Funksjonelle fragmenter av AIMP1-avledet peptid (AdP) og optimalisert hydrosol for deres aktuelle avsetning etter Box-Behnken-design

Abstrakt:

Aminoacyl-tRNA-syntetasekompleks-interagerende multifunksjonelt protein 1 (AIMP1)-avledet peptid (AdP) har blitt utviklet som en kosmetisk ingrediens for antialdring av huden gitt dens fibroblastaktiverende (FA) og melanocytthemmende (MI) funksjoner. Imidlertid var det nødvendig med en passende strategi for topisk levering av AdP på grunn av dens lavpermeable egenskaper. I denne studien ble FA- og MI-domener av AdP (henholdsvis FA-AdP og MI-AdP) bestemt ved funksjonell domenekartlegging, hvor aktivitetene til flere fragmenter av AdP på fibroblast og melanocytt ble testet, og en hydrosolbasert topisk levering system for disse AdP-fragmentene ble forberedt. Hjelpestoffsammensetningen til hydrosolen ble optimalisert for å maksimere viskositeten og tørkehastigheten ved å bruke Box-Behnken-designet. Den kunstige hudavsetningen av FA-AdP-lastet hydrosol ble evaluert ved bruk av Keshary-Chien diffusjonsceller utstyrt med Strat-M membran (STM).

Kvantifiseringen av det fluorescerende fargestoff-merket FA-AdP i STM ble utført ved nær-infrarød fluorescensavbildning. Den optimaliserte hydrosolen viste 127- ganger høyere peptidavsetning i STM enn fritt FA-AdP (p < 0.05). Dette arbeidet antyder at FA- og MI-AdP er aktive domener for henholdsvis anti-rynke- og blekingsaktiviteter, og hydrosolen kan brukes som en lovende kosmetisk formulering for levering av AdPs til huden.

Forskningen fant at jo høyere aktiviteten til tyrosinase er, jo mer melanin produseres. Overdreven produksjon av melanin kan forårsake pigmenterte hudsykdommer som fregner, kloasma, aldersflekker og melanom. Eksperimentelle data viser at når konsentrasjonen av totale glykosider av Cistanche deserticola er i området {{0}}.5-3.0mg·mL-1, er effekten på tyrosinaseaktivitet Det har en hemmende effekt, og har et godt dose-effekt forhold i området 0.5~2.0mg·mL-1, så man kan vite at Cistanche har blekende effekt.

Klikk helsemessige fordeler av cistanche

Nøkkelord:

AIMP1-derivert peptid (AdP); kosmetisk peptid; Box-Behnken design; hydrosol; lokal levering av peptider

1. Introduksjon

Hudaldring, preget av dannelse av rynker og flekkete pigmentering og ruhet og tørrhet i huden, er en komplisert biologisk prosess, forårsaket av ulike indre og ytre faktorer [1,2]. Ekstracellulær matrise (ECM), en ikke-cellulær strukturell komponent som består av ulike biomakromolekyler, er nært forbundet med aldringsprosessen til huden [3–5]. Kollagen, hovedkomponenten i hudens ECM, fragmenteres jevnt og reduseres i huden ved aldring [6,7]. Det fragmenterte kollagenet kompromitterer hudens strukturelle integritet og metabolske funksjon, og induserer rynker [8,9]. Overdreven melaninavsetning i epidermis er en annen viktig egenskap ved aldring av huden, noe som resulterer i hudpigmentering. Denne prosessen er forårsaket av uønsket aktivering av melanocytter under UV-bestråling [10,11].

Det er derfor utviklet kosmetiske ingredienser for hudanti-aldring med fokus på reduksjon av rynker og pigmentering av huden. Nylig ble ulike peptider avledet fra cytokiner og vekstfaktorer sentrum for oppmerksomheten i det kosmetiske feltet på grunn av deres anti-aldringsaktiviteter [6,12].

Aminoacyl-tRNA-syntetasekompleks-interagerende multifunksjonelle proteiner (AIMPs) er kjent for å danne multi-syntetasekomplekset (MSC) med aminoacyl-tRNA-syntetaser (ARS). Denne MSC fungerer som en avgjørende komponent i proteinoversettelsesmaskineriet [13]. Blant medlemmene av denne proteinfamilien har AIMP1 fått mye oppmerksomhet i det kosmetiske feltet gitt dens sårhelende aktivitet [14,15]. Den utskilte AIMP1 induserer kollagensyntese av fibroblaster i sårlesjonen via den ERK-avhengige banen, noe som fører til rask posttraumereparasjon [16]. Dessuten stimulerer AIMP1 mesenkymale stamceller via proteinkinase B (PKB)-mediert aktivering av -catenin og nedstrøms interaksjoner, noe som øker nivået av MSC i blodet [17].

Interessant nok tilskrives disse forskjellige ekstracellulære funksjonene til AIMP1 de forskjellige regionene i strukturen. For eksempel fremmer dette proteinet spredningen av fibroblaster gjennom sin 6–46 aminosyreregion [18]. Dermed ble det AIMP1--avledede peptidet (AdP; INCI-navn: sh-oligopeptide 5/sh-oligopeptide 5 SP) i denne regionen utviklet som et kosmetisk middel for antialdring av huden. I følge den forrige studien har AdP doble funksjoner, nemlig fibroblastaktiverende og melanocytthemmende aktiviteter [13]. Det er imidlertid ikke rapportert informasjon om de aktive domenene for disse funksjonene.

Levering av peptider gjennom huden er utfordrende på grunn av hudens beskyttende natur. Den fysiologiske rollen til huden er som en barriere mot miljøfaktorer som UV-lys, mikroorganismer og xenobiotika [19]. Stratum corneum (SC) er det ytterste laget av huden og er sammensatt av en krystallinsk lipidmatrise innebygd med corneocytter [20]. Under SC gir den levedyktige epidermis bestående av stratum granulosum, stratum spinosum og stratum basale strukturell integritet til huden. Blant disse lagene er SC hovedhindringen for peptidlevering, siden den er sammensatt av en svært hydrofob lipidmatrise og tettpakkede korneocytter.

Det er gjort flere forsøk på å overvinne dette problemet, som inkluderer liposomer, mikroemulsjon, iontoforese, elektroporasjon og mikronål [21–25]. Imidlertid bruker den mest pålitelige og reproduserbare tilnærmingen for å forbedre hudtilførselen penetrasjonsforsterkere [26]. Etanol, en representativ penetrasjonsforsterker for peptider, ble tatt i bruk i denne studien [27]. I tillegg ble natriumkarboksymetylcellulose (CMC), et ikke-toksisk fortykningsmiddel, valgt for å forberede det hydrosolbaserte topiske leveringssystemet. CMC er det mest brukte cellulosederivatet i dag, hvorav bruksområder inkluderer kosmetikk, mattilsetningsstoffer, papir, tekstil og farmasøytiske produkter [28]. CMC produseres ved karboksymetylering av polysakkarider, slik som stivelse, bomullslinters og cashewtreegummi, som gjør vannløselige, kjemisk stabile, ikke-toksiske, biokompatible og biologisk nedbrytbare egenskaper [29].

Sammensetningen av hydrosolen ble optimalisert ved å bruke responsoverflatemetodikken (RSM) for å sikre passende viskositet og tørkehastighet for dermal påføring. Denne statistiske teknikken krever mye mindre eksperimentering og tid for å oppnå kritiske kvalitetsegenskaper til produktet sammenlignet med én-faktor-til-en-gangen (OFAT) metoder [30,31]. RSM gir også betydningen av de uavhengige variablene og deres interaksjoner [32]. Box-Behnken-designet (BBD) brukt i denne studien tilhører RSM og har mange fordeler sammenlignet med de andre RSM-designene, og krever færre kjøringer i tilfellet med tre eller fire variabler [33]. Dessuten kan BBD unngå kombinerte faktorekstremer, ettersom dataene i midten av kanten brukes til å konstruere modellen [34].

I denne studien ble de fibroblastaktiverende og melanocytthemmende domenene til AdP (henholdsvis FA- og MI-AdP) bestemt til å adressere funksjonell separasjon. FA-AdP-fragmentet ble lastet til den optimaliserte hydrosolen, og dets kunstige hudavsetning ble evaluert ved bruk av en nær-infrarød fluorescensavbildningsteknikk.

2. Resultater

2.1. Funksjonelle fragmenter av AIMP1-derivert peptid (AdP)

AdP, {{0}} til 46-restfragment av AIMP1, har doble funksjoner (dvs. fibroblastaktiverende og melanocytthemmende aktiviteter) i den hudassosierte cellen. For funksjonell separasjon ble fragmenter av AdP (Fr1: 6–20, Fr2: 10–24, Fr3: 14–28, Fr4: 18–32, Fr5: 26–40 og Fr6: 32–46 restfragmenter av AIMP1) produsert ved fastfasesyntese og testet på fibroblaster og melanocytter. For å undersøke det fibroblastaktiverende domenet til AdP (FA-AdP), ble kollageninduksjon og celleproliferasjon bestemt etter behandlingen av hvert fragment. Fr3 viste lignende induksjonsaktiviteter med AdP på kollagensyntese og fibroblastproliferasjon (figur 1a,b). Sammenlignet med EGF (1 µg/ml), viste Fr3 (0,1 µg/ml) 15 prosent og 10 prosent mer potente aktiviteter for henholdsvis kollageninduksjon og fibroblastproliferasjon.

For å identifisere det melanocytthemmende domenet til AdP (MI-AdP), ble fragmentene av AdP (Fr1–6) behandlet for -MSH-induserte melanocytter. Blant dem viste Fr4 sammenlignbar hemming av melaninsyntese indusert av -MSH med den av AdP (figur 1c). I tillegg, sammenlignet med albumin (10 µM), utøvde Fr4 (1 µg/ml) en 35 prosent høyere hemmende effekt på melaninsyntesen.

Figur 1. Fibroblastaktiverende (FA) og melaninhemmende (MI) domenekartlegging av AIMP1--avledet peptid (AdP): (a) Forhudsfibroblaster ble behandlet med EGF (1 µg/mL), AdP ({ {5}}.1 µg/mL), og fragmenter av AdP (Fr1–Fr6; 0.1 µg/mL). Etter 24 timers inkubering ble prokollagen type I bestemt i dyrkede medier ved ELISA; (b) etter 48 timers inkubasjon ble CCK8-analyse utført for å overvåke spredningen av forhudsfibroblaster; (c) melanocytter, forhåndsbehandlet med -MSH (0.5 µM), ble behandlet med albumin (At, 10 µM), AdP (1 µg/ml) og fragmenter av AdP ( Fr1–Fr6, 1 µg/ml). Etter 48 timers inkubasjon ble intracellulært melanin målt. Data presenteres som gjennomsnitt ± standardavvik (SD) (n=3). * p < 0.05 og ** p < 0.01, signifikant forskjellig fra kontrollen.

2.2. Cytotoksisitet og immunogenisitetstester av FA- og MI-AdP

Siden sikkerhetsspørsmål er viktig i det kosmetiske feltet, ble cytotoksisitet og immunogenisitetstester utført på FA-AdP og MI-AdP (dvs. henholdsvis Fr3 og Fr4). For å garantere sikkerheten til disse peptidene ble en høy mengde FA-AdP eller MI-AdP behandlet for å oppnå 100 × den effektive konsentrasjonen. I keratinocytter viste FA-AdP og MI-AdP ingen cytotoksisitet opp til 100 µg/ml (figur 2a). For immunogenisitetstester ble FA-AdP og MI-AdP behandlet i monocytter. Som vist i figur 2b, viste TNF-nivået til peptidbehandlede grupper ingen signifikant forskjell sammenlignet med det for kontrollgruppen (figur 2b).

Figur 2. Ikke-cytotoksisitet og ikke-immunogenisitet av FA-AdP og MI-AdP: (a) For å teste cytotoksisiteten til FA-AdP og MI-AdP, ble keratinocytter (HaCaT-celler) inkubert med doksorubicin (Dox, 1{{ 29}} µM), AdP (100 µg/ml), FA-AdP (10 eller 100 µg/ml) og MI-AdP (10 eller 100 µg/ml). Etter 24 timers inkubasjon ble cytotoksisitet bestemt ved CCK-8-analyse; (b) for immunogenisitetstesten ble monocytter (THP-1-celler) brukt. Etter 12 timers inkubasjon med LPS (50 ng/ml), AdP (100 µg/ml), FA-AdP (10 eller 100 µg/mL) og MI-AdP (10 eller 100 µg/ml), er TNF-nivået ble målt i dyrkede medier ved ELISA. Data presenteres som gjennomsnitt ± SD (n=3). ** p < 0,01, signifikant forskjellig fra de andre.

2.3. Viskositeten til AdP Hydrosol

For å demonstrere den forbedrede topiske leveringen av AdP gjennom stratum corneum (SC), ble FA-AdP-lastede hydrosolformuleringer bestående av CMC, etanol og glyserin fremstilt og evaluert. Viskositetsverdiene til AdP-hydrosolene varierte fra 116,1–267,1 cps (tabell 1).

Viskositetsverdiene økte ettersom konsentrasjonene av CMC (x1), etanol (x2) og glyserin (x3) endret seg fra lave til høye verdier. Koeffisientene til x1, x2, x3 og x2·x3 i den kodede regresjonsligningen var henholdsvis 28,25, 32,91, 30.16 og 19,53, noe som indikerer at de lineære leddene har større innvirkning på viskositeten enn interaksjonsbegrep. De faktiske, justerte og anslåtte bestemmelseskoeffisienten (R 2 )-verdier var henholdsvis 0.9049, 0.8668 og 0,7364. Likheten mellom disse verdiene tyder på at modellen ikke var overmontert. Responsoverflateplottene som viser effekten av de uavhengige variablene på viskositeten til hydrosolen er presentert i figur 3. Som forventet fra ligningen nevnt ovenfor, viste konsentrasjonene av CMC, etanol og glyserin positive effekter på viskositeten.

2.4. Tørkehastighet for AdP Hydrosol

Vekttapet til hydrosolen ved tørking er vist i figur 4a, og verdiene for tørkehastighetskonstanten (k) ble vellykket beregnet ved å tilpasse førsteordensmodellen til disse dataene (R 2 > 0.951; Tabell 1 ). K-verdiene varierte fra 0.0083–0,0242 min−1, og den reduserte modellligningen for k (y2) i kodede enheter er som nedenfor:

som kun består av termene som har en signifikant effekt på k-verdiene (p < 0.{{10}}5; Tabell 2). De positive koeffisientene til x2- og x2·x2-ledd antyder at k-verdiene økte ettersom konsentrasjonen av etanol økte, mens den negative koeffisienten til x3-leddet tydelig viste den hemmende effekten av glyserin på tørking. De faktiske, justerte og forutsagte R 2-verdiene for denne modellen var henholdsvis 0.9839, 0.9775 og 0.9659, noe som støtter at modellen kan forklare k-verdiene mer enn 98 prosent uten å være overtilpasset. Responsoverflateplottene som viser forholdet mellom de uavhengige variablene og k-verdiene til hydrosolen er presentert i figur 4 bd. Bemerkelsesverdig er at selv om interaksjonsleddet, x1·x2, har en negativ koeffisientverdi, var den totale effekten av etanolkonsentrasjonen på k-verdiene positiv under de eksperimentelle forholdene.

2.5. Optimalisering av AdP Hydrosol Basert på Composite Desirability

Optimaliseringsplottene som viser ønskelighetsfunksjonene er vist i figur 5. Den maksimale sammensatte ønskeligheten (D) på 0.8912 ble oppnådd ved CMC-, etanol- og glyserinkonsentrasjoner på 0.229 prosent (w) /v), henholdsvis 50 prosent (v/v) og 20 prosent (v/v). D-verdien nær 1 antyder at både viskositeten og k oppnådde gunstige (dvs. maksimerte) resultater som helhet. De individuelle ønskeverdiene for viskositet (d1) og k (d2) var henholdsvis 1.0000 og 0,79429, noe som antyder at sammensetningen ovenfor av hydrosol er mer effektiv for å maksimere viskositeten enn k. Merk at selv om konsentrasjonene av CMC og glyserin viste motsatte effekter på viskositet og k, viste bare CMC-konsentrasjonsbegrepet maksimumspunktet i D-funksjonen. Etanolkonsentrasjonsbegrepet viste bare en positiv effekt under vår eksperimentelle tilstand.

2.6. Studie av kunstig hudavsetning

Strat-M-membranen (STM; kunstig hud) avsetning av den fluorescerende fargestoff-merkede FA-AdP-hydrosolen ble overvåket ved nær-infrarød fluorescens (NIR) avbildning (figur 6). Basert på resultatene av optimaliseringsstudiene, den merkede FA-AdP-lastede hydrosolen som inneholder CMC, etanol og glyserin i konsentrasjoner på 0.229 prosent (w/v), 50 prosent (v/ v), og 20 prosent (v/v) ble valgt som den endelige formuleringen. Ved 8 timers inkubering var den gjennomsnittlige fluorescensintensiteten til den hydrosolbehandlede STM 127- ganger høyere enn den for fri FA-AdP (dvs. løsningen i dobbeltavionisert vann) behandlet STM (p < 0,05). Variasjonskoeffisienten (CV)-verdiene var imidlertid sammenlignbare mellom de to gruppene (10,6 prosent og 14,8 prosent for henholdsvis FA-AdP-lastet hydrosol og fri FA-AdP), noe som støtter reproduserbarheten til den dramatiske forsterkende effekten av den utviklede hydrosolen .

3. Diskusjon

AdP ble dissekert for å bestemme det funksjonelle domenet. Det fibroblastaktiverende domenet til AdP (FA-AdP, sh-oligopeptid 84) og melanocyttinhiberende domenet til AdP (MI-AdP, sh-oligopeptid 91 SP) ble påvist som henholdsvis 14–28 og 18–32 rester av AIMP1 . Til tross for 66 prosent homologi mellom sekvensene deres, viste disse to peptidene forskjellige funksjoner i hudassosierte celler, noe som kan forklares av forskjellen i sekundære/tertiære strukturer eller interaksjonspartnere. Karakteristiske tredimensjonale strukturer gjør at selv peptider med høy homologi kan ha distinkte biologiske aktiviteter, noe som gir forskjellige interaksjonsgrensesnitt [35]. I mellomtiden er FA-AdP og MI-AdP 15-aminosyrelengde (aa) peptider, som er mye kortere enn AdP (41-aa lengdepeptid). Generelt har avkortede peptider fordeler som muligheten for enkel og kostnadseffektiv syntese og forbedring av hudpenetrasjon, noe som antyder at FA-AdP og MI-AdP er attraktive kosmetiske ingredienser.

Imidlertid, ifølge den forrige studien, må disse peptidene leveres til dermis - der fibroblastene ligger - for å utøve antialdringsaktivitet for huden [13]. Således ble formuleringer av hydrosol-type utviklet for å løse dette leveringsproblemet. Etanol og glyserol ble brukt som hovedkomponentene i den avkortede AdP-lastede hydrosolen. Etanol er en ofte brukt penetrasjonsforsterker i kosmetikkindustrien, som kan forbedre peptidtilførselen til huden ved hjelp av flere mekanismer. Etanol kan endre den fysiske tilstanden til hudvevet eller kan til og med trekke ut noen av lipidene som utgjør SC-laget, noe som resulterer i forbedring av peptidfluks gjennom huden [36]. Dessuten kan etanol øke peptidkonsentrasjonen etter administrering på grunn av raskt tap ved fordampning eller hudabsorpsjon. Den påfølgende overmetningen av peptid kan gi et høyere hudleveringspotensial [26]. Etanol kan også dra peptidet direkte inn i huden under dets penetrering [37].

Selv om etanolkonsentrasjoner på opptil 80 prosent kan brukes uten bekymring for hudirritasjon [38], begrenset utfelling av CMC ved høye konsentrasjoner av etanol dets maksimale innhold i hydrosolen til 50 prosent i denne studien. Glyserin kan også forbedre peptidleveringseffektiviteten, hvorav den underliggende mekanismen er hydreringen av SC-laget [39]. Hudhydrering kan øke den perkutane absorpsjonen av hydrofile forbindelser, inkludert peptider [26].

Dessuten kan viskositeten og k-verdiene også påvirke effektiviteten av peptidlevering, så vel som brukervennligheten [40,41]. Mer spesifikt er høyere viskositet nært knyttet til lengre hudretensjon av hydrosolen, og en raskere tørkehastighet garanterer rask utvikling av peptidkonsentrasjonsgradienten mellom hydrosolen og huden [40,41]. I følge Ficks første diffusjonslov må begge disse egenskapene maksimeres for å oppnå den høyeste fluksen av peptid. Dermed ble viskositeten og k-verdiene sett på som kritiske kvalitetsattributter (CQAs) i denne studien. For å oppnå tilstrekkelig viskositet ble CMC tilsatt til hydrosolen som et fortykningsmiddel. Imidlertid, ettersom CMC utfelles i nærvær av en høy konsentrasjon av etanol, ble CMC ikke tilsatt med mer enn 0,3 prosent.

Interessant nok, selv under denne lave konsentrasjonen, viste CMC en negativ effekt på tørkehastigheten i vår foreløpige studie (data ikke vist), noe som tyder på nødvendigheten av en systematisk tilnærming for å oppnå det optimaliserte innholdet. Derfor ble BBD tatt i bruk for å evaluere forholdet mellom sammensetningene og CQAene til hydrosolen mer grundig. Basert på dette forholdet ble den optimaliserte sammensetningen som viser den maksimerte D-verdien oppnådd.

Den optimaliserte hydrosolen ble evaluert for sin AdPs-leveringseffektivitet til huden. Imidlertid frarådes bruk av konvensjonelle studiemodeller som bruker dyrehud når man tester kosmetikk [42]. Som et alternativ til dyrehud ble STM, en syntetisk membran, tatt i bruk, som deler en lignende struktur med menneskehud. Et tett topplag belagt med lipider ligner SC. Under det øverste laget er de to lagene av polyetersulfon (PES) støttet av polyolefin non-woven matrisen. Disse strukturene etterligner henholdsvis dermis og subkutant vev [43]. Etter studien av kunstig hudavsetning ble STM-prøvene evaluert ved bruk av NIR-bildeinstrumentet for å kvantifisere FA-AdP-avsetningen. NIR-avbildning gir informasjon om det totale omfanget av peptidavsetning på STM nesten øyeblikkelig. Dessuten, siden denne teknikken ikke krever destruktive prøveforbehandlinger, som homogenisering, ekstraksjon og konsentrasjon, kan fluorescensintensiteten til de intakte prøvene visualiseres med romlig informasjon. Den observerte dramatiske forbedringen av FA-AdP-avsetning i den kunstige huden antyder at den utviklede hydrosolen kan brukes som et lovende topisk AdPs-leveringssystem for hudbekjempelse av aldring.

4. Materialer og metoder

4.1. Cellekultur og reagenser

Forhudsfibroblaster (HFF-1), keratinocytter (HaCaT) og melanocytter (B16F10) ble dyrket i DMEM-medium supplert med 10 prosent føtalt bovint serum (FBS) og antibiotika (100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomy) ). THP-1-celler ble dyrket i RPMI 1640-medium supplert med 10 prosent FBS og antibiotika (100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin). Celler ble dyrket ved 37 ◦C i en fuktet atmosfære ved 5 prosent CO2. Alle peptider ble syntetisert ved fastfase-syntesemetoden, som tidligere rapportert av vår gruppe [13]. Blanose™ natriumkarboksymetylcellulose 7LP EP (CMC; 90,5 kDa) ble kjøpt fra Ashland (Schaffhausen, Sveits). Glyserin og etanol ble oppnådd fra Samchun Chemical Co., Ltd. (Seoul, Korea). Alexa Fluor™ 647 NHS ester ble kjøpt fra Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Strat-M membran (STM) ble oppnådd fra EMD Millipore Co. (Billerica, MA, USA). Fosfatbufret saltvann (PBS) ble kjøpt fra Lonza Group Ltd. (Basel, Sveits). Alle andre reagenser var av analytisk kvalitet og ble kjøpt fra kommersielle kilder.

4.2. Kollagen ELISA

Forhudsfibroblastceller (HFF-1; 5 × 104 celler/brønn) ble sådd i en 24-brønnkulturplate. Før peptidbehandling ble cellene pre-inkubert med serumfritt DMEM-medium i 6 timer. Celler ble behandlet med AdP, hEGF (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og fragmenter av AdP i 24 timer. Etter 24 timers behandling ble media høstet for kollagen ELISA-analyse. Procollagen type I i kulturmediet ble bestemt av Procollagen type I ELISA-settet (Takara, Kusatsu, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner. Procollagen type I mengden i media ble normalisert av Procollagen type I mengden av kontrollgruppen.

4.3. Spredningsanalyse

Forhudsfibroblastceller (HFF-1; 3 × 103 celler/brønn) ble sådd i en 96-brønnplate og dyrket. Celler ble erstattet med serumfritt medium og deretter behandlet med AdP, hEGF og fragmenter av AdP i 48 timer. Celleproliferasjon ble bestemt ved CCK-8-analyse (Dojindo, Kumamoto, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner. Spredning ble normalisert ved spredning av kontrollgruppen.

4.4. Måling av melanin

Melanocytter (B16F10; 1 × 105 celler/brønn) ble sådd i en 6-brønnplate og dyrket. For å indusere melaninsyntese ble -MSH (0,5 uM), en melanin-induktor, brukt. AdP og fragmenter av AdP ble behandlet med -MSH (0,5 µM) i 48 timer. Intracellulær melanin- og tyrosinaseaktivitet ble overvåket som tidligere rapportert [13]. Kort fortalt ble melanocytter (1 × 105 celler) lysert med 1 N NaOH ved 70 ◦C i 1 time. Intracellulært melanin ble bestemt i lyserte prøver ved 490 nm bølgelengdeabsorbans ved bruk av en mikroplateleser (Synergy 2, BioTek, Winooski, VM, USA).

4.5. Cytotoksisitet og immunogenisitetstester

Sikkerheten til FA-AdP og MI-AdP ble verifisert når det gjelder cytotoksisitet og immunogenisitet. For å teste cytotoksisiteten til peptidene ble keratinocytter (HaCaT; 3 × 103 celler/brønn) sådd inn i en 96-brønnplate og dyrket. Celler ble inkubert med doksorubicin (Dox, 10 µM), AdP (100 µg/ml), FA-AdP (10 eller 100 µg/ml), eller MI-AdP (10 eller 100 µg/ml). Etter 24 timers inkubering ble cytotoksisitet bestemt ved CCK-8-analyse (Dojindo) i henhold til produsentens håndbok. Immunogenisiteten til peptidene ble evaluert ved å utføre TNF-ELISA. THP-1-celler (5 × 104 celler/brønn) ble sådd på en 24-brønnplate. Celler ble pre-inkubert med 1 prosent FBS-holdig medium i 6 timer. Etter pre-inkubering ble cellene behandlet med 10 ng/ml LPS, AdP og fragmenter av AdP. Etter 12 timers behandling ble kondisjonerte medier høstet for TNF-ELISA-analyse. TNF-mengde i kondisjonerte medier ble vurdert av et humant TNF-ELISA-sett (BD Bioscience, San Jose, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. TNF-mengde i kondisjonerte medier ble normalisert av TNF-mengden til kontrollgruppen.

4.6. Fremstilling av FA-AdP-Lastet Hydrosol

FA-AdP hydrosolformuleringer ble fremstilt ved bruk av CMC, glyserin og etanol. CMC ble oppløst i varmt dobbeltavionisert vann (DDW; 80 ◦C) ved kontinuerlig omrøring ved 700 rpm i 3 timer for å fremstille en 3 prosent (w/v) arbeidsløsning. Glyserin og etanol ble blandet med CMC-løsningen ved å bruke en homogenisator (Ultra-Turrax T-25, IKA Works GmbH & Co. KG, Staufen, Tyskland) ved 14,000 rpm i 5 min. FA-AdP oppløst i DDW ble tilsatt til blandingen for å produsere den endelige formuleringen med en FA-AdP-konsentrasjon på 20 uM.

4.7. Eksperimentell design for Hydrosol-optimalisering

Box-Behnken-designet (BBD) ble brukt for å optimalisere de fysisk-kjemiske egenskapene til FA-AdP-hydrosol. Konsentrasjonene av CMC (x1), etanol (x2) og glyserin (x3) ble valgt som uavhengige variabler. Effektene av disse faktorene på viskositeten (y1) og tørkehastighetskonstanten (y2) til hydrosol ble evaluert på tre nivåer. Inkludert tre replikater i sentrum, ble det utført 15 eksperimenter. De eksperimentelle kombinasjonene er presentert i tabell 1. De kvadratiske modellene som passer best ble generert ved bruk av Minitab® 18.1 (Minitab Inc., State College, PA, USA) for å undersøke de lineære, kvadratiske og interaksjonseffektene av de tre faktorene. Bare variablene med en p-verdi < 0.05 ble ansett som signifikante og inkludert i modellen. Basert på resultatene av randomiserte eksperimentelle kjøringer ble de 3-dimensjonale overflateplottene oppnådd. Optimaliseringsplottene som viser ønskelighetsfunksjoner ble generert, og kombinasjonen av uavhengige variabler som viser den maksimale sammensatte ønskeligheten (D) ble estimert. D-verdien ble oppnådd som det geometriske gjennomsnittet av den individuelle ønskeligheten (d) ved å bruke formelen nedenfor:

hvor d1 og d2 representerer den individuelle ønskeligheten av viskositet og tørkehastighetskonstant for hydrosolen, og ingen vektfaktor ble brukt.

4.8. Måling av viskositet og tørkehastighet

Viskositeten til FA-AdP-hydrosolen ble målt ved å bruke DV-II pluss Pro viskosimeter utstyrt med en LV-1-spindel (Ametek Brookfield, Middleborough, MA, USA). Målingen ble gjort mellom 50–60 prosent av instrumentets dreiemomentskala ved 25 ◦C. For å evaluere tørkehastigheten ble alikvoter (200 µL) av de utviklede formuleringene lastet i skåler (overflateareal: 63,6 mm2) med kjent vekt og inkubert i en tørr ovn (32 ◦C). Vektendringene deres ble overvåket etter 0, 15, 30, 45 og 60 minutter. Tørkehastighetskonstanten (k; min−1 ) ble beregnet ved å bruke førsteordens korrelasjon mellom vektendringen ved tørking og medgått tid. Regresjonslinjene ble plottet i henhold til følgende ligning:

4.9. Evaluering av kunstig hudavsetning ved nær-infrarød fluorescensavbildning

Studien av kunstig hudavsetning ble utført ved bruk av NIR-avbildning. FA-AdP (4 mg) ble oppløst i 0,1 M natriumbikarbonatbuffer (1 ml, pH 8,3) og sakte blandet med Alexa Fluor™ 647 NHS-ester (50 µg). Blandingen ble inkubert ved romtemperatur i 2 timer. Fluorescensmerket FA-AdP ble renset ved å bruke en PD-10 avsaltningskolonne (GE Healthcare, Chicago, IL, USA), og konsentrasjonen ble målt ved hjelp av bicinchoninsyre-proteinanalysesett (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MS, USA) i henhold til produsentens protokoll.

Fluorescensmerket FA-AdP-lastet hydrosol ble fremstilt i henhold til samme metode i avsnitt 4.6. Sammensetningen av hydrosolen som viser den høyeste komposittønskeligheten ble valgt som den optimaliserte formuleringen for hudleveringsstudien. Konsentrasjonen av fluorescensmerket FA-AdP i hydrosolen var 20 uM. En alikvot (1 mL) av den merkede FA-AdP-hydrosolen eller merket FA-AdP oppløst i DDW (20 µM, kontrollgruppe) ble påført på oversiden av STM klemt mellom donor- og reseptorcellene til Keshary-Chien-diffusjonscellen ( FCDV-15 Diffusion Cell Drive Console; Labfine, Anyang, Korea). Diffusjonscellearealet var 1,76 cm2, og eksperimentet ble utført ved 32 ◦C under mørke forhold. Etter 8 timers inkubering ble STM samlet og vasket med et overskudd av DDW 5 ganger. NIR-intensiteten til de kunstige hudprøvene ble målt med VISQUE ® InVivo Smart (Vieworks, Anyang, Korea).

4.10. Statistikk

Den statistiske analysen (upared two-tailed Student's t-test) ble utført ved bruk av SPSS statistikkprogramvare (versjon 21.0; IBM Corp, NY, USA). Alle resultater presenteres som gjennomsnitt ± standardavvik (SD), og p-verdien på mindre enn 0.05 ble ansett som statistisk signifikant.

Forfatterbidrag:

Alle forfattere har bidratt vesentlig til dette arbeidet: konseptualisering, J.-YL og MCP; metodikk, Y.-MH, T.-WK og K.-RL; programvare, DHK; undersøkelse, J.-JL, Y.-MH, T.-WK, HSL, WJJ, JK og SK; skriving—originalt utkast til utarbeidelse, J.-JL; skriving – revidert utkast til utarbeidelse, Y.-MH og T.-WK; skriving – gjennomgang og redigering, J.-YL og MCP; tilsyn, D.-DK, SKK, og C.-WC; prosjektadministrasjon, J.-YL og MCP; finansieringsoppkjøp, J.-YL

Finansiering:

Dette arbeidet ble støttet av forskningsfondet til Chungnam National University.

Interessekonflikter:

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt. Finansierne hadde ingen rolle i utformingen av studien; i innsamling, analyser eller tolkning av data; i skrivingen av manuskriptet, eller i beslutningen om å publisere resultatene.

Referanser

1. Ganceviciene, R.; Liakou, AI; Theodoridis, A.; Makrantonaki, E.; Zouboulis, CC Hudanti-aldringsstrategier. Dermato-endokrinologi 2012, 4, 308–319. [CrossRef]

2. Pena Ferreira, MR; Costa, PC; Bahia, FM Effekten av anti-rynkeprodukter i hudoverflatens utseende: en sammenlignende studie ved bruk av ikke-invasive metoder. Hud. Res. Teknol. 2010, 16, 444–449. [CrossRef]

3. Hynes, RO Den ekstracellulære matrisen: ikke bare pene fibriller. Science 2009, 326, 1216–1219. [CrossRef] [PubMed]

4. Frantz, C.; Stewart, KM; Weaver, VM Den ekstracellulære matrisen på et øyeblikk. J. Cell Sci. 2010, 123, 4195–4200. [CrossRef]

5. Klausul, KC; Barker, TH Ekstracellulær matrisesignalering i morfogenese og reparasjon. Curr. Opin. Bioteknologi. 2013, 24, 830–833. [CrossRef]

6. Malerich, S.; Berson, D. Neste generasjons kosmetikk: det siste innen peptider, vekstfaktorer, cytokiner og stamceller. Dermatol. Clin. 2014, 32, 13–21. [CrossRef] [PubMed]

7. Uitto, J. Rollen til elastin og kollagen i kutan aldring: indre aldring versus fotoeksponering. J. Drugs Dermatol. 2008, 7, s12–s16.

8. Fligiel, SE; Varani, J.; Datta, SC; Kang, S.; Fisher, GJ; Voorhees, JJ Kollagennedbrytning i aldret/fotoskadet hud in vivo og etter eksponering for matrisemetalloproteinase-1 in vitro. J. Investig. Dermatol. 2003, 120, 842–848. [CrossRef] [PubMed]

9. Varani, J.; Perone, P.; Fligiel, SE; Fisher, GJ; Voorhees, JJ Hemming av type I prokollagenproduksjon ved fotoskader: korrelasjon mellom tilstedeværelsen av høymolekylære kollagenfragmenter og redusert prokollagensyntese. J. Invest. Dermatol. 2002, 119, 122–129. [CrossRef] [PubMed]

10. Carsberg, CJ; Warenius, HM; Friedmann, PS Ultrafiolett stråling-indusert melanogenese i humane melanocytter. Effekter av modulerende proteinkinase CJ Cell Sci. 1994, 107, 2591–2597.

11. Brenner, M.; Hørsel, VJ Melaninets beskyttende rolle mot UV-skader i menneskelig hud. Photochem. Fotobiol. 2008, 84, 539–549. [CrossRef] [PubMed]

12. Lintner, K.; Mas-Chamberlin, C.; Mondon, P.; Peschard, O.; Lamy, L. Cosmeceuticals og aktive ingredienser. Clin. Dermatol. 2009, 27, 461–468. [CrossRef] [PubMed]

13. Kim, J.; Kang, S.; Kwon, H.; Moon, H.; Park, MC Dobbeltfunksjonelt bioaktivt peptid, AIMP1-avledet peptid (AdP), for antialdring. J. Cosmet. Dermatol. 2019, 18, 251–257. [CrossRef]

14. Kim, S.; Du, S.; Hwang, D. Aminoacyl-tRNA-syntetaser og tumorigenese: mer enn husholdning. Nat. Rev. Cancer 2011, 11, 708. [CrossRef] [PubMed]

15. Lee, SW; Kim, G.; Kim, S. Aminoacyl-tRNA-syntetase-interagerende multifunksjonelt protein 1/p43: et fremvoksende terapeutisk protein som fungerer på systemnivå. Ekspertuttalelse. Drug Discov. 2008, 3, 945–957. [CrossRef]

16. Helfrich, YR; Sachs, DL; Voorhees, JJ Oversikt over aldring og fotoaldring av huden. Dermatol. Sykepleiere. 2008, 20, 177–183. [PubMed]

17. Park, SG; Shin, H.; Shin, YK; Lee, Y.; Choi, EC; Park, BJ; Kim, S. Det nye cytokinet p43 stimulerer dermal fibroblastproliferasjon og sårreparasjon. Er. J. Pathol. 2005, 166, 387–398. [CrossRef]

18. Han, JM; Park, SG; Lee, Y.; Kim, S. Strukturell separasjon av forskjellige ekstracellulære aktiviteter i aminoacyl-tRNA-syntetase-interagerende multifunksjonelt protein, p43/AIMP1. Biochem. Biofys. Res. Commun. 2006, 342, 113–118. [CrossRef] [PubMed]

19. Witting, M.; Obst, K.; Friess, W.; Hedtrich, S. Nylige fremskritt innen topisk levering av proteiner og peptider mediert av myk materie nanobærere. Bioteknologi. Adv. 2015, 33, 1355–1369. [CrossRef]

20. Kang, NW; Kim, MH; Sohn, SY; Kim, KT; Park, JH; Lee, SY; Lee, JY; Kim, DD Curcumin-lastet lipid-hybridisert cellulose nanofiberfilm forbedrer imiquimod-indusert psoriasis-lignende dermatitt hos mus. Biomaterialer 2018, 182, 245–258. [CrossRef]

21. Aufenvenne, K.; Larcher, F.; Hausser, I.; Duarte, B.; Oji, V.; Nikolenko, H.; Del Rio, M.; Dathe, M.; Traupe, H. Topisk enzymerstatningsterapi gjenoppretter transglutaminase 1-aktivitet og korrigerer arkitekturen til transglutaminase-1-mangelfulle hudtransplantater. Er. J. Hum. Genet. 2013, 93, 620–630. [CrossRef] [PubMed]

22. Goebel, AS; Schmaus, G.; Neubert, RH; Wohlrab, J. Dermal peptidlevering ved bruk av forsterkermolekyler og kolloidale bærersystemer – del I: karnosin. Skin Pharmacol. Physiol. 2012, 25, 281–287. [CrossRef] [PubMed]

23. Prausnitz, MR; Mitragotri, S.; Langer, R. Nåværende status og fremtidig potensial for transdermal medikamentlevering. Nat. Rev. Drug Discov. 2004, 3, 115–124. [CrossRef]

24. Denet, AR; Vanbever, R.; Preat, V. Hudelektroporasjon for transdermal og lokal levering. Adv. Drug Deliv. Rev. 2004, 56, 659–674. [CrossRef]

25. Prausnitz, MR Mikronåler for transdermal medikamentlevering. Adv. Drug Deliv. Rev. 2004, 56, 581–587. [CrossRef]

26. Williams, AC; Barry, BW Penetrasjonsforsterkere. Adv. Drug Deliv. Rev. 2004, 56, 603–618. [CrossRef]

27. Magnusson, BM; Runn, P. Effekt av penetrasjonsforsterkere på permeasjonen av den tyrotropinfrigjørende hormonanalogen pGlu-3-metyl-His-Pro-amid gjennom human epidermis. Int. J. Pharm. 1999, 178, 149–159. [CrossRef]

28. Butun, S.; Ince, FG; Erdugan, H.; Sahiner, N. Ett-trinns fabrikasjon av biokompatible karboksymetylcellulose polymerpartikler for medikamentleveringssystemer. Karbohydr. Polym. 2011, 86, 636–643. [CrossRef]

29. Pushpamalar, V.; Langford, SJ; Ahmad, M.; Lim, YY Optimalisering av reaksjonsbetingelser for fremstilling av karboksymetylcellulose fra sagoavfall. Karbohydr. Polym. 2006, 64, 312–318. [CrossRef]

30. Kim, J.-S.; Kim, K.-T.; Park, J.-H.; Lee, J.-Y.; Kim, M.; Min, HG; Moon, I.-H.; Choi, C.-Y.; Kim, BH; Kim, D.-D. Coacervate mikrokapsler av vitamin U optimalisert av sentral komposittdesign (CCD). J. Pharm. Undersøk. 2018. [CrossRef]

31. Ahmed, ZZ; Khan, FN; Shaikh, DA Omvendt utvikling og formulering av QBD av olopatadinhydroklorid oftalmisk løsning. J. Pharm. Undersøk. 2018, 48, 279–293. [CrossRef]

32. Navamanisubramanian, R.; Nerella, R.; Duraipandian, C.; Seetharaman, S. Quality by design-tilnærming for optimalisering av repaglinid bukkaltabletter ved bruk av Box-Behnken Design. Fremtidens J. Pharm. Sci. 2018, 4, 265–272. [CrossRef]

33. Prabhakaran, D.; Basha, CA; Kannadasan, T.; Aravinthan, P. Fjerning av hydrokinon fra vann ved elektrokoagulering ved bruk av strømningscelle og optimalisering ved responsoverflatemetodikk. J. Environ. Sci. Helse A 2010, 45, 400–412. [CrossRef] [PubMed]

34. Natrella, M. NIST/SEMATECH e-Handbook of Statistical Methods; NIST: Gaithersburg, MA, USA, 2010.

35. Amir, AI; van Rosmalen, M.; Mayer, G.; Lebendiker, M.; Danieli, T.; Friedler, A. Svært homologe proteiner utøver motsatte biologiske aktiviteter ved å bruke forskjellige interaksjonsgrensesnitt. Sci. Rep. 2015, 5, 11629. [CrossRef] [PubMed]

36. Megrab, NA; Williams, AC; Barry, BW Østradiol-gjennomtrengning gjennom menneskelig hud, silastic- og slangehudmembraner: effekten av etanol/vann-løsningsmiddelsystemer. Int. J. Pharm. 1995, 116, 101–112. [CrossRef]

37. Morimoto, H.; Wada, Y.; Seki, T.; Sugibayashi, K. In vitro hudgjennomtrengning av morfinhydroklorid under den endelige påføringen av penetrasjonsforsterkende system som inneholder vann, etanol og l-mentol. Biol. Pharm. Okse. 2002, 25, 134–136. [CrossRef]

38. Löffler, H.; Kampf, G.; Schmermund, D.; Maibach, H. Hvor irriterende er alkohol? Br. J. Dermatol. 2007, 157, 74–81. [CrossRef]

39. Maibach, HI; Lodén, M. Tørr hud og fuktighetskremer: kjemi og funksjon; CRC Press: Boca Raton, FL, USA, 2000.

40. Chang, R.-K.; Raw, A.; Lionberger, R.; Yu, L. Generisk utvikling av aktuelle dermatologiske produkter: formuleringsutvikling, prosessutvikling og testing av aktuelle dermatologiske produkter. AAPS J. 2012, 15, 41–52. [CrossRef]

41. Lu, W.; Luo, H.; Zhu, Z.; Wu, Y.; Luo, J.; Wang, H. Forberedelse og biofarmasøytisk evaluering for målt dose transdermal spray av dexketoprofen. J. Drug Deliv. 2014, 2014. [CrossRef]

42. Adler, S.; Basketter, D.; Creton, S.; Pelkonen, O.; van Benthem, J.; Zuang, V.; Andersen, KE; Angers-Loustau, A.; Aptula, A.; Bal-Price, A.; et al. Alternative (ikke-dyr) metoder for kosmetikktesting: nåværende status og utsikter—2010. Arch. Toxicol. 2011, 85, 367–485. [CrossRef]

43. Haq, A.; Goodyear, B.; Ameen, D.; Joshi, V.; Michniak-Kohn, B. Strat-M® syntetisk membran: Permeabilitet sammenlignet med menneskelig kadaverhud. Int. J. Pharm. 2018, 547, 432–437. [CrossRef]

Eksempeltilgjengelighet:

Prøver av forbindelsene FA-AdP og MI-AdP er tilgjengelig fra forfatterne.

For more information:1950477648nn@gmail.com