Gomisin N hemmer melanogenese gjennom å regulere PI3K/Akt og MAPK/ERK signalveier i melanocytter

Ta kontakt med:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstrakt: Gomisin N, har en av lignanforbindelsene funnet i Schisandra Chinensis vist seg å ha antioksidative, anti-tumorogene og anti-inflammatoriske aktiviteter i forskjellige studier. Her rapporterer vi for første gang den anti-melanogene effekten av Gomisin N hos pattedyr celler så vel som i sebrafiskembryoer. Gomisin N reduserte melanininnholdet betydelig uten cellulær toksisitet. Selv om den ikke var i stand til å modulere den katalytiske aktiviteten til sopptyrosinasein vitro,Gomisin Nnedregulerte ekspresjonsnivåene til nøkkelproteiner som fungerer imelanogenese. Gomisin N nedregulert melanokortin 1-reseptor (MC1R), adenylylcyklase 2, mikroftalmiassosiert transkripsjonsfaktor (MITF), tyrosinase,tyrosinase-relatert protein-1(TRP-1), og tyrosinaserelatert protein-2 (TRP-2). I tillegg viste Gomisin N-behandlede Melan-A-celler økte p-Akt- og p-ERK-nivåer, noe som innebærer at aktiveringen av PI3K/Akt- og MAPK/ERK-banene kan fungere for å hemmemelanogenese. Vi validerte også at Gomisin Nreduserte melaninproduksjonen ved å undertrykke uttrykket av MITF,tyrosinase, TRP-1 og TRP-2i muse- og menneskeceller samt i utvikling av sebrafiskembryoer. Til sammen konkluderer vi med detGomisin Nhemmer melaninsyntesen ved å undertrykke uttrykket av MITF og melanogenenzymer, sannsynligvis gjennom å modulere PI3K/Akt- og MAPK/ERK-veiene.

Nøkkelord:Schisandra Chinensis;Gomisin N; lignan;melanogenese; bleking av huden

cistanche har hudblekingsfunksjon

1. Introduksjon

Melanin er et pigment som finnes i de fleste dyreorganer, inkludert hud, hår, øyne, indre øre, bein, hjerte og hjerne [1,2].Melanogeneseer en kompleks prosess der flere signalveier er involvert. Melanokortin 1-reseptoren (MC1R) er en nøkkelregulator imelanogenese, signaliserer gjennom dets ligander som melanocyttstimulerende hormon (MSH) og adrenokortikotropt hormon (ACTH) [3]. Hudmelanin biosyntetiseres av melanocytter i epidermis og overføres deretter til keratinocytter, hvor de spiller viktige roller i hudbeskyttelse ved å absorbere UV-stråling fra sollys og fjerne reaktive frie radikaler [4,5]. Melaninsyntese og overføring i huden og hårfolliklene reguleres av tilgjengeligheten av dets forløpere [6]. L-tyrosin og L-dihydroksyfenylalanin (L-DOPA), hovedsubstrater for melanogene enzymer, fungerer også som hormonlignende regulatorer i melanogenese [7]. På den annen side resulterer overproduksjon av melanin i uønskede hudproblemer som fregner og melasma [8,9]. Melanogenese kan påvirke oppførselen til normale og ondartede melanocytter ved å modulere de elastiske egenskapene til cellene [10]. Selv om reseptorene for serotonin og melatonin uttrykt i kutane celler spiller en nøkkelrolle for å opprettholde cellulær homeostase, kan overdreven produksjon av melanin via ukontrollerte hormonelle endringer forårsake patologiske tilstander i huden [11].

Det har således vært omfattende forsøk på å belyse molekylære mekanismer som kontrollerer melanogenese som det primære trinnet for behandling av hyperpigmentære hudlidelser. I tillegg ulike typerbleking av hudenmidler som hemmer melaninsyntese har blitt identifisert fra planteekstrakter og ikke-planteekstrakter og kommersielt brukt i kosmetikk [12,13]. De mest brukte blekemidlene inkluderer hydrokinon, mequinol, arbutin, kojinsyre, askorbinsyre og retinosyre [12,14]. Imidlertid er det forskjellige begrensninger ved deres bruk i behandling av akutte eller kroniske symptomer på hyperpigmentering hos mennesker. For eksempel kan hydrokinon, selv om det lenge har vært brukt til depigmentering siden 1960-tallet, forårsake hudirritasjon og kontakteksem [15,16]. Det fører også til DNA-skade ved å øke produksjonen av reaktive oksygenarter og utviklingen av eksogen ochronose i pattedyrceller [17,18]. Andre kjentetyrosinasehemmere som kojinsyre og askorbinsyre har ikke bare dårlig hudpenetrasjon, stabilitet og blekingseffekt, men kan også forårsake cytotoksisitet, dermatitt og erytem ved langvarig bruk [19,20]. I denne forbindelse er det et økende behov for å utvikle sikrere og mer effektive blekemidler for behandling av hyperpigmentering av mennesker. Naturlige urter brukt i tradisjonell medisin kan gi alternative kilder for å identifisere nye blekemidler som kontrollerer nøkkeltrinn imelanogenesemed færre eller ingen bivirkninger [21].

Schisandra chinensis, også kjent som nordlig finsmaksbær, finnes naturlig i det nordøstlige Kina, det fjerne østlige Russland, Japan og Korea [22]. Denne planten har lenge vært brukt til behandling av nattblindhet, hudforbrenning, aseptisk betennelse og leversykdommer i tradisjonell orientalsk medisin [23,24]. S. chinensis fruktekstrakt og dets lignanforbindelser har vist seg å ha forskjellige farmakologiske effekter i murine cellelinjer. For eksempel har Schisandra A og C antioksidative effekter, mens Schisandra B har antifibrotiske, antiinflammatoriske, antioksidant- og anti-apoptotiske aktiviteter [25]. En annen lignanforbindelseGomisin N(Figur 1A) har blitt rapportert å undertrykke oksidativ stress-indusert apoptose ved å hemme frigjøringen av cytokrom C fra mitokondrier til cytoplasma, spaltningen av caspase 3 og PARP, og Ca2 pluss-indusert mitokondriell permeabilitetsovergang i H9c2 rottekardiomyocytter [7,8]. Interessant nok har flere studier som bruker musemodeller og humane hudcellelinjer avslørt det terapeutiske potensialet til S. chinensis for behandling av hudsykdommer. Lee et al. rapporterte at metanolekstraktet av S. chinensis-frukt lindret kontaktdermatittsymptomer ved å redusere produksjonen av pro-inflammatoriske cytokiner som TNF- og IFN- ved topisk påføring [8,24]. Kang et al. viste at Schisandra Fructus vannekstrakt hemmet IκB-aktivering, og derved undertrykte produksjonen av TNF-, IL-6 og GM-CSF i den humane mastcellelinjen HMC-1 [26]. Disse funnene førte til at vi postulerte at S. chinensis lignans kan påvirke hudcellefunksjonene mer bredt. I denne studien forsøkte vi å undersøke de antatte rollene tilGomisin N, en av de viktigste lignanforbindelsene i S. Chinensis, i reguleringmelanogenese, og vurderer derved dets potensielle bruk som akosmetisk middel. Her rapporterer vi detGomisin Nhemmer melaninbiosyntesen uten cellulær toksisitet i menneske- og museceller, så vel som i sebrafiskembryoer.

2. Resultater

2.1. Effekter av Gomisin N på melanindannelse og cellelevedyktighet

For å bekrefte effekten av Gomisin N påmelanogenese, behandlet vi musemelanocytter med forskjellige konsentrasjoner avGomisin Ni 72 timer, og deretter vurdert endringer i melanininnhold. Gomisin-behandling reduserte melanininnholdet både i den normale melanocyttcellelinjen Melan-A og i B16F10melanomceller på en doseavhengig måte uten cellulær toksisitet (Figur 1B, C). Vi observerte at Gomisin N hemmet -MSH-indusert melaninproduksjon i B16F10-celler, noe som var sammenlignbart med resultatene oppnådd ved PTU-behandling [27] (Figur 1C). For å vurdere om reduksjonen avmelanin påGomisin Nbehandling skyldes redusert aktivitet av tyrosinase, utførte vi en L-DOPA-fargingsanalyse i normale humane epidermale melanocyttceller (NHEM). Som vist i figur 1E, viste NHEM-celler behandlet med Gomisin N reduserte nivåer av L-DOPA sammenlignet med ubehandlede celler. Den hemmende effekten av Gomisin N på melaninproduksjonen var imidlertid ikke signifikant i humanmelanom MNT-1-celler (Figur 1D) .

2.2. Effekter av Gomisin N på Tyrosinase-aktivitet

For å undersøke omGomisin Nhemmertyrosinaseaktivitet in vitro brukte vi sopptyrosinase og B16 melanomcellelysater. Kojic acid, en velkjent tyrosinasehemmer, ble brukt som en positiv kontroll. Når den ble behandlet med sopptyrosinase, mens Kojic-syre reduserte den enzymatiske aktiviteten betydelig, induserte ikke Gomisin N noen endring i omdannelsen av L-DOPA til dopakrom (Figur 2A). Når den ble behandlet med B16-melanomceller, resulterte imidlertid Gomisin N i en reduksjon ityrosinaseaktiviteten til cellelysatet på en doseavhengig måte (figur 2B). Videre, når det behandles med -MSH inB16-celler,Gomisin Nreverserte økningen i dopakromdannelse stimulert av -MSH (Figur 3C). Spesielt så ut til at Gomisin N var mer effektiv enn Kojic-syre for å hemme det cellulæretyrosinase aktivitetav B16-celler ved -MSH-stimulus. Disse funnene antyder at den hemmende effekten av GomisinN på melaninproduksjonen observert i muse- og menneskeceller (figur 1) ikke skyldes dens funksjon til å direkte hemme den katalytiske aktiviteten til tyrosinase. Imidlertid er det fortsatt mulig at Gomisin Nregulerer uttrykket av tyrosinase eller andre proteiner som spiller nøkkelroller imelanogenese.

2.3. Effekter av Gomisin N på inaktiveringen av MC1R-signalveien

Vi søkte å belyse den underliggende mekanismen som er ansvarlig for den hemmende effekten av GomisinN på melaninproduksjonen. Vi begrunnet detGomisin Nkan regulere signalproteiner som er involvert imelanogeneseog dermed hemme melaninsyntesen. Melanokortin 1-reseptor (MC1R) er amelanocytisk G-proteinkoblet reseptor som fungerer som en nøkkelregulator i melaninsyntese. Aktiveringen av MC1R med liganden -MSH eller adrenokortikotropisk hormon (ACTH) fører til en økning i adenylylcyklase, som igjen oppregulerer intracellulære cAMP-nivåer [2,3]. Følgelig økes det transkripsjonelle nivået av MITF via proteinkinase-C (PKA)/responsive element-bindingprotein (CREB)-veien [2,28]. For å evaluere den regulatoriske effekten av Gomisin N på MC1R-signalveien, sjekket vi ekspresjonsnivåene til MC1R og dets nedstrøms signalmolekyler etter behandling av Melan-A-celler med Gomisin N. Vi observerte at Gomisin N signifikant nedregulerte proteinnivåene til både MC1R og adenylylcyklase 2 på en doseavhengig måte (Figur 3A–C). Som forventet,Gomisin N-behandlede celler viste også reduserte proteinnivåer av MITF og dets kjente mål tyrosinase, TRP-1 og TRP-2 (Figur 3A, D–G). Disse funnene tyder på at Gomisin N hemmersmelanin-produserende enzymer ved å inaktivere MITF via MC1R-signalveien.

2.4. Effekter av Gomisin N på fosforyleringen av Akt og ERK1/2 i Melan-A-celler

PI3K/Akt- og MAPK/ERK-veiene er kjent for å være involvert i melanogenese ved transkripsjonelt eller post-transkripsjonelt regulerende MITF [29,30]. For å evaluere om GomisinN påvirker disse signalveiene, vurderte vi fosforyleringsstatusen til Akt og ERK1/2 byWestern blot-analyse. Som vist i figur 3H–J, høydosebehandling (30 µM) avGomisin Nbetydelig forbedret fosforyleringen av både Akt og ERK. Disse dataene indikerer at den hemmende effekten av Gomisin N påmelanogeneseer sannsynligvis assosiert med P13K/Akt- og MAPK/ERK-veiene.

2.5. Gomisin N hemmet melanogenese i sebrafiskembryoer

Vi hadde deretter som mål å undersøke om Gomisin N er effektiv til å hemmemelanogenesein vivo. Til denne slutten behandlet vi sebrafiskembryoer med Gomisin N i 72 timer i konsentrasjoner på 1, 10, 20 og 30 µM, og målte deretter ekspresjonsnivåer av melanogene proteiner. Vi observerte at Gomisin N-behandling hemmet melanindannelse ved utvikling av sebrafiskembryoer.Gomisin N-behandlede embryoer viste en reduksjon i melanininnhold på en konsentrasjonsavhengig måte sammenlignet med den ubehandlede kontrollen (Figur 4). Vi fant også at proteinnivåene avtyrosinase, MITF, TRP-1 og TRP-2 ble redusert ved Gomisin N-behandling (figur 5). Disse resultatene viser at Gomisin N hemmer melanogenese in vivo ved å regulere transkripsjonsfaktoren MITF og dens måltyrosinase, TRP-1 og TRP-2.

2.6. Gomisin N reverserte Rapamycin-indusert melanogenese i humant MNT-1

Selv om Gomisin N hemmet betydeligmelanogenesei Melan-A- og B16-celler så vel som insebrafiskembryoer, så vi ikke effekten på humane MNT-1-melanomceller. Vi forventet at effekten av Gomisin N kunne påvises i MNT-1-celler under tilstanden der melanogenese oppreguleres av en passende stimulus. Rapamycin har vist seg å indusere melanogenese ved å øke tyrosinaseaktivitet og proteinnivåer av MITF, tyrosinase, TRP-1 og TRP-2 [31], delvis gjennom aktivering av autofagi [32]. Vi overvåket nivåene avtyrosinase, MITF,TRP-1 og TRP-2 i MNT-1-celler ved Western blot-analyse, etter samtidig behandling med Gomisin N andrapamycin. Rapamycin-behandling induserte signifikant MITF-, TRP-1- og TRP-2-nivåer, men hadde ingen effekt påtyrosinasenivåer (Figur 6). Gomisin N-behandling reverserte imidlertid effekten av rapamycin på MITF, TRP-1 og TRP-2 signifikant på en konsentrasjonsavhengig måte. Den omvendte effekten avGomisin Nmot rapamycin var mer lovende ved konsentrasjonen på 20 og 30 µM enn 10 µM. Disse resultatene tyder på at Gomisin N hemmermelanogenesei humane MNT-1 melanomceller ved å regulere transkripsjonsfaktoren MITF og dens mål TRP-1 og TRP-2.

3. Diskusjon

Hovedfunksjonen til melanin er å beskytte hudceller mot UV-stråling [33–35]. Hyperpigmentering, et resultat av en overproduksjon av melanin i huden, forårsaker uønskede kosmetiske bekymringer og er assosiert med dermatitt og hudkreft. Flere rapporter har foreslåttmelanogenesesom et viktig mål for behandling av metastatisk melanom [36,37]. Dermed er det et økende behov for å utvikle anti-melanogene midler som regulerer melanogenese uten cellulær toksisitet [38]. Det er flere veier involvert i hudmelanogenese [39,40]. Ved ligandbinding øker MC1R aktiviteten til adenylylcyklase, som deretter øker intracellulære nivåer av cAMP [41,42]. Den cAMP-avhengige aktiveringen av PKA/CREB-veien har blitt rapportert mye for å oppregulere transkripsjonelle nivåer av MITF, og derved forbedre melaninsyntesen [43]. MITF fungerer som en hovedregulator for de tre store melanogene enzymene tyrosinase, TRP-1 og TRP-2i virveldyr [3,21,44]. Disse enzymene er transmembrane proteiner lokalisert i melanosomalmembranen til melanocytter. Tyrosinase regulerer det hastighetsbegrensende trinnet innmelanogeneseved å konvertere L-tyrosinase til L-DOPA [23]. TRP-1 og TRP-2 spiller også viktige roller i melaninsyntesen, selv om funksjonene deres ikke er fullt ut forstått.

I denne studien viste Gomisin N, en lignanforbindelse av S. chinensis depigmenterende aktivitet uten cellulær toksisitet. Gomisin N hemmet melaninsyntese i dyrkede pattedyrcellelinjer så vel som i sebrafiskembryoer. Gomisin N så ut til å være mer effektiv enn den positive kontrollen PTU som hemmer melaninproduksjonen i Melan-A-celler (figur 1B). Gomisin N reduserte melanininnholdet på en konsentrasjonsavhengig måte. Sammenlignet med den ubehandlede kontrollgruppen, 10 µM avGomisin Nreduserte melanininnholdet med omtrent 40 prosent, uten cellulær toksisitet. Den anti-melanogene aktiviteten til 10-µM Gomisin N var sammenlignbar med den til 100-µM PTU i Melan-A-celler. På samme måte så Gomisin Na ut til å være mer potent enn PTU i -MSH-aktiverte B16F10-celler, der effekten av 5- og 10-µM Gomisin N var sammenlignbar med effekten av 10- og {{12 }}µM PTU, henholdsvis (figur 1C). NHEM-celler behandlet med Gomisin N viste reduserte nivåer av L-DOPA, noe som tyder på at GomisinN hemmertyrosinaseaktivitet i dyrkede celler (figur 1E). Disse funnene førte til at vi videre undersøkte den underliggende mekanismen som Gomisin N hemmer melanogenese.

Vi undersøkte omGomisin Nmodulerer direkte den katalytiske aktiviteten tiltyrosinasein vitro. I motsetning til Kojic acid, viste ikke Gomisin N hemmende effekter på sopptyrosinaseaktivitet (Figur 2A). Imidlertid ble den cellulære tyrosinaseaktiviteten i B16 melanomcellelysater betydelig nedregulert av Gomisin N både med og uten -MSH-behandling (figur 2B,C). Inhibering av cellulær tyrosinaseaktivitet til Gomisin N ved -MSH-stimulus ble funnet å være mer signifikant enn den for den positive kontrollen Kojic acid (figur 2C).

Vi postulerte at den anti-melanogene funksjonen til Gomisin N kan skje gjennom transkripsjonell eller post-transkripsjonell regulering av tyrosinase og tyrosinase-relaterte proteiner (TRPs). For å validere dette målte vi ekspresjonsnivåer av signalmolekyler i MC1R-banen, en viktig determinant for kvantitet og kvalitet på melaninproduksjonen i melanocytter. Forventet observerte vi at Gomisin N reduserte nivåene av MC1R og adenylylcyklaser 2 i Melan-A-celler (figur 3A–C). Dessuten,Gomisin Nnedregulerte uttrykket av MITF og dets målproteiner, inkludert tyrosinase, TRP-1 og TRP-2 (figur 3A,D–G). Disse resultatene tyder på at de reduserte nivåene av melanininnhold etter Gomisin N-behandling skyldes deaktivering av MC1R-banen.

På den annen side kan PI3K/Akt- og MAPK/ERK-veiene fosforylere MITF, og kan derved post-transkripsjonelt modulere aktiviteten [45]. Imidlertid er den samlede effekten av aktiveringen av PI3K/Akt- og MAPK/ERK-banene imelanogeneseer kontroversiell. Både PI3K/Akt- og MAPK/ERK-veiene er konstitutivt aktivert i humane melanomer på grunn av akkumulerte mutasjoner [46]. C2-ceramid-mediert depigmentering i Mel-Ab-celler er kjent for å skje gjennom en reduksjon i p-Akt-nivåer [47]. Det er flere naturlige forbindelser som aktiverer melanogenese ved å oppregulere p-ERK-nivåer i B16 melanomceller [28]. Derimot er det også bevis på at forhøyede p-ERK- og p-Akt-nivåer hemmer melaninsyntesen [28,48]. Kompleksitetsinreguleringen av melanogenese kan delvis forklares av det faktum at fosforylering øker transkripsjonsaktiviteten til MITF, men induserer samtidig ubiquition-proteosomavhengig nedbrytning av MITF [26,49–51]. Dataene våre viste at både p-Akt- og p-ERK-nivåer ble oppregulert i Gomisin N-behandlede Melan-A-celler (figur 3H–J). Dette innebærer at PI3K/Akt- og MAPK/ERK-veiene kan bidra til å hemme melaninproduksjonen.

Vi validerte videre den anti-melanogene aktiviteten til Gomisin N i sebrafisken in vivo-modellen. Gomisin N-behandlede sebrafiskembryoer viste en signifikant reduksjon i melaninpigmentering (Figur 4). I tillegg reduserte Gomisin N nivåene avtyrosinase, MITF, TRP-1 og TRP-2 i utviklingen av sebrafiskembryoer. Disse funnene tyder samlet på detGomisin Ninduserer depigmentering ved å nedregulere uttrykket av MITF og melanogene enzymer in vivo. Den anti-melanogene aktiviteten til Gomisin N ble ytterligere bekreftet i humane melanom MNT-1-celler stimulert av rapamycin. Selv om Gomisin N bare resulterte i små endringer i melanininnholdet i MNT-1-celler (figur 1D), var det effektivt å reversere rapamycinindusert oppregulering av MITF, TRP-1 og TRP-2 i en konsentrasjonsavhengig måte (Figur 6A,C–E). Samlet sett er den regulatoriske effekten avGomisin Npå MITF og melanogene enzymer ble reproduserbart funnet i muse- og menneskeceller så vel som i sebrafiskembryoer.

For å oppsummere antyder dette arbeidet at Gomisin N kan ha et høyt potensial som romanhudblekingmiddel. Gomisin N ser ut til å hemmemelanogeneseved å undertrykke uttrykket av MITF via MC1R-banen, i stedet for å direkte modulere den katalytiske aktiviteten tiltyrosinaseog TRP-er. Selv om detaljerte mekanismer gjenstår å bli belyst, er Gomisin N-indusert depigmentering sannsynligvis assosiert med aktiveringen av PI3K/Akt- og MAPK/ERK-veiene (figur 7).

4. Materialer og metoder

4.1. Materialer

RPMI1640 ble kjøpt fra Gibco-BRL (Gaithersburg, MD, USA). Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), føtalt bovint serum (FBS) og penicillin-streptomycin (PS) ble kjøpt fra Hyclone (Carlsbad, CA, USA). Melanocyttvekstmedium ble kjøpt fra PromoCell (Heidelberg, Tyskland). Fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 12-O-tetradekanoylforbol-13-acetat(TPA), Kojinsyre, 1-fenyl-2-tiourea (PTU), sopptyrosinase, 3,{{ 9}}dihydroksy-l-fenylalanin(L-DOPA), -MSH, dimetylsulfoksid (DMSO) og paraformaldehyd ble kjøpt fra SigmaChemical Co. (St. Louis, MO, USA).Gomisin Nforbindelsen ble levert av Chul Young Kim (Hanyang University, Ansan, Korea). Rapamycin ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

4.2. Cellekultur

Musemelanomcellelinjen B16F10 ble levert fra Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea). Murine melanocytt Melan-A-celler [52] var en sjenerøs gave fra Dr. Byeong Gon Lee (SkinResearch Institute, Amore Pacific Co., Yongin) -si, Korea). Humane MNT-1 melanomceller ble generøst levert av Aeyeong Lee (Collage of Medicine ved Dongguk University, Goyang-si, Korea). Primære normale humane epidermale melanocytter (NHEM) ble kjøpt fra PromoCell (Heidelberg, Tyskland). Melan-A-celler ble dyrket i RPMI 1640-medium (Gibco, Carlsbad, CA, USA) supplert med 10 prosent FBS, 1 prosent PS og 200 nM TPA. DMEM supplert med 10 prosent FBS og 1 prosent PS ble brukt for å opprettholde Melan-A-celler og NHEM-celler. Alle cellene ble inkubert ved 37 ◦C i en 5 prosent CO2-inkubator.

4.3. Måling av melanininnhold

Melan-A-celler ble sådd i en 24-brønnplate (1 × 105 celler/brønn), behandlet medGomisin Nog deretter inkubert i 72 timer. Etter 72 timer ble melanininnholdet målt som tidligere beskrevet [53]. Kort fortalt, etter fjerning av kulturmediet, ble cellene vasket tre ganger med PBS. Deretter ble natriumhydroksidløsning (1 ml, 1 N) tilsatt til hver brønn for å løse opp melanin. Absorbansen ved 405 nm ble målt ved bruk av en mikroplateleser. Denne analysen ble gjentatt med B16F10-celler (2 × 104 celler/brønn) og MNT{10}}-celler etter samme metode.

4.4. Western blot-analyse

Melan-A-celler ble sådd i 100 mm skåler (1 × 106 celler/skål) og behandlet med 1, 5 eller 10 µMGomisin Ni tre dager ved 37 ◦C. Celler ble vasket med PBS og deretter høstet ved bruk av en skrape. Løsne celler ble satt i 1 ml PBS og sentrifugert ved 75 00 rpm i 5 min. Etter fjerning av den øvre oppløsningen ble cellepellets lysert med lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0,1 prosent SDS, 150 mM NaCl, 1 prosent NP-40, 0,02 prosent natriumazid, 0,5 prosent natriumdeoksycholat, 100 µg/ml PMSF, 1 g/ml aprotinin) i 24 timer ved 4 ◦C. Totale proteiner ble ekstrahert ved hjelp av en ultrasentrifuge ved 12,000 rpm i 30 minutter ved 4◦C. Proteininnholdet ble målt ved bruk av Bradford-analysen. Proteiner (30 ug) ble separert ved bruk av en 10 prosent natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) gel og overført til anitrocellulosemembran. Membranen ble blokkert i 1 time med 5 prosent skummet melk i Tris-bufret saltvann med Tween-20 (TBST), og deretter inkubert i 12 timer ved 4 ◦C med primære antistoffer rettet mot -tubulin (Santa Cruz, CA, USA ), MITF (cellesignalering, Danvers, MA, USA), tyrosinase (cellesignalering), ERK(cellesignalering), fosfo-ERK (cellesignalering), AKT (cellesignalering), fosfo-AKT (cellesignalering), MC1R ( Santa Cruz), adenylylcyklaser 2 (Santa Cruz), TRP-1 (Santa Cruz) og TRP-2 (Santa Cruz). Etter fjerning av primære antistoffer ble membranene vasket tre ganger med TBST og inkubert med sekundært antistoffer (kanin anti-geit IgG-HRP; mus anti-kanin HRP, Santa Cruz) i 1 time. Membranene ble behandlet med forsterket kjemiluminescensreagens ved bruk av ChemiDoc XRS pluss bildesystem (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Densitometrisk analyse av båndene ble utført ved hjelp av Image MasterTM 2D Elite-programvare (versjon 3.1, GE Healthcare, Chicago, IL, USA).

4.5. Tyrosinaseaktivitetsanalyse

For å estimere den hemmende effekten av Gomisin N på sopptyrosinaseaktivitet ble tyrosinase inkubert med 1, 5 eller 10 µMGomisin Neller den positive kontrollen Kojic acid. Hver prøve ble oppløst i metanol. L-DOPA (8,3 mM) og sopptyrosinase (125 U) ble fortynnet i 80 mM fosfatbuffer (pH 6,8). 40 µL av hver prøve og 120 µL L-DOPA ble blandet i en 96-brønnplate, etterfulgt av tilsetning av 40 µL fortynnet sopptyrosinase. Platene ble deretter inkubert i 15 minutter, og absorbansen ble målt ved 490 nm ved bruk av en mikroplateleser.

Tyrosinaseaktivitet i B16 melanomcellelysater ble målt med eller uten -MSH-behandling, som tidligere beskrevet av Ohguchi et al. [54], med små modifikasjoner. Cellelysat ble fremstilt som beskrevet ovenfor i Western Blot-analysedelen. Totale proteiner i supernatanten ble målt ved Bradford-analyse ved bruk av bovint serumalbumin som standard [55]. En lik mengde proteiner ble fortynnet og brukt til tyrosinaseaktivitetsanalysen.

hemme tyrosinaseaktivitet

4.6. L-DOPA-farging i NHEM-celler

NHEM-celler ble sådd i en {{0}}brønnplate og inkubert i 72 timer med Gomisin N. Celler ble fiksert med 4 prosent paraformaldehyd i 40 min, etterfulgt av behandling med 0,1 prosent Triton X{ {6}} i 2 min. L-DOPA (0,1 prosent) ble tilsatt til hver brønn, etterfulgt av inkubering i 2 timer. Etter fjerning av løsningen ble cellene vasket to ganger med PBS. Bildene ble fotografert med mikroskop.

4.7. Sebrafiskeksperimenter

Sebrafiskembryoer ble hentet fra Zebrafish Resource Bank (Daegu, Korea). Embryoene ble behandlet med Gomisin N i 72 timer. Den depigmenterende effekten avGomisin Npå sebrafisk ble embryoer observert under stereomikroskopet. For Western blot-analyse ble Gomisin N-behandlede embryoer lysert ved bruk av lyseringsbuffer, hvorfra totale proteiner ble fremstilt som nevnt ovenfor.

5. Konklusjoner

Resultatet vårt støtter oppfatningen om at Gomisin N har et høyt potensial for bruk som funksjonell mat oghudblekingmiddel.Gomisin Ner en av de viktigste lignanforbindelsene i S. Chinensis. Faktisk. Chinensis er en urtemedisin som brukes til å kurere mange menneskelige sykdommer. Imidlertid er ytterligere epidemiologiske studier nødvendig for å bevise sikkerheten til Gomisin N på huden. Følgelig vil in vivo-studier og kliniske studier tydeligere kunne demonstrere effektiviteten til GomisinN. Avslutningsvis antyder denne studien detGomisin Nkan være et potensielt hypopigmentært middel og naturlighudblekingkandidat for kosmetikkindustrien.

cistanche forbedre bleking

Referanser

1. Alaluf, S.; Atkins, D.; Barrett, K.; Blount, M.; Carter, N.; Heath, A. Virkningen av epidermal melanin på objektive målinger av menneskelig hudfarge. Pigment Cell Res. 2002, 15, 119–126. [CrossRef] [PubMed]

2. D'Mello, SA; Finlay, GJ; Baguley, BC; Askarian-Amiri, ME signalveier i melanogenese. Int. J.Mol. Sci. 2016, 17, 1144. [CrossRef] [PubMed]

3. Slominski, A.; Tobin, DJ; Shibahara, S.; Wortsman, J. Melaninpigmentering i pattedyrhud og dens hormonelle regulering. Physiol. Rev. 2004, 84, 1155–1228. [CrossRef] [PubMed]

4. Herrling, T.; Jung, K.; Fuchs, J. Melaninets rolle som beskytter mot frie radikaler i huden og rollen som friradikalindikator i hår. Spectrochim Acta A Mol. Biomol. Spectrosc. 2008, 69, 1429–1435. [CrossRef] [PubMed]

5. Brozyna, AA; Jozwicki, W.; Roszkowski, K.; Filipiak, J.; Slominski, AT Melanininnhold i melanommetastaser påvirker resultatet av strålebehandling. Oncotarget 2016, 7, 17844–17853. [CrossRef] [PubMed]

6. Slominski, A.; Wortsman, J.; Plonka, PM; Schallreuter, KU; Paus, R.; Tobin, DJ Pigmentering av hårsekk.J. Undersøk. Dermatol. 2005, 124, 13–21. [CrossRef] [PubMed]

7. Slominski, A.; Zmijewski, MA; Pawelek, J. L-tyrosin og L-dihydroksyfenylalanin som hormonlignende regulatorer av melanocyttfunksjoner. Pigment Cell Melanoma Res. 2012, 25, 14–27. [CrossRef] [PubMed]

8. Lee, AY Nylig fremgang i melasmapatogenese. Pigment Cell Melanoma Res. 2015, 28, 648–660. [CrossRef][PubMed]9. Speeckaert, R.; van Gele, M.; Speeckaert, MM; Lambert, J.; van Geel, N. Biologien til hyperpigmenteringssyndromer. Pigment Cell Melanoma Res. 2014, 27, 512–524. [CrossRef] [PubMed]

10. Slominski, RM; Zmijewski, MA; Slominski, AT Rollen til melaninpigment i melanom. Exp. Dermatol.2015, 24, 258–259. [CrossRef] [PubMed]11. Slominski, A.; Wortsman, J.; Tobin, DJ Det kutane serotoninerge/melatoninerge systemet: Sikring et sted under solen. FASEB J. 2005, 19, 176–194. [CrossRef] [PubMed]

12. Sarkar, R.; Arora, P.; Garg, KV Cosmeceuticals for Hyperpigmentation: Hva er tilgjengelig? J. CutaneousAesthet. Surg. 2013, 6, 4–11. [CrossRef] [PubMed]

13. Miyamura, Y.; Coelho, SG; Wolber, R.; Miller, SA; Wakamatsu, K.; Zmudzka, BZ; Ito, S.; Smuda, C.; Passeron, T.; Choi, W.; et al. Regulering av menneskelig hudpigmentering og respons på ultrafiolett stråling. Pigment Cell Res. 2007, 20, 2–13. [CrossRef] [PubMed]

14. Davis, EC; Callender, VD Postinflammatorisk hyperpigmentering: En gjennomgang av epidemiologien, kliniske funksjoner og behandlingsalternativer i farget hud. J. Clin. Aesthet. Dermatol. 2010, 3, 20–31. [PubMed]

15. Salg-Campos, H.; Souza, PR; Peghini, BC; da Silva, JS; Cardoso, CR En oversikt over de modulerende effektene av oljesyre i helse og sykdom. Mini. Rev. Med. Chem. 2013, 13, 201–210. [CrossRef] [PubMed]

16. Parvez, S.; Kang, M.; Chung, HS; Cho, C.; Hong, MC; Shin, MK; Bae, H. Undersøkelse og mekanisme for huddepigmentering og lysende midler. Phytother. Res. 2006, 20, 921–934. [CrossRef] [PubMed]

17. Luo, L.; Jiang, L.; Geng, C.; Cao, J.; Zhong, L. Hydrokinon-indusert genotoksisitet og oksidativ DNA-skade i HepG2-celler. Chem. Biol. Samhandle. 2008, 173, 1–8. [CrossRef] [PubMed]

18. Enguita, FJ; Leitao, AL Hydrokinon: Miljøforurensning, toksisitet og mikrobielle svar. BioMed Res. Int. 2013, 2013, 542168. [CrossRef] [PubMed]

19. Draelos, ZD Hudlysnende preparater og hydrokinonkontroversen. Dermatol. Ther. 2007, 20 308–313. [CrossRef] [PubMed]

20. Koo, JH; Lee, I.; Yun, SK; Kim, HU; Park, BH; Park, JW Forsåpet nattlysolje reduserer melanogenese i B16 melanomceller og reduserer UV-indusert hudpigmentering hos mennesker. Lipider 2010,45, 401–407. [CrossRef] [PubMed]

21. Cordell, GA; Colvard, MD Naturprodukter og tradisjonell medisin: Å slå på et paradigme. J. Nat. Prod.2012, 75, 514–525. [CrossRef] [PubMed]

22. Panossian, A.; Wikman, G. Pharmacology of Schisandra Chinensis Bail: En oversikt over russisk forskning og bruk i medisin. J. Ethnopharmacol. 2008, 118, 183–212. [CrossRef] [PubMed]

23. Chen, P.; Pang, S.; Yang, N.; Meng, H.; Liu, J.; Zhou, N.; Zhang, M.; Xu, Z.; Gao, W.; Chen, B.; et al. Fordelaktige effekter av Schisandrin B på hjertefunksjonen i musemodell av hjerteinfarkt. PLoS ONE 2013, 8,e79418. [CrossRef] [PubMed]

24. Lee, HJ; Jo, S.; Ryu, J.; Jeong, HS; Lee, G.; Ryu, MH; Jung, MH; Kim, H.; Kim, BJ Effekter av SchisandraChinensis Turcz. frukt på kontaktdermatitt indusert av dinitrofluorbenzen hos mus. Mol. Med. Rapport 2015,12, 2135–2139. [CrossRef] [PubMed]

25. Chun, JN; Cho, M.; Så jeg.; Jeon, JH De beskyttende effektene av Schisandra Chinensis fruktekstrakt og dets lignaner mot kardiovaskulær sykdom: En gjennomgang av de molekylære mekanismene. Fitoterapia 2014, 97, 224–233.[CrossRef] [PubMed]

26. Kang, OH; Chae, HS; Choi, JH; Choi, HJ; Park, PS; Cho, SH; Lee, GH; Så, HEI; Choo, YK;Kweon, OH; et al. Effekter av Schisandra Fructus vannekstrakt på cytokinfrigjøring fra en humanmastcellelinje. J. Med. Mat 2006, 9, 480–486. [CrossRef] [PubMed]

27. Poma, A.; Bianchini, S.; Miranda, M. Hemming av L-tyrosin-indusert mikronuclei-produksjon av fenyltiourea i humane melanomceller. Mutat. Res. 1999, 446, 143–148. [CrossRef]

28. Kim, HJ; Kim, IS; Dong, Y.; Lee, IS; Kim, JS; Kim, JS; Wow, JT; Cha, BY Melanogenese-induserende effekt av cirsimaritin gjennom økninger i mikroftalmiassosiert transkripsjonsfaktor og tyrosinaseekspresjon. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 8772–8788. [CrossRef] [PubMed]

29. Busca, R.; Abbe, P.; Mantoux, F.; Aberdam, E.; Peyssonnaux, C.; Eychene, A.; Ortonne, JP; Ballotti, R. Rasmedierer den cAMP-avhengige aktiveringen av ekstracellulære signalregulerte kinaser (ERKs) i melanocytter.EMBO J. 2000, 19, 2900–2910. [CrossRef] [PubMed]

30. Busca, R.; Ballotti, R. Cyclic AMP en nøkkelbudbringer i reguleringen av hudpigmentering. Pigment Cell Res.2000, 13, 60–69. [CrossRef] [PubMed]

31. Hah, YS; Cho, HY; Lim, TY; Park, DH; Kim, HM; Yoon, J.; Kim, JG; Kim, CY; Yoon, TJ Induksjon av melanogenese av rapamycin i humane MNT-1 melanomceller. Ann. Dermatol. 2012, 24, 151–157. [CrossRef][PubMed]

32. Yun, WJ; Kim, EY; Park, JE; Jo, SY; Bang, SH; Chang, EJ; Chang, SE Mikrotubuli-assosiert proteinlett kjede 3 er involvert i melanogenese via regulering av MITF-ekspresjon i melanocytter. Sci. Rapport.2016, 6, 19914. [CrossRef] [PubMed]

33. Spritz, RA; Hørsel, VJ, Jr. Genetiske forstyrrelser av pigmentering. Adv. Nynne. Genet. 1994, 22, 1–45. [PubMed]

34. Kadekaro, AL; Chen, J.; Yang, J.; Chen, S.; Jameson, J.; Swope, VB; Cheng, T.; Kadakia, M.; Abdel-Malek, Z. -melanocytt-stimulerende hormon undertrykker oksidativt stress gjennom ap53-mediert signalvei i humane melanocytter. Mol. Kreft Res. 2012, 10, 778–786. [CrossRef] [PubMed]

35. Wasmeier, C.; Hume, AN; Bolasco, G.; Seabra, MC Melanosomes på et øyeblikk. J. Cell Sci. 2008, 121 3995–3999. [CrossRef] [PubMed]

36. Brozyna, AA; Jozwicki, W.; Carlson, JA; Slominski, AT Melanogenese påvirker total og sykdomsfri overlevelse hos pasienter med stadium III og IV melanom. Nynne. Pathol. 2013, 44, 2071–2074. [CrossRef] [PubMed]

37. Slominski, A.; Kim, TK; Brozyna, AA; Janjetovic, Z.; Brooks, DL; Schwab, LP; Skobowiat, C.; Jozwicki, W.;Seagroves, TN Rollen til melanogenese i reguleringen av melanomatferd: Melanogenese fører til stimulering av HIF-1-uttrykk og HIF-avhengige ledsagende veier. Arch. Biochem. Biofys. 2014, 563,79–93. [CrossRef] [PubMed]

38. Kim, HJ; Lee, JH; Shin, MK; Hyun Leem, K.; Kim, YJ; Lee, MH Hemmende effekt av Gastrodia elata-ekstrakt på melanogenese i HM3KO-melanomceller. J. Cosmet. Sci. 2013, 64, 89–98. [PubMed]

39. Hemesath, TJ; Pris, ER; Takemoto, C.; Badalian, T.; Fisher, DE MAP kinase kobler transkripsjonsfaktoren mikroftalmi til c-Kit-signalering i melanocytter. Nature 1998, 391, 298–301. [PubMed]

40. Pris, ER; Ding, HF; Badalian, T.; Bhattacharya, S.; Takemoto, C.; Yao, TP; Hemesath, TJ; Fisher, DELineage-spesifikk signalering i melanocytter. C-kit-stimulering rekrutterer p300/CBP til mikroftalmi.J. Biol. Chem. 1998, 273, 17983–17986. [CrossRef] [PubMed]

41. Bertolotto, C.; Abbe, P.; Hemesath, TJ; Bille, K.; Fisher, DE; Ortonne, JP; Ballotti, R. Microphthalmiagene-produkt som en signaltransduser i cAMP-indusert differensiering av melanocytter. J. Cell Biol. 1998, 142.827–835. [CrossRef] [PubMed]

42. Pogenberg, V.; Ogmundsdottir, MH; Bergsteinsdottir, K.; Schepsky, A.; Phung, B.; Deineko, V.; Milewski, M.; Steingrimsson, E.; Wilmanns, M. Begrenset leucin-glidelåsdimerisering og spesifisitet av DNA-gjenkjenning av melanocyttmasterregulatoren MITF. Genes Dev. 2012, 26, 2647–2658. [CrossRef] [PubMed]

43. Flaherty, KT; Hodi, FS; Fisher, DE Fra gener til medikamenter: Målrettede strategier for melanom. Nat. Rev. Cancer2012, 12, 349–361. [CrossRef] [PubMed]

44. Lee, TH; Seo, JO; Baek, SH; Kim, SY Hemmende effekter av resveratrol på melaninsyntese i ultrafiolett B-indusert pigmentering i marsvin. Biomol. Ther. 2014, 22, 35–40. [CrossRef] [PubMed]

45. Su, TR; Lin, JJ; Tsai, CC; Huang, TK; Yang, ZY; Wu, MO; Zheng, YQ; Su, CC; Wu, YJ Inhibering av melanogenese av gallussyre: Mulig involvering av PI3K/Akt, MEK/ERK og Wnt/-cateninsignalveiene i B16F10-celler. Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 20443–20458. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Yajima, I.; Kumasaka, MY; Thang, ND; Goto, Y.; Takeda, K.; Yamashita, O.; Iida, M.; Ohgami, N.; Tamura, H.; Kawamoto, Y.; et al. RAS/RAF/MEK/ERK og PI3K/PTEN/AKT Signalering ved Malignt Melanom Progresjon og terapi. Dermatol. Res. Prak. 2012, 2012, 354191. [CrossRef] [PubMed]

47. Kim, DS; Kim, SY; Moon, SJ; Chung, JH; Kim, KH; Cho, KH; Park, KC Ceramide hemmer celleproliferasjon gjennom AKT/PKB-inaktivering og reduserer melaninsyntesen i Mel-Ab-celler. Pigment Cell Res. 2001, 14, 110–115. [CrossRef] [PubMed]

48. Kim, JH; Baek, SH; Kim, DH; Choi, TY; Yoon, TJ; Hwang, JS; Kim, MR; Kwon, HJ; Lee, CH Nedregulering av melaninsyntese ved å ha A og dens anvendelse på in vivo lynmodell. J. Investig. Dermatol. 2008, 128, 1227–1235. [CrossRef] [PubMed]

49. Hartman, ML; Czyz, M. MITF i melanom: Mekanismer bak dets uttrykk og aktivitet. Cell Mol.Life Sci. 2015, 72, 1249–1260. [CrossRef] [PubMed]

50. Kim, DS; Hwang, ES; Lee, JE; Kim, SY; Kwon, SB; Park, KC Sphingosine-1-fosfat reduserersmelaninsyntese via vedvarende ERK-aktivering og påfølgende MITF-nedbrytning. J. Cell Sci. 2003, 116,1699–1706. [CrossRef] [PubMed]

51. Xu, W.; Gong, L.; Haddad, MM; Bischof, O.; Campisi, J.; Ja, ET; Medrano, EE Regulering av mikroftalmi-assosierte transkripsjonsfaktor MITF-proteinnivåer ved assosiasjon med theubiquitin-konjugerende enzym hUBC9. Exp. Cell Res. 2000, 255, 135–143. [CrossRef] [PubMed]

52. Bennett, DC; Cooper, PJ; Hart, IR En linje av ikke-tumorogene musemelanocytter, syngene med B16-melanomet og krever en tumorpromoter for vekst. Int. J. Cancer 1987, 39, 414–418. [CrossRef][PubMed]

53. Meira, WV; Heinrich, TA; Cadena, SM; Martinez, GR Melanogenese hemmer respirasjon i B16-F10-melanomceller, mens den forbedrer innholdet av mitokondrielle celler. Exp. Cell Res. 2017, 350, 62–72. [CrossRef][PubMed]

54. Ohguchi, K.; Tanaka, T.; Iliya, I.; Ito, T.; Iinuma, M.; Matsumoto, K.; Akao, Y.; Nozawa, Y. Gnetol som en potenttyrosinasehemmer fra slekten Gnetum. Biosci. Bioteknologi. Biochem. 2003, 67, 663–665. [CrossRef] [PubMed]

55. Uchida, R.; Ishikawa, S.; Tomoda, H. Hemming av tyrosinaseaktivitet og melaninpigmentering av 2-hydroksytyrosol. Acta Pharm. Sinica B 2014, 4, 141–145. [CrossRef] [PubMed]