimhinnen (lokal) og systemisk antibakteriell immunitet til virvelløse dyr.

cistanche supplement fordeler-hvordan styrke immunforsvaret

Klikk her for å se Cistanche Enhance Immunity-produkter

【Be om mer】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Introduksjon

Gaffelboksens transkripsjonsfaktor O-familieproteiner (FOXOs) er involvert i ulike kritiske biologiske prosesser av organismer, inkludert cellesyklusregulering, reparasjon av skadet DNA, anti-kreftimmunitet og levetidsregulering [1,2]. Pattedyr har fire forskjellige FOXO-proteiner (FOXO1, FOXO3, FOXO4 og FOXO6); virvelløse dyr har imidlertid bare én FOXO, som også er kjent som Daf-16 i Caenorhabditis elegans [3]. Transkripsjonsaktiviteten til FOXO er regulert av flere typer post-translasjonelle modifikasjoner, som fosforylering, acetylering, metylering og ubiquitinering [4]. Disse modifikasjonene påvirker FOXO-kjernetranslokasjon eller utgang fra kjernen, og dens interaksjon med co-repressorer og co-aktivatorer, som kan fremme eller redusere FOXO-aktivitet og formidle dens forskjellige biologiske funksjoner [5,6]. Etter aktivering deltar FOXO i mange fysiologiske funksjoner ved å regulere transkripsjonen av en rekke målgener [7]. FOXOs aktiveres av ulike ekstracellulære stimuli, inkludert vekstfaktorer, cytokiner og hormoner [8]. Vekstsignaler, som insulin eller insulinlignende vekstfaktor 1 (IGF-1), samhandler med reseptorer i insulinbanen og aktiverer fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K)-signalering, noe som fører til fosforylering av FOXO av serin/treoninkinase, proteinkinase B (AKT) [9]. Fosforylert FOXO translokerer fra kjernen til cytosolen, eller forhindrer dens translokasjon fra cytosol til kjernen, hvor den blir ubikvitinert, noe som fører til dens nedbrytning av proteasomet [10]. Derimot, i fravær av eksterne vekstsignaler, er PI3K-AKT-signalveien inaktiv, og ufosforylert FOXO translokerer inn i kjernen for å fremme målgentranskripsjon [11]. FOXO deltar også i de antibakterielle og anti-virus medfødte immunresponsene til virvelløse dyr [12,13]. Kronisk aktivering av FOXO i de aldrende tarmene til Drosophila undertrykker uttrykket av peptidoglykangjenkjenningsprotein SC2 (en negativ regulator av immunsvikt (IMD)-veien) og bryter intestinal immunhomeostase [14]. FOXO regulerer direkte antimikrobielle peptid (AMP) gener i epitelvev av ikke-infiserte Drosophila som respons på sultstress, som er uavhengig av patogen-responsive medfødte immunitetsveier [15]. Imidlertid kan patogeninfeksjon også indusere enterocytt FOXO til å gå inn i kjernen fra cytoplasmaet direkte i Drosophila-tarmen [12]. Den FOXO-avhengige reguleringen av AMP-er forekommer også i pattedyrepitelvev, noe som tyder på at dette er evolusjonært bevart hos dyr [16]. Flere studier viste at FOXOs aktiveres av patogener eller cytokinstimulering i slimhinneimmunresponser [17]. Deres translokasjon til kjernen og binding til promotere av målgenene deres stimuleres av den mitogenaktiverte protein (MAP) kinaseveien og hemmes av PI3K/AKT-veien. Målgenene til FOXOs inkluderer pro-inflammatoriske signalmolekyler, adhesjonsmolekyler og kjemokinreseptorer [17]. Hvorvidt FOXO er involvert i de systemiske immunresponsene mot patogener er fortsatt uklart. Å fremme uttrykket av AMP mot patogener er en viktig mekanisme for humoral medfødt immunitet hos virvelløse dyr [18]. I Drosophila medfødt immunitet er Toll- og IMD-veiene involvert i reguleringen av AMP-uttrykk, og AMP-er spiller viktige roller i eliminering av invaderende patogener [19–21]. I likhet med insektimmunitet, er Toll-, IMD- og Janus-kinase (JAK)/signaltransduser og aktivator for transkripsjon (STAT)-veier involvert i AMP-ekspresjonsregulering hos krepsdyr [22,23]. Hvorvidt FOXO kan regulere uttrykket av AMP uavhengig av Toll-, IMD- og JAK/STAT-veiene mot patogeninfeksjon i krepsdyr krever avklaring. I tillegg til humoral immunitet, er virvelløse dyr også avhengige av cellulær immunitet for å utføre medfødte immunitetsfunksjoner mot patogeninfeksjon. Fagocytose av hemocytter er en av de viktige mekanismene for cellulær immunitet mot patogeninfeksjon [24]. Tidligere studier har funnet at FOXO1-mediert autofagi er nødvendig for utvikling av naturlige drepeceller (NK) [25]. Dessuten er FOXO involvert i å fremme bakteriell fagocytose av nøytrofiler [26]. Selv om det ikke er spesialiserte immunceller i krepsdyr, slik som NK-celler eller nøytrofiler, kan rekehemocytter utøve systemisk medfødt immunitet mot patogen bakterieinfeksjon via fagocytose [27]. Det er imidlertid uklart om FOXO deltar i patogenfagocytose av hemocytter i reker. Reker akvakultur er en av verdens raskest voksende næringer for produksjon av animalske proteiner og har gitt et betydelig bidrag til å møte den verdensomspennende økte etterspørselen etter animalske proteiner. For tiden er den globale produksjonen av reker omtrent 4,88 millioner tonn med en verdi på rundt 39 milliarder USD [28]. Men oppdrett av et stort antall dyr sammen resulterer i betydelig dyrestress, noe som letter patogener, inkludert bakterier og virus, formering og klinisk sykdom, som resulterer i store økonomiske tap for industrien [29]. Studier av rekers immunmekanismer kan gi nye strategier for sykdomsforebygging og kontroll [30]. I denne studien identifiserte vi en FOXO i kuruma reker (Marsupenaeus japonicus). Etter knockdown Foxo-uttrykk, etter Vibrio anguillarum-utfordring, fant vi at bakteriell clearance-evne og rekers overlevelsesrate reduserte betydelig. Ytterligere studier indikerte at FOXO fremmet uttrykket av AMP-er direkte eller indirekte, og forbedret fagocytose av bakterier i rekene. De mulige mekanismene for FOXOs effekter mot patogeninfeksjon i reker ble analysert.

cistanche tubulosa-forbedre immunsystemet

Resultater

FOXO kommer til uttrykk ved basale nivåer i uutfordrede reker og er oppregulert i reker utfordret med V. anguillarum

Fra hemocytt-transkriptom-sekvensering av M. japonicus fikk vi full-lengde cDNA-sekvensen til Foxo (GenBank-aksessnummer: MW080526). Domenesammenligning viste at det forutsagte FOXO-proteinet har et Forkhead (FH)-domene, som ligner Homosapiens FOXOs inkludert FOXO1, FOXO3, FOXO4 og FOXO6, og har lignende AKT-fosforylering (S1A Fig). Resultatene av fylogenetisk analyse viste at FOXO-er ble delt inn i to klynger inkludert virveldyr og virvelløse FOXO-er, og reken FOXO ble samlet i virvelløse grenen i det fylogenetiske treet (S1B Fig). I likhet med humane FOXOer [31], har reker FOXO ekstracellulært regulert kinase (ERK) fosforyleringsmodifikasjonssteder og CREB Binding Protein (CBP) acetyleringsmodifikasjonssteder, men har ingen sir tuin 1 (SIRT1) deacetyleringsmodifikasjonssteder og c-JUN N-terminal kinase (JNK) fosforyleringsmodifikasjonssteder (S2 Fig.). Polyklonale antistoffer som gjenkjenner reker FOXO ble fremstilt ved å bruke det rekombinante FH-domenet til FOXO uttrykt i Escherichia coli (fig 1A). Analyse av vevsfordelingen til FOXO ved mRNA- og proteinnivåer viste at det ble uttrykt i alle testede vev (fig 1B). Tidsforløpet for FOXO-ekspresjon i hemocyttene og tarmene til reker utfordret av V. anguillarum ble analysert ved bruk av qPCR og western blotting. Resultatene viste at FOXO ble oppregulert i hemocyttene og tarmene på mRNA-nivå (fig 1C og 1D) og på proteinnivå (fig 1E og 1F). Disse resultatene antydet at FOXO er involvert i responsen på V. anguillarum-infeksjon og fikk oss til å utforske funksjonen til FOXO i rekeimmunitet.

FOXO deltar i homeostaseregulering av hemolymfen og tarmmikrofloraen hos friske reker

For å utforske funksjonen til FOXO i hemolymfe og intestinal mikroflora homeostase hos reker, ble RNA-interferens utført og bakteriemengden analysert. Resultatene viste at uttrykket av Foxo reduserte betydelig i Foxo-RNAi-reker (fig 2A og 2B). Effekter utenfor målet av Foxo RNAi ble også analysert ved å påvise uttrykket av andre Fox-familiegener (inkludert Foxk2 og Foxn3). Resultatene viste at knockdown av Foxo ikke reduserte ekspresjonsnivåene til Foxk2 eller Foxn3 (S3A – S3C Fig). Ved å bruke western blotting og fluorescerende immuncytokjemi-analyser, observerte vi videre den subcellulære distribusjonen av FOXO i tarmene og hemocyttene til reker utfordret av bakterier etter lyden av Foxo. Resultatene viste at sammenlignet med dsGfp-gruppen, sank FOXO-nivået i kjernen betydelig i Foxo-RNAi-rekene, selv om rekene var infisert av V. anguillarum (S3D–S4E' Fig.). Alle resultatene ovenfor antydet at vår Foxo RNAi-analyse spesifikt kunne dempe Foxo i hemocytter og tarmer (inkludert i cytoplasma og kjernen). Deretter analyserte vi bakteriebelastningen i hemolymfen og tarmene etter knockdown av Foxo i reker under normale forhold (uten bakteriell utfordring). Resultatene viste at antall bakterier i hemolymfen og tarmene økte betydelig etter at Foxo-ekspresjonen var vellykket slått ned (fig 2C og 2D). Vi analyserte videre overlevelsesraten til Foxo-RNAi-reker uten bakteriell utfordring, og resultatene viste at overlevelsesraten til Foxo-knockdown-reker reduserte betydelig sammenlignet med kontrollen (fig 2E). For ytterligere å verifisere disse resultatene, analyserte vi overlevelsesraten til Foxo-RNAi-reker behandlet med antibiotika, og resultatene viste at sammenlignet med dsGfp-gruppen, ble overlevelsesraten til de bakteriefrie rekene ikke signifikant redusert (fig 2F). Alle resultatene antydet at FOXO spiller en rolle i homeostasen til in vivo mikrobiota (inkludert hemolymfe og enterisk mikrobiota) i reker under normale forhold.

cistanche supplement fordeler-øke immunitet

FOXO deltar i reguleringen av hemolymfe og intestinal mikroflora homeostase ved å fremme Relish og Amp uttrykk i sunne reker

Tidligere studier viser at sunne reker inneholder lave, men stabile antall bakterier i den sirkulerende hemolymfen, og høye om enn konstante mengder bakterier i mage-tarmkanalen, og immuneffektorene, som antimikrobielle peptider (AMP) regulert av kjernefaktoren kappa B (NF) -κB)-vei og reaktive oksygenarter (ROS) regulert av den doble oksidase- (DUOX)-banen, spiller en viktig rolle i homeostase-hemolymfe og tarmmikrobiota [32–34]. For å utforske mekanismen for FOXOs involvering i reguleringen av hemolymfe og tarmmikroflora-homeostase under normale forhold, oppdaget vi først den subcellulære distribusjonen av FOXO i hemocytter og tarmer under normale forhold. Resultatene viste et svakt signal av FOXO i kjernene til rekehemocytter og tarmceller under normale forhold (Fig 3A og 3B), noe som tyder på at litt FOXO ble aktivert av in vivo mikrobiota i reker under normale forhold. AMP-uttrykk reguleres av IMD-veien i tarmene til Drosophila [35]. Derfor antok vi at transkripsjonsfaktoren Relish kan være et målgen til FOXO. Vi oppdaget mRNA-ekspresjonen til Relish, transkripsjonsfaktoren til IMD-banen, i rekehemocytter og tarmer etter knockdown av Foxo. Resultatene viste at Relish-uttrykket reduserte betydelig i Foxo-knockdown-reker (fig 3C og 3D), og lignende resultater ble oppnådd på proteinnivå (fig 3E og 3E'). Resultatene antydet at FOXO kunne fremme uttrykket av Relish og aktivere IMD-veien. For å bekrefte at FOXO deltar i hemolymfe- og gastrointestinale homeostase gjennom IMD-signalering, ble bakteriefrie reker oppnådd (fig 3F) og RELISH-aktivering og AMP-ekspresjon ble oppdaget. Sammenlignet med det i kontrollen, reduserte mengden av FOXO og RELISH i kjernene til tarmceller og hemocytter betydelig (fig 3G og 3H). I mellomtiden ble uttrykket av AMP-er, inkludert Crustins (CrusI-2 til 5) og anti-lipopolysakkaridfaktorer (Alf A1, B1, C1, D1 og E1), muligens regulert av FOXO og/eller RELISH, screenet i kimen -fri reker, og resultatene viste at ekspresjonen av CrusI-3, Alf-B1 og Alf-C1 reduserte signifikant i hemocytter og tarmer til reken (fig 3I og 3J). Gitt at uttrykket av Alf-B1 og Alf C1 ble regulert av IMD-banen [36], antydet disse resultatene at FOXO deltar i reguleringen av homeostase av hemolymfen og mage-tarmkanalen under normale forhold gjennom IMD-banen for å fremme uttrykket av AMP-er.

Fig 1. FOXO ble oppregulert i reker utfordret av V. anguillarum. (A) Rekombinant ekspresjon av FH-domenet til FOXO i E. coli og western blotting for å påvise FOXO ved bruk av polyklonale antistoffer mot FOXO fremstilt i kaniner. Bane 1, de totale proteinene til E. coli med Foxo-pGEX4T-1. Bane 2, de totale proteinene til bakteriene etter IPTG-induksjon. Bane 3, renset rekombinant FOXO. Bane 4, FOXO i tarmene til ubehandlede reker ble påvist ved bruk av western blotting. M, Proteinmolekylmassemarkører. (B) Vevsfordelingen av Foxo ved mRNA (øvre panel) og protein (nedre panel) nivåer ble påvist ved henholdsvis RT-PCR og western blotting. ACTB er forkortelsen for -actin. (C, D) mRNA-ekspresjonsmønstrene til Foxo i hemocytter (C) og tarmer (D) ble analysert med qPCR ved å bruke geometrisk gjennomsnittlig uttrykk for -aktin og Ef-1 som endogene kontrollgener. (E, F) Proteinekspresjonsmønstrene til FOXO i hemocytter (E) og tarmer (F) ble oppdaget ved western blotting. Resultatene av den statistiske analysen av tre replikater ble vist i de nedre panelene. Båndene på western blotet ble digitalisert ved hjelp av ImageJ-programvare ved å skanne båndene fra tre uavhengige repetisjoner. Relative ekspresjonsnivåer av FOXO/-aktin ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD, og ​​verdien av kontrollreken ble satt til én. Feilfelt i figuren indikerer SD-er (tre replikater).

FOXO aktiveres i reker av V. anguillarum-utfordringen og deltar i patogenelimineringen av hemolymfen og tarmene

Det er rapportert at FOXO kan aktiveres ved bakteriell eller cytokinstimulering og translokeres til kjernen for å regulere uttrykket av visse målgener hos pattedyr [17]. For å oppdage om FOXO ble aktivert i reker utfordret av bakterier, ble den subcellulære fordelingen av FOXO i tarmene til rekene analysert ved hjelp av western blotting. Resultatene viste at mengden FOXO i cytoplasmaet til tarmceller avtok gradvis fra 2 til 4 timer etter V. anguillarum-utfordring (fig 4A). I motsetning til dette økte mengden av FOXO i kjernen av tarmceller betydelig etter infeksjon med V. anguillarum (fig 4B). For å analysere rollen til FOXO i systemisk immunitet, ble en fluorescerende immuncytokjemisk analyse brukt for å observere den nukleære translokasjonen av FOXO i hemocytter av reker 2 timer etter V. årlig larum-stimulering. Vi fant at bakteriell utfordring-indusert FOXO-translokasjon inn i kjernen økte betydelig, men det var ingen åpenbar endring i PBS-utfordret reker (fig 4C og 4C'). For å utforske om den kjernefysiske translokerte FOXO er involvert i patogenclearning, analyserte vi bakteriebelastningen i hemolymfen og tarmene i Foxo-knockdown-reker 6 timer etter bakteriell utfordring. Vi fant at etter knockdown av Foxo, økte bakteriebelastningen i hemolymfen og tarmene betydelig sammenlignet med den i kontrollgruppene (fig 4D). Videre reduserte overlevelsesraten for Foxo-knockdown-reker infisert med V. anguillarum betydelig sammenlignet med kontrollen (fig 4E). Disse resultatene indikerte at FOXO ble aktivert i enteriske celler og hemocytter, og antydet at FOXO deltar i lokale og systemiske immunresponser mot bakteriell infeksjon.

Fig 2. FOXO deltar i den intestinale (lokale) og systemiske antibakterielle immunresponsen. (A, B) Effektivitet av Foxo-RNAi i hemocytter (A) og tarmer (B) av reker, bestemt ved bruk av qPCR (A) og western blotting (B). qPCR-datoanalysen ved bruk av geometrisk gjennomsnittlig uttrykk for -aktin og Ef-1 som endogene kontrollgener. Feilfelt viser SD-er. (C) Påvisning av hemolymfebakterier av Foxo-knockdown-reker ved solid LB-kultur (tre repetisjoner); dsGfp-injeksjon ble brukt som kontroll. Fortynningsforholdet var 1:10. (D). Antall bakterier i hemolymfen og tarmene i Foxo knockdown-reker og dsGfp-injeksjonsreker uten bakteriell utfordring. (E). Overlevelsesraten til Foxo-RNAi reker uten bakteriell utfordring. dsGfp-injeksjon ble brukt som kontroll. (F). Overlevelsesraten for Foxo-RNAi-reker behandlet med antibiotika. dsGfp-injeksjon ble brukt som kontroll. Normal: villtype reker ikke behandlet med antibiotika.

Fig 3. En basal mengde FOXO translokerer inn i kjernene til hemocytter og tarmceller fremmer Relish-ekspresjon og aktiverer deretter IMD-veien for å regulere hemolymfe og tarmmikrobiota-homeostase under normale forhold. (A) Immunocytokjemi ble brukt til å oppdage den subcellulære distribusjonen av FOXO i hemocyttene til normale reker. Målestokk=20 μm. Cy: Cytoplasma; Nu: Kjerne. (B) Western blotting ble brukt for å oppdage den subcellulære distribusjonen av FOXO i tarmceller fra normale reker og V. anguillarum-infiserte reker. (C) Uttrykket av Relish på mRNA-nivå ble påvist i hemocytter av reker etter knockdown av Foxo ved qPCR ved bruk av geometrisk gjennomsnittlig uttrykk for -aktin og Ef-1 som endogene kontrollgener. (D) Ekspresjonen av Relish på mRNA-nivå i tarmen til reker etter knockdown av Foxo ble oppdaget ved qPCR ved bruk av geometrisk gjennomsnittlig uttrykk for -actin og Ef-1 som endogene kontrollgener. (E) RELISH-nivået ble oppdaget ved bruk av western blotting i reker etter knockdown av Foxo. (E') Tre replikater av panel E ble digitalisert ved bruk av ImageJ-programvare. (F) Bakteriebelastningen av hemolymfe og tarm i reker 24 timer etter antibiotikabehandling. (G) FOXO i kjernen ble påvist ved bruk av western blotting i hemocytter og tarmer av reker 24 timer etter behandling med antibiotika. (H) RELISH i kjernen ble oppdaget ved bruk av western blotting i rekehemocytter og tarmer 24 timer etter behandling med antibiotika. (I, J) Ekspresjonen av Amps i hemocytter (I) og tarmer (J) av kimfrie reker ble bestemt ved qPCR ved å bruke -actin og Ef-1 som interne referansegener. Normale reker (H2O-injeksjon) ble brukt som kontroll.

Tidligere studier indikerte at FOXO-transkripsjonsaktivitet reguleres av fosforyleringsmodifikasjon og at serin/treoninkinasen AKT regulerer aktiviteten til Forkhead-transkripsjonsfaktorer ved å fosforylere dem og hemme deres uklare translokasjon [9,37]. For å undersøke om økningen av FOXO i kjernen etter patogen bakterieinfeksjon påvirkes av AKT, oppdaget vi først innholdet av FOXO i cytoplasma og kjerne ved western blotting etter knockdown av Akt av reker. Resultatene viste at mengden FOXO i kjernen til hemocytter og tarmceller økte betydelig etter knockdown av Akt-ekspresjon (fig 5A og 5B) i reker 2 timer etter infeksjon med V. anguillarum (fig 5C og 5C'). For å verifisere de eksperimentelle resultatene brukte vi også en immuncytokjemianalyse for å observere den subcellulære fordelingen av FOXO i hemocyttene til reker etter knockdown av Akt. Resultatene viste at FOXO ble betydelig økt i kjernen til hemocytter når Akt har slått ned 2 timer etter infeksjon med V. anguillarum (fig 5D og 5D'). For å undersøke om patogeninfeksjonen påvirker AKT-aktivitet, oppdaget vi fosforyleringsendringen av AKT etter patogeninfeksjon ved bruk av et humant p-AKT (Ser473) antistoff (fosforyleringsstedet til reke AKT er Ser486) og fant at nivået av fosforylert AKT sank betydelig i hemocytter og tarmer av reker etter 30 min med V. anguillarum-infeksjon (fig 5E og 5F). Disse resultatene antydet at patogeninfeksjon kan redusere nivået av den fosforylerte AKT, som hemmer enzymaktiviteten og reduserer AKTs evne til å fosforylere FOXO. Den ikke-fosforylerte FOXO kommer inn i kjernen og induserer ekspresjonen av målgenene. figuren indikerer SD-er.

cistanche ekstrakt

Patogeninfeksjon reduserer aktiviteten til AKT og induserer FOXO nukleær translokasjon

FOXO utøver immunforsvar mot invaderende bakterier ved å regulere uttrykket av antimikrobielle peptider i reker infisert av bakterier

For å utforske mekanismen som FOXO påvirker responsen mot bakteriell infeksjon i reker, identifiserte vi først immuneffektorgenene regulert av FOXO. Etter den vellykkede knockdownen av Foxo i hemocytter og tarmer hos reker med eller uten V. anguillarum-utfordring, reduserte ekspresjonsnivåene av CrusI-3, Alf-B1, Alf-C1 og Alf-E1 signifikant i den stillegående reken sammenlignet med med de i kontrollgruppen (fig 6A og 6B). For ytterligere å verifisere resultatene, oppdaget vi også uttrykket av fire AMP-er etter knockdown av Akt. Resultatene viste at uttrykket av de fire AMP-ene økte signifikant 6 timer etter V. anguil larum-infeksjon sammenlignet med det i kontrollgruppen (fig 6C og 6D). Sammenlignet med oppregulerte AMP-er (inkludert Alf-B1 og Alf-C1) under normal tilstand (fig 3I og 3J), ble ytterligere gen av AMP-er (CrusI-3, Alf-E1) også oppregulert i rekene infisert av V anguillarum (fig. 6A og 6B). Vår forrige studie indikerte at RELISH fremmet uttrykket av Alf-B1 og Alf-C1 i rekene [36]. Disse resultatene indikerer at FOXO direkte kan regulere AMP-uttrykk, slik som CrusI-3 og Alf-E1, uavhengig av IMD-signalveien. For å bekrefte hypotesen ble det utført en ChIP-analyse for å oppdage om FOXO kunne binde seg til promoteren til Alf-E1. Promotorsekvensen til Alf-E1 ble oppnådd (S4 Fig) og FOXO-bindingsseter ble forutsagt (Fig 6E). ChIP-resultatet viste at FOXO kunne binde seg til Alf-E1-promotoren (fig 6F). Disse resultatene antydet at FOXO også deltar i antibakteriell immunitet ved direkte å regulere uttrykket av AMP i reker.

Fig 4. FOXO translokert inn i kjernen i reker utfordret av V. anguillarum. (A, B) FOXO-fordelingsmønstrene i cytoplasma (A) og kjerne (B) til tarmceller fra reker utfordret av bakterier, analysert ved bruk av western blotting (nedre paneler av A og B). De western blotting-båndene ble digitalisert ved å bruke ImageJ-programvare ved å skanne båndene fra tre repetisjoner. De relative ekspresjonsnivåene av FOXO/-aktin eller FOXO/Histone 3 ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD, og ​​verdien av kontrollreken ble satt til én. (C) Den kjernefysiske translokasjonen av FOXO i hemocytter av reker 2 timer etter V. anguillarum-utfordring ble påvist ved bruk av fluorescerende immuncytokjemiske analyser. PBS-injeksjon ble brukt som en kontroll. Målestokk=20 μm. (C') Statistisk analyse av panel C Kolokaliseringen av FOXO og DAPI-fargede kjerner i hemocytter ble analysert med WCIF ImageJ programvare. (D) Bakterietallet i hemolymfen og tarmene til Foxo-knockdown-reker fulgte V. anguillarum-injeksjonen; dsGfp-injeksjon i reker etter bakteriell injeksjon ble brukt som kontroll. (E) Overlevelsesraten til Foxo-RNAi-reker infisert av V. anguillarum. dsGfp-injeksjon ble brukt som kontroll.

FOXO fremmer fagocytose av hemocytter mot bakterier ved å fremme SRC-ekspresjon

Tidligere studier har rapportert at FOXO interagerer direkte med promoterregionene til CXCR2 og CD11b for å regulere fagocytose av nøytrofiler hos pattedyr [26]. For å teste om FOXO er assosiert med hemocyttfagocytose i antibakteriell immunitet for reker, undersøkte vi fagocytthastigheten etter interferens med Foxo ved å bruke forskjellige metoder. Etter knockdown av Foxo var fagocytthastigheten og fagocyttindeksen til Foxo-knockdown-gruppen betydelig lavere enn de for kontrollgruppen (dsGfp) (fig 7A og 7A'). Vi brukte også flowcytometri for å kvantifisere fagocytthastigheten til hemocytter etter demping av Foxo. Resultatene viste at fagcytosehastigheten til Foxo-RNAi-gruppen også reduserte betydelig sammenlignet med den til dsGfp-gruppen (fig 7B og 7B'). For ytterligere å validere disse resultatene, undersøkte vi også fagocytthastigheten etter knockdown av Akt. Resultatene viste at sammenlignet med de fra kontrollgruppen, økte fagocytthastigheten og fagocyttindeksen signifikant (fig 7C og 7C'). Disse resultatene antydet at FOXO fremmer fagocytose av hemocytter i reker. For å utforske hvordan FOXO forbedrer hemocyttfagocytose i reker, oppdaget vi uttrykket av tidligere rapporterte gener involvert i fagocytose av reker. Scavenger reseptor klasse B (SRB) og klasse C (SRC) er rapportert å være involvert i hemocytt fagocytose [38,39]. Vi fant at mRNA-ekspresjonsnivået til Src, snarere enn Srb, reduserte betydelig etter demping av Foxo i hemocyttene og tarmene (fig 7D og 7E), mens uttrykket av Src økte betydelig etter knockdown av Akt i reker (fig 7F). Lignende resultater ble oppnådd på proteinnivå (fig 7G og 7G'). Disse resultatene antydet at FOXO fremmer hemocyttfagocytose av patogener i reker ved å fremme SRC-ekspresjon.

FOXO fremmer uttrykket av RAB5 og RAB7 under fagocytose hos reker

Tidligere studier har vist at de små GTPasene, RAB5 og RAB7, er de viktigste regulatorene for transporten av nylig endocytoserte vesikler til tidlige og sene endosomer [40]. RAB5 er en nøkkelregulator for de første fusjonshendelsene og er en markør for tidlige endosomer [41,42]. RAB7 er nødvendig for den sene fagosom-lysosom-fusjonen og er en markør for sene endosomer [43]. For å utforske om RAB5 og RAB7 er involvert i patogenclearning i reker, analyserte vi først ekspresjonsmønstrene til Rab5 og Rab7 og fant at de to små GTPasene ble oppregulert i reker utfordret med bakterier (S5A–S5D Fig). Vi analyserte videre overlevelsesraten for Rab5-RNAi og Rab7-RNAi reker etter bakteriell utfordring, og resultatene viste at overlevelsesraten for Rab5 og Rab7 knockdown reker reduserte betydelig sammenlignet med kontrollen ( S5E og S5F Fig). Disse resultatene antydet at RAB5 og RAB7 spiller viktige funksjoner i resistens mot bakterielle patogener. For å undersøke om RAB5 og RAB7 er involvert i FOXO-mediert fagocytose, undersøkte vi mRNA-ekspresjonsnivåene til Rab5 og Rab7 etter interferens med Foxo-uttrykk i reker. Resultatene viste at ekspresjonsnivåene til Rab5 og Rab7 reduserte betydelig i hemocyttene og tarmene (fig 8A og S6A). mens uttrykket av Rab5 og Rab7 økte betydelig etter knockdown av Akt i reker (fig 8B). For ytterligere å bekrefte resultatene ovenfor, ble proteinnivåene til RAB5 og RAB7 i Foxo eller Akt knockdown reker også påvist. Sammenlignet med dsGfp-injeksjonsgruppen, reduserte RAB5- og RAB7-nivåene også signifikant i hemocyttene og tarmene i Foxo-knockdown-reker, men økte betydelig i Akt-knockdown-reker 2 timer etter stimulering av V. anguillarum (fig 8C–8D'; S6B og S6B'). Disse resultatene antydet at RAB5 og RAB7 deltar i FOXO-mediert fagcytose av hemocytter i reker. Vi oppdaget videre at RAB5 og RAB7 var samlokalisert med V. anguillarum i rekehemocytter (fig 9). Samlet antydet resultatene at RAB5 og RAB7 er involvert i FOXO-mediert fagocytose hos reker.

Fig 5. Patogeninfeksjon reduserte AKT-aktivitet, noe som fremmet FOXO-kjernetranslokasjon i hemocytter og enteriske celler hos reker. (A, B) Effektiviteten til Akt-RNAi i hemocyttene og tarmene til reker, bestemt ved qPCR ved bruk av geometrisk gjennomsnittlig uttrykk for -aktin og Ef-1 som endogene kontrollgener (A) og western blotting (B). (C) Mengden FOXO i cytoplasma og tarmkjernen fra Akt-knockdown-reker ble analysert ved western blotting. dsGfp ble brukt som en kontroll. (C') Den statistiske analysen av panel (C). ImageJ-programvare ble brukt til å digitalisere båndene ved å skanne bilder med tre gjentakelser. (D) Den kjernefysiske translokasjonen av FOXO i hemocytter av Akt-knockdown-reker ble oppdaget 2 timer etter V. anguillarum-utfordring ved bruk av en fluorescerende immuncytokjemisk analyse. dsGfp ble brukt som en kontroll. Målestokk=20 μm. (D') Statistisk analyse av (D). WCIF ImageJ-programvaren ble brukt til å analysere samlokaliseringen av fluorescensintensitetsforholdet til anti-FOXO (grønn) og DAPI-farget kjerne (blå) i hemocytter etter fiksering av eksponeringsverdien. (E, F) Innholdsendring av fosforylert AKT (p-AKT) i hemocytter (E) og tarmer (F) hos reker utfordret av V. anguillarum. De nedre panelene er digitaliserte figurer av (E) og (F) basert på henholdsvis western blotting og statistisk analyse.

Cistanche te

Diskusjon

FOXO, som en svært viktig transkripsjonsfaktor, deltar i mange fysiologiske og metabolske funksjoner [44,45]. I denne studien identifiserte vi en FOXO fra reker (M. japonicus) og fant at den deltar i reguleringen av homeostase av hemolymfen og enterisk mikrobiota ved å regulere AMP-uttrykk under normale forhold. FOXO kan aktiveres ved bakteriell infeksjon i reker og translokeres inn i kjernen, hvor den regulerer direkte og indirekte (ved IMD-vei) uttrykket av AMP. FOXO oppregulerte ekspresjon av fagocytose-relaterte gener, slik som SRC og små GTPaser, RAB5 og RAB7, for å fremme hemocyttfagocytose mot patogener. Derfor spiller reker FOXO forskjellige roller i systemiske og lokale (enteriske) immunresponser mot patogener (fig 10). Sammenlignet med humane FOXOer, har reker FOXO en relativt konservert aminosyresekvens og AKT-fosforyleringssteder; Imidlertid er det andre AKT-fosforyleringsstedet til reke FOXO treonin i stedet for serin. AKT-fosforylering av FOXO kontrollerer den nukleære og cytoplasmatiske transporten av FOXO [9]. I denne studien fant vi at AKT er relatert til kontrollen av FOXOs kjernefysiske inntreden. Etter V. anguillarum-infeksjon ble nivået av fosforylert AKT betydelig redusert, noe som indikerte at AKT-aktiviteten ble redusert i patogeninfiserte reker, og dermed økte kjernefysisk retensjon eller kjernefysisk translokasjon av FOXO, og deretter induserte ekspresjonen av målgener, som Relish og Amp, for å motstå patogeninfeksjon. Tidligere studier har funnet at FOXO deltar i homeostasen til Drosophila tarmmikroflora ved å undertrykke uttrykket av peptidoglykangjenkjenningsprotein SC2 (den negative regulatoren av IMD-veien) for å aktivere veien for AMP-ekspresjon [14]. RELISH ble rapportert som et nøkkelmålgen for FOXO i kontrollen av hypoksi-toleranse hos Drosophila [46]. Som andre dyr, inneholder rekers mage-tarmkanal relativt høy og konstant mikrobiota. Økende bevis viser også at hemolymfen til enkelte vannlevende sunne virvelløse dyr, inkludert reker, også inneholder stabile mengder bakterier [47]. Vår forrige studie fant at et C-type lektin deltar i homeostase-reguleringen av hemolymfemikrobiota ved å opprettholde uttrykket av AMP-er [34], men vi vet ikke hvilke signalveier som er involvert i reguleringen av AMP-uttrykk. Her antydet resultatene våre at FOXO er involvert i reguleringen av hemolymfe og enterisk mikroflora homeostase gjennom IMD-signalering under normale forhold. Hos uinfiserte reker resulterte knockdown av Foxo i betydelig redusert ekspresjon av Relish, og rekenes overlevelsesrate sank betydelig, selv uten bakteriell infeksjon. Vi fant også en liten mengde FOXO i kjernen til normale rekeceller. Derfor tror vi at FOXO deltar i homeostasereguleringen av hemolymfe og enterisk flora under normale forhold ved å fremme Relish-uttrykk og deretter forbedre AMP-uttrykk ved IMD-veien. Disse resultatene antydet at FOXO deltar i lokal og systemisk immunitet for å fremme mikrobiota homeostase av hemolymfen og mage-tarmkanalen hos reker. Humoral immunitet spiller en kritisk rolle i motstanden mot patogeninfeksjon i omvendte hastigheter via produksjonen av et batteri av AMP-er [21,48]. Den humorale responsen omfatter induserbar syntese og sekresjon av AMP-er, som frigjøres til hemolymfen som en systemisk respons, eller frigjøres til den epidermale overflaten eller hulrommet i mage-tarmkanalen som en lokal respons [19]. AMP-uttrykk er hovedsakelig regulert av Toll/Dif og IMD/Relish signalveier i fruktfluer [49]. For tiden har flere familier av AMP-er blitt identifisert i reker, inkludert krustin, anti-lipopolysakkaridfaktorer (Alfs) og penaeidiner [50]. Denne studien viste at FOXO direkte eller indirekte (gjennom IMD/Relish-signalering) kan regulere uttrykket av AMP-er, inkludert CrusI-3, Alf-B1, Alf-C1 og Alf-E1. Vi trodde at lav aktivering av FOXO i hemocyttene og tarmene til reker under normale forhold kunne regulere nøkkelmålgenet til Foxo, dvs. Relish, for å opprettholde homeostasen til in vivo mikrobiota. Under infeksjon aktiverer de invaderende patogenene FOXO, hvorav det meste blir translokert inn i kjernen, hvor det regulerer flere målgener, inkludert noen AMP-er, som Alf-E1 og CrusI-3, i tillegg til Relish. Samlet deltar FOXO i reguleringen av hemolymfe og tarmmikrobiota homeostase hos friske reker via basal-nivå aktivering av IMD-signalering i hemolymfen og mage-tarmkanalen. Patogeninfeksjon aktiverer FOXO ved å redusere AKT-aktivitet og fremmer uttrykket av AMP-er direkte og indirekte i systemisk immunitet og lokal (tarm) immunitet. Fagocytose er et reseptormediert, aktin- og ATP-avhengig, fenomen som utløses av binding av partikler eller patogener til spesifikke cytomembranreseptorer, og representerer en viktig immunprosess der verten kan beskytte seg mot patogener [24]. Små GTPaser, som RAB5 og RAB7, er involvert i fortsatt membranremodellering og vesikkeltrafikk i fagocytose. Vår forrige studie rapporterte at scavenger-reseptorer SRB og SRC er involvert i hemocyttfagocytose som reseptorer i reker [38,39]. I denne studien fant vi at etter knockdown av Foxo, sank Src-ekspresjonen markant, og hemocyttfagocytosehastigheten reduserte betydelig, noe som tyder på at Src er et målgen til FOXO og at FOXO er involvert i SRC-mediert fagocytose av patogene bakterier. FOXO kan også fremme uttrykket av to små GTPaser, RAB5 og RAB7. Disse små GTPasene er involvert i sekvensiell transport av og er nøkkeldeterminantene for tidlige og sene fagosomer [51]. Fagosomer migrerer fra periferien av cellen til den intracellulære regionen, med RAB5 som erstattes av RAB7 under transport, og de endelige varene transporteres til lysosomet for nedbrytning [52,53]. Vi fant også at RAB5 og RAB7 kunne samlokalisere med patogenene i hemocytter, noe som indikerte at patogenene ble fagocytert av hemocytter i reker ved å passere gjennom tidlige og sene fagosomer før de til slutt ble nedbrutt i lysosomer. Derfor er FOXO involvert i den cellulære immunresponsen ved å fremme fagocytose av hemocytter. Avslutningsvis indikerer resultatene våre at FOXO ikke bare deltar i mikrobiota-homeostaseregulering under normale forhold, men også i fjerning av patogene bakterier i infiserte reker ved å fremme uttrykket av AMP og fagocytose av hemocytter.

Fig. 6. FOXO utfører sine antibakterielle roller i reker ved å regulere uttrykket av AMP. (A, B) Ekspresjonen av Amps i hemocytter (A) og tarmer (B) av Foxo-knockdown-reker, bestemt ved qPCR ved bruk av geometrisk gjennomsnittlig uttrykk for -aktin og Ef-1 som endogene kontrollgener; dsGfp-injeksjon i reker ble brukt som kontroll. Dataene ble analysert statistisk ved å bruke Mann-Whiteny U-testen. (C, D) Ekspresjonen av Amps i hemocytter (C) og tarmer (D) av Akt knockdown-reker ble analysert med qPCR ved bruk av geometrisk gjennomsnittlig uttrykk for -aktin og Ef-1 som endogene kontrollgener; dsGfp-injeksjon i reker ble brukt som kontroll. Signifikante forskjeller ble analysert ved bruk av enveis ANOVA. (E) Skjematisk diagram av de forutsagte bindingsstedene til FOXO på Alf-E1-promotoren. (F) ChIP og RT-PCR ble brukt til å påvise FOXO-binding til Alf-E1-promotersekvensen ved å bruke primere (Alf-E1-F og Alf-E1-R, tabell 1). RT-PCR ble også brukt til å amplifisere kodende region av Alf-E1 med RT-PCR-primere (Alf-E1-RT-F og Alf-E1-RT-R. Tabell 1) ved bruk av ChIP fått DNA som mal. IgG-antistoff ble brukt som kontroll, og det normale genomiske DNA-amplifiserte fragmentet ble brukt for å bekrefte målbåndet.

Fig. 7. FOXO forbedrer hemocyttfagocytose av patogener i reker ved å fremme SRC-ekspresjon. (A) Hemocyttfagocytose av V. anguillarum observert ved bruk av en fluorescerende immuncytokjemisk analyse under et fluorescensmikroskop. V. anguillarum ble merket med FITC (grønn) og cellekjerner ble farget med DAPI (blå). Den røde pilen indikerer de fagocytiske hemocyttene. Målestokk=20 μm. (A') Statistisk analyse av fagocytthastigheten og fagocyttindeksen i Foxo-knockdown-reker. dsGfp-injeksjonsgruppen ble brukt som kontroll. Fem hundre hemocytter ble telt under fluorescensmikroskopet i hvert eksperiment. Dataene ble analysert statistisk ved hjelp av Students t-test. (B) Bakteriell fagocytose av hemocytter analysert ved bruk av flowcytometri. De fagocyterte hemocyttene som inneholdt bakterier (R2) ble separert fra ikke-fagocyterte hemocytter (R3) basert på fluorescenssignal fra merkede bakterier i hemocytter ved å bruke programvaren IDEAS Application v6.0. (B') Fagocytthastigheten til hemocytter basert på flowcytometridataene. Tre tusen hemocytter ble talt for hver analyse og tre repetisjoner ble utført. DsGfp-gruppen ble brukt som kontroll. (C) Hemocytt fagocytose av V. anguillarum i Akt knockdown reker observere under fluorescensmikroskop. Målestokk=10 μm. (C') Statistisk analyse av fagocytthastighet og fagocyttindeks basert på data i panel (C). (D) mRNA-ekspresjonsnivået til Srb og Src i hemocytter fra Foxo knockdown-reker analysert med qPCR ved bruk av geometrisk gjennomsnittlig uttrykk for -actin og Ef-1 som endogene kontrollgener. dsGfp-injeksjon ble brukt som kontroll. (E) mRNA-ekspresjonen av Srb og Src i tarmene til Foxo-RNAi-reker analysert med qPCR ved bruk av geometrisk gjennomsnittlig uttrykk for -actin og Ef-1 som endogene kontrollgener. (F) mRNA-ekspresjonen av Src i hemocytter av Akt-RNAi-reker analysert med qPCR ved bruk av geometrisk gjennomsnittlig uttrykk for -aktin og Ef-1 som endogene kontrollgener. (G) Proteinnivået til SRC i hemocytter av Foxo-RNAi eller Akt-RNAi reker, som analysert ved bruk av western blotting. dsGfp-injeksjon brukt som kontroll. (G') Den statistiske analysen basert på data fra tre replikater av panel (G).

Materialer og metoder

Etikkerklæring

Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med Kinas nasjonale direktiver (GB 14922.2–2011 og GB 14925–2010). Kanineksperimentene for antistoffpreparering i studien ble utført i samsvar med protokoller godkjent av Animal Care & Welfare Commit tee ved Shandong University School of Life Sciences (SYDWLL-2021-54). Godkjenning i henhold til forskriften om bruk av reker i vår studie var ikke nødvendig fordi vår forskning brukte et begrenset antall vanlige reker som ofte konsumeres av det bredere samfunnet.

Dyr

Sunne reker (Marsupenaeus japonicus), som veier omtrent 6–10 g hver, ble hentet fra det akvatiske produktmarkedet i Qingdao, Shandong-provinsen, Kina. Før eksperimentet ble reker dyrket i minst 1 dag i rekekultursystemet med luftet sjøvann ved 23–25˚C for akklimatisering til det nye miljøet.

Fig. 8. RAB5 og RAB7 er involvert i FOXO-mediert fagocytose av hemocytter i reker. (A, B) qPCR ble brukt til å analysere mRNA-ekspresjonsnivåene til Rab5 og Rab7 i hemocyttene til Foxo-knockdown-reker (A) og Akt-knockdown-reker (B) med og uten bakteriell infeksjon. qPCR brukte geometrisk gjennomsnittlig uttrykk for -aktin og Ef-1 som endogene kontrollgener. (C) Proteinnivåene til RAB5 og RAB7 i hemocytter av Foxo-knockdown-reker 2 timer etter V. anguillarum-utfordring bestemt ved bruk av western blotting. (C') Den statistiske analysen basert på data fra tre replikater av panel (C). (D) Proteinnivåene til RAB5 og RAB7 i hemocytter av Akt-knockdown-reker 2 timer etter V. anguillarum-utfordring bestemt ved bruk av western blotting. (D') Den statistiske analysen basert på data fra tre replikater av panel (D).

Bioinformatisk analyse

Full-lengde cDNA-sekvensen til Foxo ble oppnådd fra hemocytt- og intestinal transkripsjontomesekvensering av M. japonicus (BGI, Shenzhen, Kina). Den åpne leserammen (ORF) til Foxo ble amplifisert ved å bruke et par primere (Foxo-EX-F og Foxo-EX-R; Tabell 1) for sekvensbekreftelse. Det tilsvarende cDNA ble konseptuelt oversatt for å oppnå den utledede proteinsekvensen ved å bruke ExPASy-Translation-verktøyet (http://cn.expasy.org/). Likhetsanalyse ble utført ved bruk av BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/), og domenearkitekturprediksjonen ble utført ved bruk av SMART (http://smart.emblheidelberg.de). Et fylogenetisk tre av FOXOs fra forskjellige arter ble konstruert ved å bruke MEGA 6.0-programmet [54].

Fig 9. RAB5 og RAB7 samlokaliseres med V. anguillarum. Samlokaliseringen av RAB5 og RAB7 med FITC merket-V. anguillarum i rekehemocytter, som analysert ved bruk av en fluorescerende immuncytokjemisk analyse. Bakteriene ble merket med FITC (grønn) og injisert i reker. Hemocytter ble samlet fra fem reker 30 minutter og 1 time etter bakteriell injeksjon og inkubert med anti-RAB5- eller anti-RAB7-antistoffer. Det sekundære antistoffet var antikanin IgG Alexa-546 (rød). Kjerner ble farget med DAPI (blå). Samlokalisering i hemocytter er indikert med hvite piler. Målestokk=10 μm.

Fig. 10. Skjematisk fremstilling av FOXO-engasjement i lokal og systemisk medfødt immunitet hos reker. (A) Under uinfiserte forhold opprettholder FOXO homeostasen til hemolymfen og tarmmikrobiotaen ved å fremme Relish og deretter AMP-uttrykk. (B) Under infiserte forhold reduseres AKT-fosforylering ved patogeninfeksjon, noe som resulterer i økning av FOXO-innhold i kjernen. FOXO fremmer direkte uttrykket av Relish og AMPs for å eliminere invasive patogener; på den annen side fremmer FOXO fagocytose av patogener gjennom SRC-mediert fagocytose-vei.

Bakterieutfordring og prøvesamling

Vibrio anguillarum (ATCC 43305) hentet fra Marine College, Shandong University (Wei Hai, Kina) og nå bevart i laboratoriet vårt. V. anguillarum ble dyrket over natten ved 37˚C i LB-medium og re-dyrket i 4 timer ved 1:100 inokulering den andre dagen. Bakteriene i logaritmisk vekstfase ble samlet ved sentrifugering ved 5000 × g i 5 minutter ved 4˚C og vasket to ganger med fosfatbufret saltvann (PBS: 10 mM Na2HPO4, 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl og 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4). V. anguillarum resuspendert i fosfatbufret saltvann for rekeutfordring. Omtrent 2 × 107 kolonidannende enheter (CFU)/reker ble injisert i magen til hver reke ved hjelp av en mikrosprøyte. Kontrollgruppen ble injisert med samme volum PBS. Hemocyttene, hjertet, hepatopankreas, gjellen, magen og tarmene ble samlet fra minst tre reker for RNA- og proteinekstraksjon. For hemocyttinnsamling ble hemolymfen ekstrahert fra den ventrale sinus ved bruk av en sprøyte forhåndslastet med 0,8 ml antikoagulantbuffer (10 % natriumsitrat), og deretter raskt sentrifugert ved 700 × g i 8 minutter ved 4˚C for hemocyttisolering.

RNA- og proteinekstraksjon, og cDNA-syntese

Totalt RNA ble ekstrahert fra hemocyttene og forskjellige organer av reker ved å bruke TRIzol (ET101, Transgen, Beijing, Kina). Proteiner fra de forskjellige organene ble ekstrahert ved hjelp av Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) Lysis Buffer (P0013B, Beyotime, Jiangsu, Kina). Første streng cDNA-syntese ble utført ved bruk av et cDNA-syntesesett (5x All-in-One RT MasterMix; Applied Biological Materials-abm, Vancouver, Canada), etter produsentens instruksjoner.

Tabell 1. Sekvenser av primere brukt i denne studien.

MasterMix; Applied Biological Materials-abm, Vancouver, Canada), etter produsentens instruksjoner.

Rekombinant ekspresjon og antistoffpreparering

cDNA-sekvensen til Foxo ble amplifisert ved revers transkripsjonspolymerasekjedereaksjon (RT-PCR) ved bruk av primere Foxo-EX-F og Foxo-EX-R (tabell 1). De rensede PCR-produktene ble deretter fordøyd ved bruk av restriksjonsenzymer og ligert inn i plasmid pGEX-4T-1 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). og de konstruerte plasmidene ble transformert inn i Escher ichia coli Rosseta (DE3) celler. Proteinekspresjon ble indusert ved bruk av 1 mM isopropyl- - D-tio galaktopyranosid ved 37˚C. De rekombinante proteinene ble utsatt for affinitetskromatografi ved bruk av glutation (GST) harpiks (C600031, BBI, Shanghai, Kina), etter produsentens instruksjoner. Kaninantisera mot FOXO ble fremstilt i henhold til en tidligere beskrevet metode [55].

Western blotting

Proteinene ekstrahert fra forskjellige organer eller hemocytter ble separert ved bruk av 10% natriumdodecylsulfat polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). Proteinene i SDS-PAGE-gelene ble overført til en cellulosenitratmembran ved bruk av overføringsbuffer (25 mM Tris-HCl, 20 mM glycin, 0.037% mM SDS og 20% ​​etanol) og inkubert i 5 % skummet melk eller 3 % bovint serumalbumin (BSA) i Tris-bufret saltvann (TBS: 150 mM NaCl, 10 mM Tris HCl, pH 8,0) i 1 time med forsiktig risting ved romtemperatur. Membranene ble deretter inkubert med primært antiserum: Anti-FOXO ved en 1:100 fortynning, anti-RAB5 ved 1:25, anti Rab7 ved 1:25, anti-beta aktin (ACTB) ved 1:250 (fremstilt i vårt laboratorium ); Histon-3 polyklonale antistoffer (A2348, ABclonal, Wuhan, Kina, 1:2500); anti-fosforylerte (p)-AKT polyklonale antistoffer (WLP001a, Wanleibio, Shenyang, Kina, 1:500) og ristet forsiktig over natten ved 4˚C. Etter vask tre ganger med TBST (0,1 % Tween-20 lagt til TBS), ble membranene inkubert med sekundært antistoff (ZB2308 ZSGB-Bio, Beijing, Kina, 1:5,000) eller ( ZB2301 ZSGB-Bio, Beijing, Kina, 1:5,000) i 3 timer ved romtemperatur med forsiktig risting. De immunoreaktive proteinbåndene ble utviklet ved bruk av en nitrotetrazoliumblått klorid (A610379, BBI) og P-toluidinsalt (A610072, BBI) løsning under mørke forhold eller ved bruk av forsterket kjemiluminescens (ECL). -actin eller Histon-3 ble brukt som referanses.

Vevsfordeling og uttrykksmønstre i reker utfordret av bakterier

Vevsfordelingen av Foxo/FOXO i hemocyttene, hjertet, gjellen, sputum, magen og tarmene ble analysert ved bruk av RT-PCR med primere Foxo-F og Foxo-R (tabell 1) og ved western blotting med anti-FOXO antistoffer, hhv. PCR-prosedyren besto av en innledende inkubering ved 94 ˚C i 3 minutter; etterfulgt av 35 sykluser på 94˚C i 30 s, 50˚C i 30 s og 72˚C i 30 s; etterfulgt av 72˚C i 10 min. PCR-produktene ble analysert ved bruk av agarosegelelektroforese (1,5 % agarose). -aktingenet (-aktin-F og -aktin-R; tabell 1) ble brukt som internkontroll. Tidsforløpsekspresjonsmønstrene til Foxo/FOXO ved RNA- og proteinnivåene i reker utfordret med V. anguillarum ble analysert ved bruk av kvantitativ sanntids-PCR (qPCR) i en termisk syklus (qTOWER3, ANALYTIK JENA AG, Jena, Tyskland) og av henholdsvis western blotting. qPCR-prosedyren omfattet: 95˚C i 10 minutter; 40 sykluser ved 95˚C i 10 s og 60˚C i 50 s; og deretter en smelteperiode fra 65˚C til 95˚C. Ekspresjonsprofilene til Foxo ble produsert ved å bruke 2-ΔΔCT-metoden [56] ved bruk av det geometriske gjennomsnittet av de to interne kontrollgenene til -actin og Ef-1 for normalisering. Effektiviteten til primerparet i qPCR ble analysert etter MIQE-metoden [57] med en 10-fold logaritmisk fortynning av en cDNA-blanding for å generere en lineær standardkurve.

Isolering av nukleære og cytoplasmatiske proteiner

Tarmvevet ble dissekert fra reker og vasket i PBS tre ganger. Proteinekstraksjon ble utført ved å bruke et kjernefysisk og cytoplasmatisk proteinekstraksjonssett (R0050, Solarbio, Beijing, Kina) etter produsentens instruksjoner. Minst tre reker ble brukt til proteinekstraksjon for å eliminere individuelle forskjeller.

RNA-interferensanalyse

For å analysere genfunksjonen utførte vi RNA-interferens (RNAi) analyser. Flere par med primere som inneholder T7-promotersekvensen (Foxo-RI-F og Foxo-RI-R; Rab5-RI-F og Rab5 -RI-R; Rab7-RI- F og Rab7 -RI-R; Akt-RI-F og Akt-RI-R. Tabell 1) ble designet for å forsterke malene for dsRNA-syntese. Ved å bruke T7 RNA-polymerase (EP0111, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) og cDNA-mal, syntetiserte vi dsRNA-fragmentene. Dobbeltstrenget grønt fluorescerende protein dsGfp RNA fungerte som kontroll, som ble amplifisert ved å bruke Gfp-RI-F og Gfp-RI-R (tabell 1) som primere for dsGfp-syntese. Deretter ble dsRNA-fragmentene (50 ug/hver) injisert inn i det abdominale segmentet til M. japonicus ved hjelp av en mikrosprøyte, og en andre injeksjon ble utført 12 timer senere med samme dose. RNA-interferenseffektivitet ble analysert ved bruk av kvantitativ sanntids revers transkripsjons-PCR (qRT-PCR, omfattende revers transkripsjon av RNA for å danne cDNA, som deretter ble brukt som mal i en qPCR-analyse) eller western blotting 24 timer etter andre injeksjon. -aktin ble brukt som intern referanse.

Referanser

1. Calnan DR, Brunet A. FoxO-koden. Onkogen. 2008; 27(16):2276–2288. https://doi.org/10.1038/ onc.2008.21 PMID: 18391970.

2. Tran H, Brunet A, Grenier JM, Datta SR, Fornace AJ, DiStefano PS, et al. DNA-reparasjonsvei stimulert av gaffelhode-transkripsjonsfaktoren FOXO3a gjennom Gadd45-proteinet. Vitenskap. 2002; 296 (5567):530–534. https://doi.org/10.1126/science.1068712 PMID: 11964479.

3. Martins R, Lithgow GJ, Link W. Lenge leve FOXO: å avdekke rollen til FOXO-proteiner i aldring og langvarighet. Aldrende celle. 2016; 15(2):196–207. https://doi.org/10.1111/acel.12427 PMID: 26643314.

4. Vogt PK, Jiang H, Aoki M. Trippellags kontroll-fosforylering, acetylering og ubiquitinering av FOXO-proteiner. Cellesyklus. 2005; 4(7):908-913. https://doi.org/10.4161/cc.4.7.1796 PMID: 15917664. 5. Daitoku H, Sakamaki J, Fukamizu A. Regulering av FoxO-transkripsjonsfaktorer ved acetylering og protein-protein-interaksjoner. Bba-Mol Cell Res. 2011; 1813(11):1954–1960. https://doi.org/10.1016/j. bbamcr.2011.03.001 PMID: 21396404.

6. Wang Y, Zhou YM, Graves DT. FOXO-transkripsjonsfaktorer: deres kliniske betydning og regulering. Biomed Res Int. 2014; 2014:1–13. https://doi.org/10.1155/2014/925350 PMID: 24864265.

7. Murphy CT, McCarroll SA, Bargmann CI, Fraser A, Kamath RS, Ahringer J, et al. Gener som virker nedstrøms av DAF-16 for å påvirke levetiden til Caenorhabditis elegans. Natur. 2003; 424(6946):277– 284. https://doi.org/10.1038/nature01789 PMID: 12845331. 8. Sergi C, Shen F, Liu SM. Insulin/IGF-1R-, SIRT1- og FOXO-veier – en spennende interaksjonsplattform for bein og osteosarkom. Endokrinol foran (Lausanne). 2019; 10:93–103. https://doi.org/10. 3389/fendo.2019.00093 PMID: 30881341.

9. Brunet A, Bonni A, Zigmond MJ, Lin MZ, Juo P, Hu LS, et al. Akt fremmer celleoverlevelse ved å fosforylere og hemme en gaffelhodetranskripsjonsfaktor. Celle. 1999; 96(6):857–868. https://doi.org/10.1016/ s0092-8674(00)80595-4 PMID: 10102273.

10. Huang H, Regan KM, Wang F, Wang DP, Smith DI, van Deursen JMA, et al. Skp2 hemmer FOX01 i tumorundertrykkelse gjennom ubiquitin-mediert nedbrytning. P Natl Acad Sci USA. 2005; 102(5):1649– 1654. https://doi.org/10.1073/pnas.0406789102 PMID: 15668399.

11. Ogg S, Paradis S, Gottlieb S, Patterson GI, Lee L, Tissenbaum HA, et al. Gaffelhode-transkripsjonsfaktoren DAF-16 transduserer insulinlignende metabolske signaler og lang levetid hos C. elegans. Natur. 1997; 389 (6654):994–999. https://doi.org/10.1038/40194 PMID: 9353126.

12. Fink C, Hoffmann J, Knop M, Li Y, Isermann K, Roeder T. Intestinal FoxO-signalering er nødvendig for å overleve oral infeksjon i Drosophila. Slimhinneimmunol. 2016; 9(4):927-936. https://doi.org/10.1038/mi. 2015.112 PMID: 26627459.

13. Spellberg MJ, Marr MT. FOXO regulerer RNA-interferens i Drosophila og beskytter mot RNA-virusinfeksjon. P Natl Acad Sci USA. 2015; 112(47):14587–14592. https://doi.org/10.1073/pnas. 1517124112 PMID: 26553999.

14. Guo LL, Karpac J, Tran SL, Jasper H. PGRP-SC2 fremmer immunhomeostase i tarmen for å begrense commen sal dysbiose og forlenge levetiden. Celle. 2014; 156(1–2):109–122. https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.12. 018 PMID: 24439372.

15. Becker T, Loch G, Beyer M, Zinke I, Aschenbrenner AC, Carrera P, et al. FOXO-avhengig regulering av medfødt immunhomeostase. Natur. 2010; 463(7279):369–373. https://doi.org/10.1038/ nature08698 PMID: 20090753.

16. Seiler F, Hellberg J, Lepper PM, Kamyschnikow A, Herr C, Bischoff M, et al. FOXO-transkripsjonsfaktorer regulerer medfødte immunmekanismer i respiratoriske epitelceller. J Immunol. 2013; 190(4):1603–1613. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1200596 PMID: 23315071.

17. Graves DT, Milovanova TN. Slimhinneimmunitet og FOXO1-transkripsjonsfaktorene. Front Immunol. 2019; 10:2530–2541. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.02530 PMID: 31849924.

18. Bulet P, Stocklin R, Menin L. Anti-mikrobielle peptider: fra virvelløse dyr til virveldyr. Immunol Rev. 2004; 198:169–184. https://doi.org/10.1111/j.0105-2896.2004.0124.x PMID: 15199962.

19. Buchon N, Silverman N, Cherry S. Immunitet i Drosophila melanogaster - fra mikrobiell gjenkjennelse til fysiologi av hele organismen. Nat Rev Immunol. 2014; 14(12):796–810. https://doi.org/10.1038/nri3763 PMID: 25421701.

20. Hoffmann JA, Reichhart JM. Drosophila medfødt immunitet: et evolusjonært perspektiv. Nat Immunol. 2002; 3(2):121–126. https://doi.org/10.1038/ni0202-121 PMID: 11812988.

21. Hultmark D. Drosophila immunitet: stier og mønstre. Curr Opin Immunol. 2003; 15(1):12–19. https:// doi.org/10.1016/s0952-7915(02)00005-5 PMID: 12495727.

22. Li FH, Xiang JH. Nylige fremskritt innen forskning på den medfødte immuniteten til reker i Kina. Dev Comp Immunol. 2013; 39(1–2):11–26. https://doi.org/10.1016/j.dci.2012.03.016 PMID: 22484214.

23. Sun JJ, Lan JF, Zhao XF, Vasta GR, Wang JX. Binding av et C-type lektins coiled-coil-domene til Domeless-reseptoren aktiverer JAK/STAT-banen direkte i rekeimmunresponsen mot bakteriell infeksjon. PLoS Pathog. 2017; 13(9):e1006626. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006626 PMID: 28931061.

24. Gordon S. Fagocytose: en immunobiologisk prosess. Immunitet. 2016; 44(3):463–475. https://doi.org/ 10.1016/j.immuni.2016.02.026 PMID: 26982354.

25. Wang S, Xia PY, Huang GL, Zhu PP, Liu J, Ye BQ, et al. FoxO1-mediert autofagi er nødvendig for utvikling av NK-celler og medfødt immunitet. Nat Commun. 2016; 7:11023–11037. https://doi.org/10.1038/ ncomms11023 PMID: 27010363.

26. Dong G, Song L, Tian C, Wang Y, Miao F, Zheng J, et al. FOXO1 regulerer bakterieindusert nøytrofil aktivitet. Front Immunol. 2017; 8:1088-1102. https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01088 PMID: 28928749.

27. Wang XW, Zhao XF, Wang JX. C-type lektin binder seg til beta-integrin for å fremme hemocytisk fagocytose hos et virvelløst dyr. J Biol Chem. 2014; 289(4):2405–2414. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.528885 PMID: 24324258.

28. Norouzitallab P, Baruah K, Vanrompay D, Bossier P. Å lære reker selvforsvar for å bekjempe infeksjoner. Trender Bioteknologi. 2019; 37(1):16–19. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2018.05.007 PMID: 29914649.

29. Flegel TW. Historisk fremvekst, påvirkning og nåværende status for rekepatogener i Asia. J Invertebr Pathol. 2012; 110(2):166–173. https://doi.org/10.1016/j.jip.2012.03.004 PMID: 22429834.

30. Wang PH, Huang TZ, Zhang XB, He JG. Antiviralt forsvar hos reker: Fra medfødt immunitet til virusinfeksjon. Antivir Res. 2014; 108:129–141. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2014.05.013 PMID: 24886688.

31. Obsil T, Obsilova V. Struktur/funksjonsforhold som ligger til grunn for regulering av FOXO-transkripsjonsfaktorer. Onkogen. 2008; 27(16):2263–2275. https://doi.org/10.1038/onc.2008.20 PMID: 18391969.