Gossypitrin, en naturlig forekommende flavonoid, demper jernindusert nevronal og mitokondrieskade del 1
Mar 16, 2022
Ta kontaktoscar.xiao@wecistanche.comhvis du vil ha mer informasjon
Abstrakt:Forstyrrelsen av jern homeostase er en viktig faktor i tap av mitokondriefunksjon i nevrale celler, noe som fører til nevrodegenerasjon. Her vurderte vi den beskyttende virkningen av gossypitrin (Gos), en naturlig forekommende flavonoid, på jernindusert nevroncelleskade ved hjelp av mus hippocampal HT-22 celler og mitokondrier isolert fra rottehjerner. Gos var i stand til å redde HT22 celler fra skaden indusert av 100 uM Fe()-citrate (EC50 8.6 uM). Denne beskyttelsen var knyttet til forebygging av både jernindusert mitokondriemembran potensiell spredning og ATP-uttømming. I isolerte mitokondrier fremkalte Gos (50uM) nesten fullstendig beskyttelse mot jernindusert mitokondrie hevelse, tap av mitokondrietransmembranepotensial og ATP-uttømming. Gos forhindret også Fe(II.)-citratindusert mitokondrie lipidperoksidasjon med en ICs0-verdi (12,45 μM) som var omtrent ni ganger lavere enn for tert-butylhydroksydindusertoksidasjon. Videre var flavonoiden effektiv i å hemme nedbrytningen av både 15 og 1,5 mM 2-deoksyribose. Det reduserte også Fe (II) konsentrasjonen med tiden, samtidig som O2-forbruket økte, og svekket reduksjonen av Fe(II) med ascorbate. Gos-Fe(I)-komplekser ble oppdaget av UV-VIS- og IR-spektroskopier, med en tilsynelatende Gos-jern-stoichiometri på 2:1. Resultatene tyder på at Gos generelt ikke fungerer som en klassisk antioksidant, men det påvirker direkte jern, ved å opprettholde det i sin ferric-form etter å ha stimulert Fe (II) oksidasjon. Metallioner vil derfor ikke kunne delta i en Fenton-type reaksjon og lipidperoksidasjonsutbredelsesfasen. Derfor kan Gos brukes til å behandle nevronsykdommer forbundet med jernindusert oksidativt stress og mitokondrieskade.
Søkeord: gossypitrin; jern; HT-22 celler; mitokondrier;nevrodegenerasjon; nevrobeskyttelse
1. Introduksjon
Jern er en viktig kofaktor i mange viktige biologiske prosesser som DNA-syntese og restaurering, oksygentransport, cellulær respirasjon, xenobiotisk metabolisme og hormonsyntese [1. Ved høye intracellulære nivåer kan det imidlertid øke cellulære reaktive oksygenarter med en modifikasjon i de cellulære redokspotensialene [2,3]. Jerndyshomeostase observeres i nesten alle nevrologiske tilstander som Parkinsons sykdom (PD), Alzheimers sykdom (AD), Huntingtons sykdom (HS), multippel sklerose, Friedreichs ataksi, epilepsi, rastløs bensyndrom og hjerneslag [4,5]. Spesielt i intracerebral blødning, hvor det er brudd på mikrovaskulaturene og blodet som slippes ut produserer en blodavledet jerneksponering av nevrale celler, er hovedmekanismene for nevrodegenerasjon jern- og hemeindusert ROS-produksjon, betennelse og eksitotoksisitet [6,7]. In vitro og in vivo eksperimentelle modeller av hjerneblødning har vist tilstedeværelsen av ferroptose, en jernavhengig form for regulert nekrose [8]. Videre tyder økende bevis på at forstyrrelse av jern homeostase er avgjørende i tap av mitokondriefunksjon i nevrale celler [9,10], noe som igjen kan føre til nevrodegenerasjon [11-14. En relasjon ble nylig rapportert mellom den tidlige formen av Parkinsons sykdom med jernmetabolisme dysregulering, og mitokondrie svekkelse [15]. Sameksistensen av relativt høye mengder både jern og ROS i mitokondrierommene gjør denne organellen utsatt for hydroksyl radikalmediert skade. Farmakologiske midler rettet mot hjernejernregulering og jernmediert mitokondriehemming kan derfor være terapeutisk nyttig mot nevrodegenerasjon. Flere jern-chelaterende midler har vist seg å vise nevrobeskyttende handlinger i forskjellige eksperimentelle modeller [16-19]. På den annen side har det vært mange rapporter om det nevrobeskyttende potensialet for naturlig forekommende polyfenoler på grunn av deres antioksidanthandlinger basert på en kombinasjon av jernsjikt og frie radikale scavenging aktiviteter [20,21]. Vår gruppe har observert at katekolholdige polyfenoler som mangiferin, guttiferone-A og rapanone samhandler med jern, både in vitro og in vivo, og dermed annullerer sin katalytiske rolle i å fremme ROS [22-28]. Vi rapporterte også nylig de potente antioksidanteffektene av gossypitrin (Gos), en naturlig forekommende flavonoid (figur 1), noe som indikerer dens potensielle bruk som et nevrobeskyttende middel [29]. Likevel er lite kjent om mekanismene som er involvert i disse antioksidanteffektene. Tilstedeværelsen av et planar seks-medlem syklisk system med elektron delocalization, en katekol moiety, og tre mer aromatiske hydroksylgrupper (to av dem ved siden av en karbonylgruppe), antyder sterkt at dette molekylet kan fungere som et jern-chelaterende middel siden dette er strukturelle egenskaper som favoriserer jernchelasjon av flavonoider 30]. Derfor er hensikten med denne studien å evaluere Gos evne til å beskytte HT-22nevronale cellerog isolert rottehjerne mitokondrier fra jernmediertoksidativ skade. Andre studier i celle/mitokondrier-frie systemer ble utført for å ytterligere karakterisere arten av Gos-jerninteraksjonen.
2. Resultater
2.1. Gos Redder HT-22 Celler fra Fe (I)-indusert celledød
Fe(II)(100 μM) reduserte HT-22 celleoverlevelse til 17,4 % etter 24 timers eksponering, som anslått av MTT-analysen. Gos forhindret hippocampal celledød på en doseavhengig måte. EC50 var 8,64± 1,58 μM (figur 2A, innsettet). Full cellebeskyttelse ble observert med 100 μM Gos var mer effektiv enn Trolox (500 uM), den velkjente hydroløselige antioksidanten, som forhindret celledød med 74%.
HT-22 eksponering for jern i 2 timer (før celledødsutførelse) forårsaket spredning av mitokondriemembranpotensialet, som estimert ved oppbevaring av rhodamin 123 i organellene (figur 2B) og ATP-uttømming (figur 2C). Dette antyder en mulig sammenheng mellom de giftige jernmedierte effektene på mitokondriene og celle levedyktigheten. Gos forhindret jernindusert doseavhengig svekkelse av mitokondriene, etter mønstrene for nevron levedyktighet som viste at det kan forhindre jernindusert HT-22 celledød gjennom mitokondriebeskyttelse.
Figur 2.Gos beskyttelse mot jernindusert nevroncelleskade. Effekter av Gos på HT-22 mus hippocampal neuron overlevelse (A), cellulær mitokondrie membran potensial (B), og cellulære ATP nivåer (C). Gos(0-100 μM) eller Trolox(500 μM) ble co-inkubert i 24 timer (levedyktighet) eller 2t (mitokondriemembranpotensial og ATP-nivåer) med 100 μM FeCl2/1 mM sitrat. Analysebetingelsene er beskrevet i avsnitt 4. Skadede kontrollceller (uten Gos) inneholdt DMSO (0,001%)pluss jernsitratblandingen. Resultatene uttrykkes som prosentandelen av celledød i forhold til den uskadede kontrollen (som inneholder DMSO0,001%som kjøretøyet). Verdier er midlene ± S.D. for tre forskjellige eksperimenter. Ulike symboler indikerer statistiske forskjeller ved p<0.05 when="" comparing="" all="" pairs="" of="" experimental="" groups="" according="" to="" the="" anova="" and="" post="" hoc="" newman-keuls="" tests.="" (if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">
Cistanche kan forbedre immuniteten
2.2. Gos Rescues Rat-Brain Mitokondrier fra jernindusert mitokondrie lipoperoxidation Hjerne mitokondrier inkubert med Fe()-citrate (50 μM) gjennomgikk en markert lipoperoksidasjon uttrykt ved en økning i dannelsen av tiobarbitursyre reaktivt stoff (figur 3A). Gos hemmet den jernmediert mitokondrie lipidperoksidasjon på en konsentrasjonsavhengig måte (IC50-verdien på 12,45±1,24 μM) (figur 3A, innsett). Effektene av Gos på tert-butylhydroksyd (300 μM)-indusert mitokondrie lipidperoksidasjon (IC50-verdi>100 μM) viser at det er mer effektivt for å forhindre jernindusert lipidperoksidasjon enn peroksylindusert lipidperoksidasjon, noe som tyder på dens evne til å handle direkte på jern (figur 3B).
Figur 3. Gos hemmer malondialdehyddannelse i mitokondriene, indusert av 50 uM Fe()-citrate (A) eller 300μM tert-butylhydroksydoksid (B). Ratbrain mitokondrier (1 mg/ml) ble inkubert i et reaksjonsmedium som inneholder 125 mM sukrose,65 mM KCl,10mM HEPES buffer(pH 7,4),2 mM succinate og 2,5 uM rotenone, med eller uten Gos (1-50 uM). Forsøkene startet med tilsetning av 50μM Fe(II) eller 300 μM tert-butylhydroksyd, bortsett fra uskadet kontroll (grå stenger). Inkubasjonsperioden var 20 min ved 28°CC. Verdier er midlene ±S.D. (n=6). Ulike symboler indikerer statistiske forskjeller ved p<0.05 when="" comparing="" all="" experimental="" groups="" according="" to="" the="" anova="" and="" posthoc="" newman-keuls="" tests.="" (if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">
2.3.Gos forhindrer jernmediert mitokondrie hevelse dissipation, og ATP uttømming
Figur 4A viser at 50μM Fe(I)-citratkompleks indusert mitokondrie hevelse som uttrykt ved en reduksjon i absorbansen ved 540nm (linje f versus linje a). Det var forbundet med en spontan og fullstendig △Y-depolarisering (figur 4B, linef versus linje a) og ATP-uttømming (figur 4C, fe()/sitratkolonne). Gos hemmet den jerninduserte hevelsesprosessen og AY-dissipasjon på en konsentrasjonsavhengig måte (figur 4A,B linjer b-e). Absorbansverdiene (gjennomsnittlig ± SD ved 7 min) fra panel A var: 0,482±0,013 (linje a), 0,459± 0,011 (linje b), 0,445± 0,007 (linje c), 0,435± 0,015(linje d), 0,360±0,011(linje e) og 0,338±0,012(linje f). Fluorescensverdiene fra panel B (gjennomsnittlig ± SD ved 7 min)var 15,03±1,71 (linje a), 19,41±2,07 (linje b), 22,29±2.. 58 (linje c), 45,505±4,47 (linje d), 118,468±5,76 (linje e) og 146,201±5,83 (linje f). Statistisk signifikante forskjeller ble funnet mellom linje f og de andre linjene, ved p<0.05. the="" naturally="" occurring="" flavonoids="" also="" prevented="" iron-mediated="" atp="" depletion="" in="" a="" concentration-dependent="" manner(figure="" 4c).="" a="" strong="" interaction="" of="" gos="" with="" iron="" is="" suggested="" as="" the="" key="" mechanism="" for="" neuroprotection="" against="" iron-induced="" damage,="" both="" in="" ht-22="" neuronal="" cells="" and="" in="" brain="" mitochondria.="" to="" further="" characterize="" this="" gos-iron="" interaction,="" different="" experiments="" on="" a="" cell/mitochondria-free="" system="" were="">
Figur 4. (A) Mitokondriell permeabilitetsovergangsinduksjon, (B)mitokondriemembranpotensial (AH)-tap, og (C) reduksjon av ATP-nivåer indusert av 50 μM Fe(II)-sitrat. A ble estimert ved hjelp av fluorescenssonden safranine (5 uM). De hemmende effektene av Gos 50,25, 10 og 1μM vises i henholdsvis linjer (b),(c), (d) og (e). Linjer (a) og(f) representerer uskadede kontroller (uten jern) og skadede kontroller (uten Gos). Rottehjerne mitokondrier (RBM-0,5 mg/ml), Fe(II) og1 μM CCCP ble tilsatt der pilene indikerte. Ulike symboler i diagrammet (C) indikerer statistiske forskjeller atp<0.05 when="" comparing="" all="" pairs="" of="" experimental="" groups="" according="" to="" the="" anova="" and="" post="" hoc="" newman-keuls="" tests.(if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">
2.4. Gos Induserer Fe(II)-Citrate Autoxidation og O, Forbruk
Gos redusert Fe() konsentrasjon (1-min preincubation) i et reaksjonsmedium som inneholder 2 mM sitrat (uten mitokondrier) på en doseavhengig måte (figur 5A, svarte sirkler). En 5-minutters forkjøpsperiode (Figur5A, røde bokser) reduserte Fe(II)-konsentrasjonen enda mer. Gos økte også hastigheten på O2-forbruket, muligens på grunn av oksidasjon av Fe(ll) til Fe(II.II)(Figur 5B,C). Disse resultatene tyder på at Gos kan fjerne Fe(II) fra sitratkomplekset og oksidere det til ferric-formen i en prosess som krever O2 som elektron-akseptor. Følgelig kan Gos hindre dannelsen av "OH-radikaler ved å inaktivere Fe (Il) som er nødvendig for Fenton-Haber-Weiss-type reaksjonen, som kan initiere lipidperoksidasjon av mitokondriemembranen.
Figur 5. (A) Gos stimulerer Fe(III.l) autoxidation i fravær av rotte hjerne mitokondrier i et standard medium supplert med 1 mM citrate, og 5 mM1,10-fenanthroline.1,10-fenanthroline ble lagt til 1 eller 5 min etter Gos-Fe (II) inkubasjonsperioden, og absorbansene ble lest på 510m. Verdier er gjennomsnittet av tre bestemmelser. * statistisk forskjell ved p<0.05 when="" comparing="" 1="" vs.="" 5min="" incubation.="" (b)effects="" of="" gos="" on="" o,="" consumption="" mediated="" fe(il)="" autoxidation="" in="" a="" standard="" medium="" supplemented="" with="" 1="" mm="" citrate="" under="" the="" following="" conditions:(a)="" no="" gos,(b)10="" um="" gos，="" （c）="" 30μm="" gos，="" （d）50="" μm="" gos，and="" （e）100μm="" gos.="" fe（ii）="" （50μm）="" was="" added="" where="" indicated="" by="" the="" arrow.="" results="" are="" representative="" of="" three="" experiments.="" (c)="" oxygen="" consumption="" rate="" (nmol="" o2/min/ml)1="" min="" after="" fe()="" addition.legends="" are="" the="" same="" as="" in(b).="" different="" symbols="" indicate="" statistical="" differences="" at=""><0.05 when="" comparing="" all="" pairs="" of="" experimental="" groups="" (in="" the="" same="" cell="" type)="" according="" to="" the="" anova="" and="" post="" hoc="" newman-keuls="" tests.="" (if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">
Denne artikkelen er hentet fra Molecules 2021, 26, 3364. https://doi.org/10.3390/molecules26113364 https://www.mdpi.com/journal/molecules
