Funksjonell respons på minne T-celler fra COVID-19-pasienter

for mer information:ali.ma@wecistanche.com

Ece Tavukcuoglua,, Utku Horzum1 a,, Ahmet Cagkan Inkaya1 , Serhat Unal ,bb Gunes Esendaglia, *

institutt for grunnleggende onkologi, Hacettepe University Cancer Institute, Ankara, Tyrkia

b Institutt for smittsomme sykdommer, Det medisinske fakultet, Hacettepe-universitetet, Ankara, Tyrkia

Søkeord: SARS-CoV-2 SentralhukommelseT-celler, EffectorhukommelseT celler, Spike S1 glykoprotein Dendritic celle Helper T celler Cytotoksiske T lymfocytter

ABSTRAKT: Tilstedeværelsen avhukommelseT-celler hos COVID-19-pasienter er anerkjent, men den funksjonelle styrken tilhukommelsesvar er avgjørende for beskyttelse. I denne studien ble naiv, effektor, effektorminne oghukommelseCD4+ og CD8+ T-celler hentet fra covid-19-overlevende ble utsatt for autologe monocyttavledede domenekontrollere som var lastet med SARS-CoV-2 spike glykoprotein S1. Spredningskapasitet, CD25, 4-1BB og PD-1

og IFN-γ, IL-6, granzym, granulysin og FasL-sekresjon ble forbedret i CD4+ og CD8+-effektorhukommelseog sentralehukommelseT celler. Selv om det er på heterogent nivå,hukommelseT-celler fra individer med COVID-19-historie har funksjonell kapasitet til å gjenopplive anti-viral immunitet mot SARS-CoV-2.

Klikk for åCistanche deserticola ma for å forbedre minnet

1. Introduksjon

Til tross for de fremvoksende dataene om koronavirussykdommen 2019 (COVID-19), gjenstår immunresponsen på det alvorlige akutte respiratoriske syndromet coronavirus 2 (SARS-CoV-2) å være bedre definert. Styrken og varigheten av de humorale og cellulære responsene mot SARS-CoV-2 har vært forbundet med nøytraliserende antistoffer oghukommelseT celler [1,2]. Spesielt bærer spike glykoprotein-S1 betydelig immunodominans siden de nøytraliserende antistoffene blokkerer vedlegget til det angiotensinkonverterende enzymet 2 (ACE2) og hindrer viral oppføring [3]. Dessuten viste omtrent 50% av pasientene S1-spesifikke T-celleresponser [4,5].

Likevel har heterogeniteten som observeres blant COVID-19-tilfellene en forvirrende effekt. Mens flertallet av pasientene utvikler anti-viral immunitet, selv rekonvalesens individer kan ikke beskyttes mot re-infeksjon som er potensielt på grunn av utilstrekkelig størrelse og / eller stabilitet av T celle og antistoff produksjon [6-8]. Intriguingly, i alvorlige SARS-CoV-2 infeksjoner, samspillet mellom CD4 + hjelper T (Th) celler og B celler er sløvt i germinal sentrum, som potensielt demper levetiden til antistoff responser [9]. Sammen med disse aktivitetene er robustheten til CD8+ cytotoksiske T-celler også avgjørende for en vellykket anti-viral immunitet [10]. Tidligere var det CD4+ eller CD8+hukommelseT-celler ble rapportert i COVID-19, men funksjonskapasiteten til disse cellene må håndteres grundig [11-13]. I denne studien ble den funksjonelle responsen til naiv, effektor, sentralhukommelse, og effektorminne CD4+ eller CD8+ T-celler, som ble hentet fra pasienter med COVID-19-historie, mot monocyttavledede dendrittiske celler (DCs) med SARS- CoV-2 S1-antigen er bekreftet.

2. Materiale og metoder

2.1. Pasienter og prøvetaking

På to forskjellige tidspunkter ble perifere blodprøver nylig samlet inn fra pasientene som ble hentet fra COVID-19 (tabell 1) og perifere mononukleære blodceller i blodet ble separert med 1,077 g/ml Ficoll tetthetsgradient (Sigma-Aldrich). Alle protokoller ble godkjent av de lokale etiske komiteene og Republikken Tyrkias helsedepartement. samtykke ble innhentet fra pasientene. Pasienter med positiv RT-PCR-test og/eller seropositivitet ble inkludert i studien. De kliniske symptomene ble kategorisert som milde (de ikke-innlagte pasientene), moderate (pasientene som hadde moderat lungebetennelse) og alvorlige (pasientene som hadde alvorlig lungebetennelse og ble innlagt på sykehus i mer enn 5 dager). Blodprøver fra friske donorer [n = 10 (6 kvinner, 4 menn), median alder 33 (min 28–maks 55)] uten SARS-CoV-2 historie og seropositivitet ble brukt som kontroller.

2.2. Etablering av monocytt-avledede DC- og T-cellekokulturer

Domenekontrollere ble generert fra monocyttene (CD14 MACS, Miltenyi) i henhold til en tidligere publisert protokoll [14]. Antigenlasting med det rekombinante S1-proteinet (S1; 10 μg/ml, abcam) eller HIV gag-antigen (10 μg/ml, TUBITAK Marmara Research Center) [15] eller tetanustoksoiden (TT; 10 μg/ml, Turk Ilac) ble samtidig initiert med modning av monocytt-avledede domenekontrollere med LPS (1 μg/ml, Sigma- Aldrich). Eldre monocytt-avledede domenekontrollere generert i fravær av en

antigen ble brukt som kontroller. På slutten av 7-dagers inkubasjon ble de monocytt-avledede DCene karakterisert som en CD11bhiCD14loCD1a + CD83 + befolkning.

Fra samme COVID-19-pasient er autolog naiv T (TN), terminalt differensiert effektor T (TEMRA), sentralhukommelseT (TCM) og effektorhukommelseT (TEM)-celler ble renset (≥96 %) av FACS (FACSAria II; Becton Dickinson) som CD3-uberørte, CD19- og CD56-negative lymfocytter i henhold til differensialuttrykket til CD45RA-, CD45RO- og CCR7-markører (fig. 1A).

De monocytt-avledede DCene (5x104) ble samkulturert med de rensede undertypene av T-celler (10 )5 i 96 timer i en rundbunns 96-brønns platebrønn som inneholder 200 μL RPMI 1640-medier fullført med 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin (biologisk industri), 5 ng/ml IL-2 (Bio-

Legende). Før kokulturering ble T-celleundertypene merket med 5 μM CFSE (BioLegend). Som en positiv kontroll, et anti-CD3 antistoff (HIT3a, 25 ng/ ml; BioLegend) ble lagt inn i medkulturene. Det eksperimentelle oppsettet er oppsummert i Fig. 1A.

2.3. Immunofenotyping og funksjonsrelaterte analyser ved strømningscytometri

Immunofenotyping ble utført med monoklonale antistoffer anti-human-CD4 (OKT4), -CD8 (RPA-T8), -CD56 (MEM-188), -CD19 (SJ25C1), -CD45RA (HI100), -CD45RO (UCHL1), -CCR7 (G043H7), -CD25 (M-A251), -CD38 (HIT2), -4-1BB (4B4-1), -PD-1 (NAT105), -CD14 (M5E2), -CD11b (ICRF44) (BioLegend); -CD1a (REA736), -CD83 (REA714) (Miltenyi). Median fluorescensintensitet (MFI)-verdier ble bestemt på CD4+ og CD8+ T-celler, og i henhold til CFSE-fortynning.

Endringen i MFI ble beregnet ved å sammenligne dataene fra samkulturene med de antigenbelastede domenekontrollerne og kontroll-DCene.

Andelen T-celler med CFSE-fortynning ble vurdert for spredning. Den antigenspesifikke spredningskapasiteten til T-celler ble beregnet som endringen i spredning der dataene fra kokulturene med kontrollmonocyttavledede domenekontrollere ble brukt som normalisatorer. Supernatantene som ble samlet inn ble brukt i en multipleks ELISA (LEGEND-plex, BioLegend). Alle strømningscytometriske analyser ble utført på en FACSAria II-sortering.

2.4. Statistisk analyse

Resultatene presenteres som median ± SEM. Kruskal-Wallis test og Bonferroni korreksjon ble brukt til de statistiske analysene. En P-verdi<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. Resultater

Etter inkubasjonen med S1-DC ble en liten prosentandel av sprednings-T-cellene identifisert (område %, CD4+, TN 0,49–6,8, TEMRA 3,29–7,7, TCM 0,38–20,2, TEM 0,2– 16,7; område %, CD8+, TN 0,64–5,6, TEMRA 2,16– 10,3, TCM0,8– 15, TEM 1,6– 19,4). Både CD4+ og CD8+ TCM- og TEM-celler viste en betydelig økt spredningsfrekvens enn de naive eller effektor T-cellepopulasjonene (fig. 1B). CD4+ TCM-celler og CD8+ TEM-celler viste den høyeste proliferative aktiviteten. The CD4+hukommelseT-celleproliferasjon kan indusert hos ~ 90% av COVID-19-pasientene, men CD8 +hukommelseT-celleproliferasjon ble bare påvist hos ~60 % av pasientene (fig. 1B). De monocytt-avledede domenekontrollerne ble også lastet med et irrelevant viralt antigen, HIV Gag; forventet, ble det ikke oppnådd noen signifikant respons i T-cellene fra covid-19-overlevende (fig. 1C). På samme måte reagerte ikke T-cellene fra de friske individene på S1-DC. På den annen side fungerte den monocytt-avledede LIKE-presenterer TT-antigenet som en positiv kontroll for T-cellehukommelserespons (fig. 1C). I tillegg ble overflateuttrykket til visse aktiveringsrelaterte markører, spesielt CD25, PD-1 og 4-1BB, betydelig oppregulert på S1-responsive T-celler (fig. 1D). De S1-DC-stimulerte TEM-cellene utskilte de høyeste nivåene av IFN-γ og IL-6, som i stor grad produseres av type 1 CD4 + T-celler og CD8 + cytotoksiske T-celler. Markørene for cytotoksisk respons, granzym A, granulysin, Fas ligand (FasL), og spesielt granzym B ble også forhøyet i samkulturene som huser TEM-celler fra COVID-19-pasienter (fig. 1E). Medkulturens supernatanter som de løselige faktorene ble målt fra, inneholdt meklerne utskilt av T-celler og domenekontrollere; Som det fremgår av litteraturen, kan derfor moderate mengder cytokiner som TNF-α, IL-6, IL-4 og IFN-γ også produseres av DC [16,17]. I noen tilfeller reagerte T-cellene utenfor minnet på S1-DC, oppregulerte CD38- og 4-1BB-uttrykket, og sekresjonen av IL-4 og TNF-α (fig. 1). Heterogenitet ble også notert mellom T-celleparametrene som ble studert og tidspunktet for blodprøvetaking etter utvinning, alvorlighetsgraden av kliniske symptomer eller nivået av anti-S1-antistoffer (data ikke vist).

4. Diskusjon

I covid-19-overlevende beholdt de sirkulerende S1-spesifikke TEM- og TCM-cellene funksjonell respons og viste utvidet effektorkapasitet som aktivering, spredning og sekresjon av immunmediere. Selv om den proliferative responsen ihukommelseCD8+T-celler var ikke så potente som på CD4+hukommelseT-celler, våre data antyder at disse cellene raskt kan gå videre til en effektor tilstand når utsatt for SARS-CoV-2 S1 antigen. TEM-cellene er kritiske portvakter siden de har en tendens til å lokalisere seg i vevet som er utsatt for invasjon av den patogene mikroorganismen, mens TCM-cellene rekrutteres inn i de sekundære lymfoidorganene for å akselerere immunreaksjonene innviet av de antigen-presenterende DCene [18]. Selv om de dekket et begrenset antall COVID-19-tilfeller, inneholdt flertallet av pasientene TEM- og TCM-celler som funksjonelt reagerte på S1-protein når det gjelder minst en parameter testet. Disse foreløpige funnene kan indikere en sannsynlig forskjell mellom funksjonell kompetanse i T-celler og COVID-19-alvorlighetsgrad. En tidligere studie rapporterte en høyere frekvens av S1-spesifikke T-celler enn T-cellene som er spesifikke for N- og M-proteiner [8]. Tilsvarende gjenstår den funksjonelle responsen tilT-celler til andre SARS-CoV-2 antigener å bli bedre belyst. Nylig publisert seminalarbeid viste tilstedeværelsen av langsiktigehukommelsei T-cellene fra COVID-19-pasienter [19,20]. Ved å bruke en distinkt eksperimentell tilnærming der de autologe monocytt-avledede domenekontrollerne ble brukt som et gjennomførbart element for testing av T-celleresponsen, bekreftet studien vår funksjonen og karakteren til T-celler som tidligere var nevnt i individene med COVID-19-historie. Akkumulerende bevis på immuniteten som er etablert i COVID-19-overlevende, vil gi en bedre forståelse av sykdomspatogenese, terapeutiske tilnærminger og vaksineutvikling.

Fig. 1. Vurdering av funksjonelle svar i T-celler fra covid-19 overlevende. A) Grafisk omriss av det eksperimentelle oppsettet vises. Monocytt-avledede dendrittiske celler ble generert fra personer med COVID-19 historie og lastet med SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein-S1 (S1-DC); deretter autolog naiv T (TN), terminalt differensiert effektor T (TEMRA), sentralhukommelseT (TCM) og effektorhukommelseT (TEM) celler ble renset og samkulturert med disse DCs. T celleproliferasjon, uttrykk for aktivering markører og cytokin sekresjon ble målt etter 96 h inkubasjon. B) Endring i CD4+ og CD8+ T celleproliferasjon ble plottet inn for hver pasient i forhold til det som ble oppnådd med kontrollkokulturer med monocytt-avledede domenekontrollere uten spesifikk antigenbelastning. Representative flow cytometri histogrammer er gitt på høyre side. Samkulturene stimulert med et anti-CD3 monoklonalt antistoff fungerte som en teknisk positiv kontroll for T-celleproliferasjon. C) Den pasientavledede TCM- og TEM-cellenes spredningsrespons mot S1-DC ble sammenlignet med de som ble oppnådd med HIV Gag eller med tetanustoksoiden (TT) antigenbelastede domenekontrollere. T-celler og S1-DCer hentet fra friske individer (S1(hd)) ble også brukt som kontroller. D) Endringer i CD4+ og CD8+ T celleaktiveringsmarkørnivåer ble vist i forhold til de som ble oppnådd med kontrollkokulturer med monocyttavledede domenekontrollere uten spesifikk antigenlasting. E) Mengde T-cellerelaterte cytokiner utskilt i samkulturens supernatanter ble vurdert. (*p< 0.05,="" **p=""><>

CRediT forfatterskap bidrag uttalelse

Ece Tavukcuoglu: Undersøkelse, Visualisering, Formell analyse, Skriving - gjennomgang &redigering. Utku Horzum: Undersøkelse, Visualisering, Formell analyse, Skriving - gjennomgang &redigering. Ahmet Cagkan Inkaya: Konseptualisering, Ressurser. Serhat Unal: Konseptualisering, Re-kilder. Gunes Esendagli: Konseptualisering, Skriving - gjennomgang og redigering, Tilsyn.

Erklæring om konkurrerende interesse

Forfatterne erklærer at de ikke har noen kjente konkurrerende økonomiske interesser eller personlige forhold som kunne ha sett ut til å påvirke arbeidet som er rapportert i denne artikkelen.

Referanser

[1] A. Mazzoni, L. Maggi, M. Capone, M. Spinicci, L. Salvati, M.G. Colao, A. Vanni, S.T. Kiros, J. Mencarini, L. Zammarchi, E. Mantengoli, L. Menicacci, E. Caldini, S. Romagnani, F. Liotta, A. Morettini, G.M. Rossolini, A. Bartoloni, L. Cosmi, F. Annunziato, Cellemedierte og humorale adaptive immunresponser på SARS- CoV-2 er lavere i asymptomatisk enn symptomatisk COVID-19 Eur. J. Immunol. 50 (2020) 2013–2024.

[2] Y. Tan, F. Liu, X. Xu, Y. Ling, W. Huang, Z. Zhu, M. Guo, Y. Lin, Z. Fu, D. Liang,T. Zhang, J. Fan, M. Xu, H. Lu, S. Chen, Holdbarhet av nøytraliserende antistoffer og T-cellerespons etter SARS-CoV-2 infeksjon, Front. Med. 14 (2020) 746–751.

[3] C. Conte, F. Sogni, P. Affanni, L. Veronesi, A. Argentiero, S. Esposito, Vaksiner mot koronavirus: State of the Art, Vaccines (Basel) 8 (2020).

[4] C.K. Li, H. Wu, H. Yan, S. Ma, L. Wang, M. Zhang, X. Tang, N.J. Temperton, R.A. Weiss, J.M. Brenchley, D.C. Douek, J. Mongkolsapaya, B.H. Tran, C.L. Lin, G. R. Screaton, J.L. Hou, A.J. McMichael, X.N. Xu, T-celleresponser på hele SARS coronavirus hos mennesker, J. Immunol 181 (2008) 5490–5500.

M. Koblischke, M.T. Traugott, I. Medits, F.S. Spitzer, A. Zoufaly, L. Weseslindtner, C. Simonitsch, T. Seitz, W. Hoepler, E. Puchhammer-Stockl, S.W. Aberle, M. Fodinger, A. Bergthaler, M. Kundi, F.X. Heinz, K. Stiasny, J.H. Aberle, Dynamics of CD4 T cell and antistoffresponser hos COVID-19 pasienter med forskjellig alvorlighetsgrad. Med. (Lausanne) 7 (2020), 592629.

[6] G.A. Polen, I.G. Ovsyannikova, R.B. Kennedy, SARS-CoV-2 immunitet: gjennomgang og søknader til fase 3 vaksinekandidater, Lancet 396 (2020) 1595–1606.

[7] R. Zhou, K.K. To, Y.C. Wong, L. Liu, B. Zhou, X. Li, H. Huang, Y. Mo, T.Y. Luk, T.T. Lau, P. Yeung, W.M. Chan, A.K. Wu, K.C. Lung, O.T. Tsang, W.S. Leung, I. F. Hung, K.Y. Yuen, Z. Chen, Akutt SARS-CoV-2 infeksjon svekker dendritiske celle- og T-celleresponser, immunitet 53 (2020) 864–877 e865.

[8] A. Grifoni, D. Weiskopf, S.I. Ramirez, J. Mateus, J.M. Dan, C.R. Moderbacher, S.A.Rawlings, A. Sutherland, L. Premkumar, R.S. Jadi, D. Marrama, A.M. de Silva, A. Frazier, A.F. Carlin, J.A. Greenbaum, B. Peters, F. Krammer, D.M. Smith, S. Crotty, A. Sette, Mål for T-celleresponser på SARS-CoV-2 Coronavirus hos mennesker med COVID-19 sykdom og ueksponerte individer, Celle, 181 (2020) 1489-1501 e1415.

[9] P.F. Canete, C.G. Vinuesa, COVID-19 får B-celler til å glemme, men T-celler husker,Celle 183 (2020) 13–15.

[10] I. Schulien, J. Kemming, V. Oberhardt, K. Wild, L.M. Seidel, S. Killmer, F. Sagar, M.S. Daul, A. Lago, H. Decker, B. Luxenburger, D. Binder, O. Bettinger, S. Sogukpinar, M. Rieg, D. Panning, M. Huzly, G. Schwemmle, C.F. Kochs, A. Waller, D. Nieters, F. Duerschmied, H.E. Emmerich, A.R. Mei, S. Schulz, D.A. Llewell-Lacey, T. Price, B. Boettler, D.A. Llewell-Lacey, T. Price, B. Boettler, B. R. Bengsch, M. Thimme, C.-H. Hofmann, Karakterisering av eksisterende og induserte SARS-CoV-2-spesifikke CD8(+) T-celler, Nat. Med. 27 (2021) 78–85.

[11] I. Odak, J. Barros-Martins, B. Bosnjak, K. Stahl, S. David, O. Wiesner, M. Busch, M.

M. Hoeper, I. Pink, T. Welte, M. Cornberg, M. Stoll, L. Goudeva, R. Blasczyk, A. Ganser, I. Prinz, R. Forster, C. Koenecke, C.R. Schultze-Florey, Reappearance of effector T cells er forbundet med utvinning fra COVID-19, EBioMedicine 57 (2020), 102885.

[12] A.E. Oja, A. Saris, C.A. Ghandour, N.A.M. Kragten, B.M. Hogema, E.J. Nossent, L.M.A. Heunks, S. Cuvalay, E. Slot, F. Linty, F.H. Swaneveld, H. Vrielink, G. Vidarsson, T. Rispens, E. van der Schoot, R.A.W. van Lier, A. Ten Brinke, P. Hombrink, Divergent SARS-CoV-2-spesifikke T- og B-celleresponser hos alvorlige, men ikke milde COVID-19-pasienter, Eur J. 50 (2020) 1998–2012.

[13] B. Kratzer, D. Trapin, P. Ettel, U. Kormoczi, A. Rottal, F. Tuppy, M. Feichter,P. Gattinger, K. Borochova, Y. Dorofeeva, I. Tulaeva, M. Weber, K. Grabmeier- Pfistershammer, P.A. Tauber, M. Gerdov, B. Muhl, T. Perkmann, I. Fae, S. Wenda, H. Fuhrer, R. Henning, R. Valenta, W.F. Pickl, Immunologisk avtrykk av COVID-19 på perifert blod. Allergi (2020).

[14] A.M. Bruger, C. Vanhaver, K. Bruderek, G. Amodio, E. Tavukcuoglu, G. Esendagli,S. Gregori, S. Brandau, P. van der Bruggen, Protokoll for å vurdere undertrykkelsen av T-celleproliferasjon av menneskelig MDSC, Methods Enzymol. 632 (2020) 155–192.

[15] S.A. Younes, B. Yassine-Diab, A.R. Dumont, M.R. Boulassel, Z. Grossman, J.P. Routy, R.P. Sekaly, HIV-1 viremia forhindrer etableringen av interleukin 2-produserende HIV-spesifikkhukommelseCD4+ T-celler utstyrt med proliferativ kapasitet, J. Exp. Med. 198 (2003) 1909–1922.

[16] D.M. Frucht, T. Fukao, C. Bogdan, H. Schindler, J.J. O'Shea, S. Koyasu, IFN-gammaproduksjon av antigen-presenterende celler: mekanismer dukker opp, Trends Immunol. 22 (2001) 556–560.

[17] E.O. Gubernatorova, E.A. Gorshkova, O.A. Namakanova, R.V. Zvartsev, J. Hidalgo,M.S. Drutskaya, A.V. Tumanov, S.A. Nedospasov, Ikke-redundante funksjoner i IL-6 produsert av makrofager og dendrittiske celler i allergisk luftveisbetennelse, Front. Immunol. 9 (2018) 2718.

[18] Y.D. Mahnke, T.M. Brodie, F. Sallusto, M. Roederer, E. Lugli, The who's who of T-cell differentiation: humanhukommelseT-celle undergrupper, Eur. J. Immunol. 43 (2013) 2797–2809.

J.M. Dan, J. Mateus, Y. Kato, K.M. Hastie, E.D. Yu, C.E. Faliti, A. Grifoni, S.I. Ramirez, S. Haupt, A. Frazier, C. Nakao, V. Rayaprolu, S.A. Rawlings, B. Peters, F. Krammer, V. Simon, E.O. Saphire, D.M. Smith, D. Weiskopf, A. Sette, S.hukommelsesars-cov-2 vurdert i opptil 8 måneder etter infeksjon, Science 371 (2021).

[20] L.B. Rodda, J. Netland, L. Shehata, K.B. Pruner, P.A. Morawski, C.D. Thouvenel, K.K. Takehara, J. Eggenberger, E.A. Hemann, H.R. Waterman, M.L. Fahning, Y. Chen, M. Hale, J. Rathe, C. Stokes, S. Wrenn, B. Fiala, L. Carter, J.A. Hamerman, N.P. King, M. Gale, Jr., D.J. Campbell, D.J. Rawlings, M. Pepper, Funksjonell SARS-CoV-hukommelsevedvarer etter mild COVID-19, Celle, 184 (2021) 169-183 e117.