Gossypitrin, en naturlig forekommende flavonoid, demper jernindusert nevronal og mitokondriell skade: del 2
Mar 16, 2022
Vær så snill og kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mer informasjon
2.5. Deteksjon av Gos-Fe(I) komplekser
En plausibel hypotese for å forklare resultatene ovenfor er at Gos danner et forbigående kompleks med Fe(ll) som letter dets oksidasjon med oksygen. Dette overgangskomplekset kunne levere elektronene sine lettere enn Fe()-sitrat, og generere et mer stabilt kompleks med Fe(Ill). Figur 6A viser et typisk spektrum av Gos med maksimal absorpsjon ved 276, 332 og 38 0 nm (svart linje). Tilsetningen av Fe() induserte en konsentrasjonsavhengig nedgang i de maksimale absorpsjonstoppene og utseendet til en ny nær 500 nm (Figur 6A). Forekomsten av en rekke spektre som stammer fra Gos-spekteret ble bekreftet av tilstedeværelsen av et isosbestisk punkt ved λiso=405 nm (se svarte prikker), som indikerer en kjemisk likevekt (kompleksering) mellom frie og komplekse Gos. Innsatsen (Figur 6A) viser dannelsen av et kompleks med støkiometri 2:1 (Gos-jern). Støkiometrien til slike Gos-jernkomplekser ble bestemt ved Jobs metode som viser et bruddpunkt ved et molforhold på 0,5.
Ytterligere bevis på korrelasjonen mellom jern og Gos ble oppnådd ved IR-spektroskopi (Figur 6B). For den frie Gos og dens jernkompleks ble bredbåndet i området 3000-4000 cm-betraktet som strekking av hydrogen- bundne hydroksylgrupper på grunn av tilstedeværelsen av vannmolekyler. v(C=O)-strekkmodusen til den frie Gos skjer ved 1654 cm-I, som har blitt forskjøvet mot 1636 cm-Iupon kompleksdannelse. Dette resultatet antyder at Fe(Ⅱ) er korrelert med karbonyloksygen [31]. Dessuten bekrefter tilstedeværelsen av v(Fe-O)-strekkvibrasjonen ved 630 cm-I dannelsen av jern-Gos-komplekset, siden fri Gos ikke viser et slikt bånd.
Figur 6.(A) Effekter av Fe(II) på Gos UV-VIS-spekteret (200-600 nm). Inkubasjonsblanding som inneholder 125 mM sukrose, 65 mM KCl, 10 mM HEPES-buffer (pH 7,2), 2 mM citrat og Gos 1,6 μM. Konsentrasjonene av Fe（I） fra topp til bunn-spor var {{12 }}, 0.16, 0.32, 0.48, {{20}}.64,0.8,0.96 og 1.12 μM.Inset∶ Jobs plot for Gos-Fe（II）-komplekset ved en konstant totalkonsentrasjon 【Fe（D）】 pluss 【Gos】=1.6 μM. Den svarte prikken indikerer det isosbestiske punktet. Pilene nedover og oppover indikerer en reduksjon og økning i absorbansverdier ved henholdsvis 380 og 500 nm. Eksperimenter ble utført ved 28 grader. Skannehastigheten var 2nm/s. En grunnlinje ble etablert med inkubasjonsblandingen pluss 1,6 μM Fe（I）.（B）Infrarøde spektra av Gos og Gos-Fe（I）. Typiske eksempler vises.
2.6. Gos forhindret Fe(III)-reduksjon ved askorbat
Jerntilstanden til jern fremmet av Gos representerer en plausibel antioksidantmekanisme siden den hindrer den katalytiske aktiviteten til Fe(II). Likevel kan Fe(III) fortsatt reduseres til sin jernholdige form av naturlige reduksjonsmidler som askorbat. Sistnevnte kan omlaste biologiske systemer med Fe(II), som deltar i Fenton-Haber-Weiss-reaksjoner, og genererer det ekstremt reaktive·OH-radikalet. For å undersøke disse mulighetene brukte vi 1,10-fenantrolin for å måle nivåene av Fe（II）-dannelse fra en Gos-løsning （100 μM）behandlet med 2 mM askorbat og forskjellige Fe（II）-konsentrasjoner （{{6} } μM). Figur 7 viser at fraværet av Gos tillot en maksimal reduksjonshastighet av Fe(II) til Fe(II) (svart linje med en helning på 5,85×10-3); denne prosessen ble imidlertid bremset av tilstedeværelsen av Gos (1-min inkubasjon, grønn linje), og etter 5 minutters inkubering med Gos, reduserte reduksjonshastigheten for Fe(I) av askorbat nesten 3 ganger (rød linje) med en helning på 2,04× 10-3). Dette resultatet viser kapasiteten til Gos til å hemme den askorbatmedierte Fe()-reduksjonen til Fe(I)
Figur 7. Gos hemmer Fe(ⅢI)-reduksjon med askorbat i fravær av rottelevermitokondrier. Eksperimentelle forhold: 125 mM sukrose, 65 mM KCl, 10 mM HEPES-buffer (pH 7,2), 1 mM sitrat, Gos 100 μM. Eksperimenter ble utført ved 28 grader. Askorbat (4 mM) og 5 mM 1,10-fenantrolin ble tilsatt etter 1 min eller 5 min med Gos-Fe(I) inkubasjon. Linjer er representative for tre analyser.
2.7. Gos beskytter mot 2-deoksyribose oksidativ nedbrytning
For å dokumentere Gos' evne til å virke fortrinnsvis på jern i stedet for frie radikaler, ble det utført konkurransestudier for å evaluere effektiviteten til Gos og to-OH-fjernere (DMSO og salisylat) for å beskytte 2,8 eller 28 mM 2-deoksyribose fra jern -mediert oksidativ skade(figur 8).·OH-fjernerne ved 20 mM beskyttet 28 mM 2-deoksyribose betydelig mindre enn 2,8 mM2-deoksyribose (p<0.05), as="" expected.="" gos="" was="" equally="" effective="" in="" preventing="" oxidative="" degradation="" of="" both="" 2.8="" and="" 28="">
Figur 8. Effekt av Gos- og·OH-fjernere dimetylsulfoksid(DMSO) og salisylat på oksidativ skade på 2,8 eller 28 mM 2-deoksyribose indusert av Fe(II)-EDTA pluss askorbat. Løsningene ble inkubert i 30 minutter ved 37 grader og inneholdt 10 mM fosfatbuffer (pH7,2), 2-deoksyribose (2,8 eller 28 mM）, 150 μM EDTA og 50 μM Fe（ⅢI） Reaksjoner ble startet ved tilsetning av askorbat til en sluttkonsentrasjon på 2 mM. Søylene viser middelverdi ±SD (n=3) Kontroller inneholder kun DMSO (0,001 prosent), som er løsningsmiddelkonsentrasjonen i Gos-prøver. Den ensidede t-testen ble brukt for*s<0.05, n.s.,="">
3. Diskusjon
Jernet som frigjøres under flere nevrodegenerative tilstander, inkludert iskemisk og hemorragisk hjerneslag, provoserer deregulering av hjernens jernhomeostase, noe som fører til patofysiologien til nevrologisk skade [4,32-34]. På subcellulære nivåer ser mitokondriell svekkelse ut til å være involvert i jernmediert nevronal død [10,15,35-38]. Preklinisk bevis støtter fordelen ved å bruke jernkelatorer, hovedsakelig deferoksaminmesylat, mot nevrodegenerasjon inkludert alle typer slag [7,16]. Imidlertid har deres høye kostnader og utilgjengelighet, og det brede spekteret av uønskede effekter av klassiske jernkelatorer, ført til bruk av naturlige chelatorer for jernbehandling ved dyshomeostase [39,40].
Cistanche kan forbedre immuniteten
Den beskyttende virkningen til Gos er vist på HT-22-celler og rotte-hjerne-mitokondrier inkubert med en jern/sitrat-blanding, der vi fant sterk beskyttelse mot jernindusert oksidativ skade. Hippocampus-HT-22-celler fra mus utsatt for jernoverbelastning (24 timer) viste redusert levedyktighet, noe som var nært assosiert med tidlig spredning av mitokondriell membranpotensial og ATP-reduksjon (henholdsvis figur 2A-C). Dette antyder at mitokondriell svekkelse bidrar til nevronal dødelighet. Faktisk, under våre forhold, forventes minst en del av Fe(II) lastet opp til nevronene å nå organellene, siden jernindusert nevronal død ble innledet av tap av mitokondriell funksjon. Derfor har det blitt vist at jernoverskudd induserer musehippocampus HT-22 celledød og mitokondriell fragmentering [41,42]. På samme måte øker vedvarende jerneksponering mitokondrielle ROS-nivåer i dopaminerge neuroblastom SHSY5Y-celler [43]. Videre ble en omfattende jerntilstrømning inn i hippocampale nevroner, samt mitokondriell skade, bekreftet etter eksponering for 100 uM jernholdig jern [36]. Her observerte vi at den Gos-induserte bevaringen av levedyktigheten til hippocampale nevroner påvirket av jern er nært knyttet til bevaringen av deres mitokondrielle membranpotensial og ATP-nivåer.
Som i intakte celler, provoserte den direkte mitokondrielle eksponeringen for jernholdig jern den omfattende hevelsen av organellen, spredning av membranpotensial og tap av ATP (henholdsvis figur 3A-C). I denne eksperimentelle settingen var Gos i stand til å beskytte jern-overbelastede mitokondrier, som ble uttrykt ved bevaring av de ovennevnte parameterne. I denne forstand har det blitt observert at mitokondrier lastet med en mikromolar konsentrasjon av jern gjennomgikk mitokondriell permeabilitetsovergang poreåpning og △Y-dissipasjon på en måte som er følsom for jernkelering, men ikke avhengig av katalase-antioksidantvirkning |44]. Interessant nok ble Mito-Tempo-antioksidanten rapportert å beskytte mot jernoverbelastningsskader i hippocampale nevroner ved å rense mitokondrielle superoksidanionradikal og bevare mitokondriell morfologisk integritet og membranpotensial [36]. Vi beskrev nylig antioksidanteffektene til denne flavonoiden og dens evne til å beskytte PC12-celler mot kjemisk hypoksi-indusert død [29], der det ble konkludert med at frie radikaler og antioksidantevnen til Gos er delvis involvert i beskyttelsen mot jernmediert HT-22 og mitokondriell skade. Imidlertid antyder den forbedrede effekten av Gos mot jernmediert lipoperoksidasjon versus tertbutylhydroperoksidmediert lipoperoksidasjon (henholdsvis figur 4A,B) at dens jerninteraksjonskapasitet er hovedmekanismen mot jernindusert skade.
For å karakterisere Gos-Fe-interaksjonen ytterligere, ble det utført flere cellefrie og mitokondrierfrie eksperimenter. Vi observerte at når polyfenol ble co-inkubert med Fe (II), avtok konsentrasjonen av metallionene, mens det var en tilsvarende økning i oksygenforbruket (Figur 5A-C). Disse effektene tyder på at Gos fjerner Fe(II) fra sitratkomplekset, og oksiderer det til en jernholdig form i en prosess som krever O2 som elektronakseptor. Følgelig fremmer Gos nedgangen av Fe(II)-konsentrasjonen som kan hindre hydroksylradikalene gjennom Fenton-reaksjoner. Siden Gos-Fe(II)-komplekset muliggjør oksidasjon av relevante reduksjonsmidler som askorbat, noe som resulterer i dannelse/regenerering av Fe(II), var vi i stand til å demonstrere at Gos hemmer den askorbat-medierte reduksjonen av Fe(II) til Fe(II).
Hypotesen om at Gos interagerer sterkt med jern ble også her bekreftet gjennom spektroskopiske teknikker, og bekreftet tidligere resultater der ulike arrays av
Gos-jern kompleks støkiometri ble karakterisert ved elektronspin ionisering massespektroskopi [45].
Disse resultatene beviste de beskyttende effektene av Gos mot jernmediert nevronal skade, sannsynligvis ved å samhandle med jernholdige ioner, og hindre dens involvering i dannelsen av katalytisk reaktive oksygenarter. Videre antyder dette dannelsen av et forbigående ladningsoverføringskompleks mellom Fe(Ⅱ) og Gos, akselererende Fe(II)-oksidasjon og dannelsen av et mer stabilt Fe(III)-Gos-kompleks som ikke kan delta i forplantningsfasen av lipid peroksidasjon. Dessuten var et biologisk relevant reduksjonsmiddel som askorbat ikke i stand til å redusere jern(III)jern i nærvær av Gos, noe som begrenser en pro-oksidant karakteristisk for visse flavonoider involvert i resirkulering av jernholdige ioner. [30]. Gos ved mikromolare konsentrasjoner var mer effektive enn klassiske rensemidler for å forhindre jernmediert oksidasjon av 2-deoksyribose. Denne høye effekten kan tilskrives dannelsen av en redoksaktiv Gos-Fe(II)/() som vi tidligere har observert for andre polyfenoler som forbedret deres ytelse som antioksidanter ved deres interaksjon med jern i forskjellige in vitro-paradigmer for oksidativ skade [ 22,46-48].
Det er fastslått at chelateringsmidler som inneholder oksygen som ligand (oksoligand, O2-) kan chelatere jern og fremme oksidasjon av Fe(I), stabilisering av Fe(II), og følgelig produsere en reduksjon i dets reduksjonspotensial49]. Ved fysiologisk pH danner katekoler lett termodynamisk stabile bis-komplekser med jern(III)jern, foretrukket av lave konsentrasjoner av liganden. Tilstedeværelsen av en katekoldel i Gos-strukturen antyder en lignende interaksjonsmekanisme med jern, som kan forklare beskyttelsen som oppnås mot jernindusert skade på nevronceller og mitokondrier. I denne forbindelse har vi også tidligere vist at mangiferin og guttiferon A stimulerer jernholdig oksidasjon og hindrer jernreduksjon [23,24,26-28].
Evnen til Gos til å chelatere jern kan også føre til signalveier som bidrar til nevrobeskyttelse. For eksempel har prolylhydroksylasedomeneenzymer (PHD), de klassiske Hypoxia Inducible Factor-lalpha(HIF-1}o) hydroksyleringsmodifiserende enzymer under normoksi, blitt identifisert som de kritiske målene for jernkelatorer som er klinisk gunstige i mange nevrologiske lidelser [50,51]. Det er forståelig siden PHD er avhengig av toverdig jern som en koblingsfaktor [52]. Flere gener som har vært involvert i nevrobeskyttelse er regulert av HIF-la, slik som eNOS, VEGF og EPO [53]. Videre kan HIF-aktivering som følge av PHD-hemming forhindre oksidativt stress-mediert mitokondriell svekkelse og apoptose, uavhengig av dens rolle som en transkripsjonsfaktor [54].
Ferroptose, den nylig karakteriserte jernavhengige regulerte celledøden, har blitt foreslått som mekanismen som nevronene som er utsatt for hemorragisk skade dør gjennom [8]. Mitokondriell dysfunksjon var nylig relatert til ferroptosecelledød [55]. Derfor kan hemming av ferroptose, som sparer mitokondriell funksjon fra jernskade, også være en plausibel mekanisme for nevrobeskyttelse mot jernmedierte nevrologiske lidelser beskyttet av Gos, som ville fortjent ytterligere oppmerksomhet. Ytterligere forskning på de antatte fordelaktige effektene av Gos på in vivo dyremodeller av jernassosiert nevrodegenerasjon må gjøres, for å foreslå denne flavonoiden som en terapeutisk intervensjon mot hjernevevsskade indusert av jernhomeostase-deregulering.