Guy JM Cameron, et al

Akutt nyreskade(AKI) kan være dødelig og er en veldefinert risikofaktor for utvikling avkronisknyresykdom. Gruppe 2 medfødte lymfoide celler (ILC2s) er medfødte produsenter av type -2 cytokiner og er kritiske regulatorer av homeostase i perifere organer. Men vår kunnskap om deres funksjon inyreer relativt begrenset. Nyere bevis tyder på at økende ILC2-tall ved systemisk administrering av rekombinant interleukin (IL)-25 eller IL-33 beskytter mot nyreskade. Mens ILC2-er kan induseres for å beskytte mot iskemisk- eller kjemisk-indusert AKI, er virkningen av ILC2-mangel eller -deplesjon på alvorlighetsgraden av nyreskaden ukjent. For det første, fenotypen og plasseringen av ILC2-er inyreble vurdert under homeostatiske forhold.NyreILC2s uttrykte konstitutivt høye nivåer av IL-5 og var lokalisert i umiddelbar nærhet til nyrevaskulaturen. For å teste den funksjonelle rollen til ILC2s inyre, ble en eksperimentell modell for nyreiskemi-reperfusjonsskade (IRI) brukt og alvorlighetsgraden av skaden ble vurdert i villtype, ILC2-redusert, ILC2-mangelfull og ILC{{4} }utarmede mus. Overraskende nok var det ingen forskjeller i histopatologi, kollagenavsetning eller mRNA-ekspresjon av skadeassosierte (Lcn2), inflammatoriske (Cxcl1, Cxcl2 og Tnf) eller ekstracellulære matrisefaktorer (Col1a1, Fn1) etter IRI i fravær av ILC2s. Disse dataene antyder at fraværet av ILC2s ikke endrer alvorlighetsgraden avnyreskade, som antyder mulig redundans. Derfor kompenserer sannsynligvis andre mekanismer av type 2-mediert immuncelleaktivering i fravær av ILC2-er. Derfor er det usannsynlig at et tap av ILC2-er øker følsomheten for eller alvorlighetsgraden av AKI.

Nøkkelord:ILC2, gruppe 2 medfødt lymfoid celle, IL-5, IL-13,nyre, nyre, IRI, iskemi-reperfusjonsskade

For mer informasjon vennligst kontakt:emily.li@wecistanche.com

Cistanche tubulosa forhindrer nyresykdom, klikk her for å få prøven

INTRODUKSJON

Akutt nyreskade(AKI) og tilhørende patologier har dype effekter på menneskers helse (1). En vanlig årsak til AKI er nyreiskemi, som først og fremst rammer det tubulære epitelet på grunn av den høye mitokondrielle tettheten og metabolske aktiviteten i disse cellene (2); anmeldt i Devarajan (3) og Bonventre og Yang (4). Akutt tubulær nekrose svekker avfallsutskillelse, endrer vann- og elektrolyttubalanse og forårsaker robuste inflammatoriske responser; anmeldt i Bonventre og Yang (4). Tilstrømningen av nøytrofiler og monocytter bidrar til skaden, men andre medfødte immunceller kan lette returen til homeostase (5); anmeldt i Friedewald og Rabb (6). Medfødte lymfoide celler (ILC) er et nylig tillegg til denne familien og er kategorisert i 3 grupper basert på transkripsjonsfaktorene som kreves for deres utvikling og av effektorcytokinene de produserer (7). Gruppe 2 ILC (ILC2s) er potente produsenter av type 2 cytokiner, hovedsakelig interleukin (IL)-5 og IL-13 (8, 9). Disse cellene fremmer også vevsgjenoppretting etter fornærmelse i flere organer og har forskjellige funksjoner in vivo (10). For eksempel, etter respiratorisk virusinfeksjon med influensavirus, koordinerer ILC2-er reparasjon av luftveisepitelet ved å produsere vekstfaktoren amfiregulin (AREG) (11). Nylig har ILC2-er blitt undersøkt i modeller for nyreskade inkludert iskemi-reperfusjonsskade (IRI) og nefrotoksisk kjemisk-indusert skade med doksorubicin eller cisplatin (12–16). Renal IRI oppnås vanligvis ved midlertidig å begrense blodstrømmen til nyrene i 20–30 minutter, modellering av traumer fra transplantasjon eller kirurgisk inngrep (17–21). Samlet viser disse studiene at in vivo-administrasjon av rekombinante musecytokiner som aktiverer ILC2-er, nemlig IL-25 eller IL-33, er tilstrekkelig til å redusere alvorlighetsgraden av tubulær epitelcelleskade (12–16). Lignende resultater har blitt oppnådd med adoptiv overføring av ex vivo-aktiverte ILC2-er (12, 15). Mens ILC2-er kunstig kan induseres til å spre seg og beskytte mot de skadelige konsekvensene av eksperimentell nyreskade, er virkningen av ILC-{38}}mangel fortsatt ufullstendig forstått. Faktisk er andre immunceller, som har komplekse interaksjoner med ILC2-ene som regulatoriske T-celler (Treg) og alternativt aktiverte makrofager (AAM; også kjent som M2) kritiske for denne gjenbeskyttende effekten (22–25). I denne studien søkte vi ytterligere å karakterisere ILC2-er i nyrene, deres plassering i dette organet, og bestemme deres funksjonelle rolle i IRI ved å bruke en tap-av-funksjon tilnærming. Her fant vi detnyreILC2-er uttrykker konstitutivt IL- 5 og er primært lokalisert i umiddelbar nærhet til nyrevaskulaturen, innenfor adventitia. I tillegg viser vi at en reduksjon, mangel eller uttømming av ILC2s hadde minimal innvirkning på alvorlighetsgraden av IRI. Mens aktivering av ILC2-er og tilhørende amplifisering av lokal type 2-immunitet tidligere har vist seg å redusere de skadelige konsekvensene av AKI, viser resultatene våre at sammenlignbare skader oppstår i fravær av ILC2-er, noe som tyder på at ILC2-er kan være overflødige i IRI når andre kompenserende immunforsvar celler som T-celler er tilstede.

MATERIALER OG METODER

Mus

Åtte til tolv uker gammel villtype hann (WT; C57BL/6JAusb), kjøretøy (saltvannsbehandlet Icosdtr/ plus Cd4cre/ plus ), ILC2-redusert (Roraflfl/ pluss Il7rcre/ plus ), ILC{{ 8}}mangelfull (Roraflfl/flfl Il7rcre/ plus ), ILC2- utarmet (difteritoksoidbehandlet [DTx] Icosdtr/ pluss Cd4cre/ plus ), og IL-5/IL-13 doble reportermus (Il5venus/ pluss Il13td tomat/pluss) mus ble oppnådd fra Australian Bioresources (Moss Vale, Australia). Il5td tomatCre; Rosa26-CAG-RFP reporter-tracker mus ble hentet fra Jackson Labs (ref# 030926 og 007914). Alle mus som gjennomgikk kirurgi ble holdt under spesifikke patogenfrie, fysiske inneslutningsforhold 2, i individuelt ventilerte bur. Mus ble utsatt for normal romluft i et sterilisert miljø under operasjonen. Mus fikk 1 uke til å akklimatisere seg før eksperimentene ble startet og ble holdt på en 12-t dag/natt-syklus med tilgang til standard laboratoriefoder og vann ad libitum.

Flowcytometri og t-SNE-analyse

Nyrerog lungene ble samlet fra reportermus. Enkeltcellesuspensjoner ble fremstilt som beskrevet i "Fremstilling av enkeltcellesuspensjoner fra muselunge med Collagenase D-behandling" (Miltenyi Biotec GmbH, 2008; Bergisch Gladbach, Tyskland). Celler ble blokkert med Fc-blokk (renset anti-mus CD16/32; Biolegend, San Diego, USA) i 30 minutter og farget med fluorescens-konjugerte antistoffer mot målcelleoverflateantigener (tilleggstabell 1). Farge- og vasketrinn ble utført med BSA-fargebuffer (BD Biosciences, North Ryde, Australia). Prøver ble tatt på et BD LSR Fortessa X20 flowcytometer. Flowcytometridata ble analysert ved å bruke FlowJo v10.5.3 (Tree Star, Ashland, USA). Den t-distribuerte stokastiske naboinnbyggingen (t-SNE) ble utført på ILC2s (CD45 pluss Lineage [TCR [TCR TCR δ CD8 CD4 ]CD11b GR-1 B220 TER-119 CD3 NK-1 .1] IL7R pluss CD90.2 pluss ST2 pluss FSClowSSClow enkeltceller). Ved å bruke tilfeldig ned-sampling-plugin ble antallet hendelser i hver prøve normalisert til å være lik den laveste, rundet ned til nærmeste 10 hendelser. Alle populasjoner ble kombinert til én .fcs-fil ved å sette sammen de nedsamplede populasjonene. t-SNE-analysen ble utført på den sammenkjedede prøven som inneholdt de gatede populasjonene fra alle nyre- og lungeprøver kombinert. For dette ble de kompenserte kanalene som ikke ble brukt til gating vurdert under følgende t-SNE-innstillinger: Iteration 1000, Perplexity 20, Eta 224. Histogrammer ble brukt for å vise det differensielle uttrykket av celleoverflateantigener og cytokiner i lungen ognyre

Immunfluorescens Il5td tomatCre; Rosa26-CAG-RFP reporter-tracker-mus ble avlivet og perfusert intrakardialt med fosfatbufret saltvann (PBS) og deretter 4 prosent paraformaldehyd (PFA) i PBS. Nyrene ble fjernet og holdt i fersk 4 prosent PFA i 24 timer ved 4◦C og deretter vasket i PBS. Tre hundre mikrometerseksjoner ble preparert ved bruk av et vibratom. Deretter ble vevssnitt inkubert i permeabiliseringsbuffer (PBS/0,2 prosent Triton X-100/0,3M glycin) og deretter blokkert i PBS/0,2 prosent Triton X- 100/5 prosent eselserum ved 4◦C over natten. Prøver ble vasket i PBS/0,2 prosent Tween-20 én gang, deretter inkubert med primære antistoffer fortynnet i PBS/0,2 prosent Tween-20/3 prosent eselserum i romtemperatur til neste dag. Deretter ble prøvene vasket i PBS/0.2 prosent Tween-20 i 30 min, 3–4 ganger, deretter inkubert med sekundære antistoffer fortynnet i PBS/0 0,2 prosent Tween-20/3 prosent eselserum ved romtemperatur i 6–8 timer. Prøver ble vasket i PBS/0,2 prosent Tween-20 i 1 dag og deretter dehydrert i en stigende etanolserie (20, 30, 50, 70, 95, 100 prosent), 10 minutter hvert trinn . Til slutt ble nyreseksjonene tømt ved bløtlegging i metylsalisylat (M-2047; Sigma-Aldrich, Castle Hill, Australia) og deretter montert i fersk metylsalisylat på et konkavt dekkglass eller kammer. Bildene ble tatt med Nikon A1R laserskanning konfokal inkludert 405, 488, 561 og 650 laserlinjer for eksitasjon og bildebehandling med 16X/0,8 eller 25X1,1, NA Plan Apo langtidsholdbare vannnedsenkningsmål. Z-trinn ble innhentet hver 6. µm. Bildene ble behandlet med ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA) og Bitplane Imaris programvare v8 (Andor Technology PLC, Belfast, N. Ireland). Overflaterekonstruksjoner av alfa-glatt muskel-aktin-merkede blodårer ble utført med Imaris og pseudofarget basert på deres karakteristiske arkitektur og volum for å visualisere store arterier og vener. Følgende antistoffer og fortynninger ble brukt: Living Colors anti-DsRed Rabbit Polyclonal Pan Antibody (1:500; TaKaRa, Mountain View, USA), geit polyklonalt anti-alfa-glattmuskelaktin-antistoff (1:200; Abcam, Cambridge, Storbritannia ), eFluor 660 LYVE1 monoklonalt antistoff (1:300, klon ALY7, eBioscience), armensk hamster anti-mus CD3 antistoff (1:100, klon 145-2C11, Biolegend), Alexa Fluor R 488 esel anti-geit IgG (H pluss L), Alexa Fluor R 555 esel anti-kanin IgG (H pluss L) Alexa Fluor R 647 geit anti-hamster IgG (H pluss L) kryssadsorbert (1:400, ThermoFisher Scientific).

Ensidig iskemi-reperfusjonsskade

Kirurgisk anestesi ble indusert av 4 prosent isofluraninhalasjon og opprettholdt med kontinuerlig 1–1,5 prosent isofluraninhalasjon gjennom en nesekjegle. Gjennom hele prosedyren ble mus holdt på en kirurgisk plattform holdt ved 37 ± 1◦C av en digital termostatkontrollert varmematte. Nefrektomi av høyre nyre ble utført hos alle dyr. For å indusere unilateral iskemi ble karene i venstre nyre klemt fast nær nyrepedikelen i 29-min ved bruk av en ikke-traumatisk steril vaskulær klemme (Coherent Scientific; Hilton, Australia) med tilstrekkelig kraft til å forhindre blodkar til og franyreuten irreversibel skade på karene. Ensartet og rask reperfusjon avnyreble observert etter fjerning av vaskulærklemmen i alle mus. Muskel- og hudsår ble lukket med en 5/0 vicryl sutur (Johnson & Johnson Medical, North Ryde, Australia), huden ble deretter forseglet med dermalt lim (Provet, Charlestown, Australia) for å beskytte såret og forhindre infeksjon. Kontrolldyr ble utsatt for en falsk operasjon med identisk anestesitid og fikk kun en kontralateral nefrektomi. For effektiv analgesi fikk mus 0,1 mg/kg buprenorfin subkutant 30 minutter før operasjonen og deretter 0,05–0,1 mg/kg hver 8.–12. time, som kreves. Dyr ble typisk avvent av analgesi innen 4 dager etter operasjonen uten noen tegn til smerte eller plager som definert av ansiktsegenskaper ved bruk av standard musegrimasskala; som beskrevet (26). Alle mus overlevde til det forhåndsbestemte endepunktet.

Uttømming av ILC2s in vivo

ILC2s ble utarmet i Icosdtr/ plus Cd4cre/ pluss mus ved intraperitoneal injeksjon av 0.025 mg/kg DTx (Sigma-Aldrich) som tidligere beskrevet (27). DTx ble administrert 30 minutter før operasjonen og daglig deretter til endepunktet. For å bekrefte ILC2--uttømming, mottok en undergruppe av naive dyr DTx i 3 dager. Kontroll Icosdtr/ plus Cd4cre/ plus mus fikk en intraperitoneal saltvannsinjeksjon.

Histologi

Utskåretnyrerble umiddelbart delt i to langsgående gjennom hilum. Halvparten ble fikset i 10 prosent bufret formalin, inneholdende 4 prosent formaldehyd i 24 timer før midlertidig lagring i 10 prosent etanol, parafininnstøping og seksjonering. Fire mikrometer, langsgående snitt ble farget med periodic acid-Schiff (PAS) og Massons trikrom. Histopatologi ble kvantifisert ved å visualisere dilatasjon av tubuli, apoptose eller gipsdannelse av en enkeltblindet etterforsker ved bruk av en veletablert semikvantitativ metode (28), med mindre endringer som beskrevet (15). Et gjennomsnitt ble tatt av poengsummen fra dupliserte PAS-fargede seksjoner fra hvert dyr. En poengsum på 0=0 prosent av tubuli ble påvirket av de ovennevnte histopatologiske trekkene; 1=1–10 prosent ; 2=11–25 prosent ; 3=26–50 prosent ; 4=51–75 prosent ; 5=76–100 prosent . Kollagenavsetning ble vurdert ved bruk av Massons trikrom og kollagen ble identifisert som metylblått innhold mellom tilstøtende tubuli.

RNA-ekstraksjon, omvendt transkripsjon og qPCR

Halvparten av en nyre ble beholdt for genekspresjonsanalyse. Vevet ble homogenisert i 400 µl PBS ved å bruke en TissueLyser LTTM (Qiagen, Chadstone Centre, Australia) gjennom 50 svingninger per sekund i 2 minutter. To hundre mikroliter av prøven ble fjernet for andre analyser. En milliliter TRI Reagent R (Sigma-Aldrich) ble tilsatt de resterende 200 µl av prøven, som mottok ytterligere 50 oscillasjoner per sekund i 1–2 minutter til den ble fullstendig homogenisert. Etter 5 minutters inkubering ved romtemperatur og sentrifugering ved 12,000xg i 10 minutter, ble supernatanten ekstrahert og virvlet med 250 µl kloroform (Sigma-Aldrich). Etter inkubering i 10 minutter ved romtemperatur og sentrifugering ved 12,000xg i 15 minutter, ble supernatanten ekstrahert og virvlet med 500 µl 70 prosent isopropanol (Sigma-Aldrich). Prøven ble inkubert igjen i 10 minutter ved romtemperatur og ble deretter sentrifugert ved 12,000xg i 10 minutter. Supernatanten ble kastet uten å forstyrre den RNA-rike pelleten. Pelleten ble vasket to ganger med 1 ml 75 prosent RNA-kvalitet etanol (Sigma-Aldrich), sentrifugert ved 10, 000 xg i 5 minutter og supernatanten ble kastet hver gang. Pelleten ble lufttørket ved romtemperatur kort før den ble resuspendert i 80–100 µl UltraPureTM DNase/RNase-fritt dobbeltdestillert vann (ddH2O; Thermo-Fisher Scientific) og ble deretter lagret ved 80◦C før revers transkripsjon . Umiddelbart før revers transkripsjon ble RNA-utbytte bestemt ved spektrofotometrisk vurdering ved bruk av en Nanodrop2000TM (Thermo-Fisher Scientific). Fem mikroliter av hver prøve ble fortynnet i ddH2O slik at 1000 ng RNA ble lastet per prøve. Etter DNAse (Sigma-Aldrich)-behandling ble cDNA generert ved å bruke M-MLV (Thermo-Fisher Scientific, North Ryde, Australia) enzymstandard operasjonsprosedyrer ved bruk av en T100TM termisk syklus (BioRad Laboratories, Gladesville, Australia). Ved å bruke SYBR-basert metodikk ble qPCR utført ved bruk av CFX384 TouchTM (BioRad Laboratories) i henhold til standard driftsprosedyrer. Hvert primersett ble gradienttestet for å bestemme den optimale temperaturen for amplifikasjon (tilleggstabell 2). Sykluskvantifisering ble tolket ved å bruke en regresjon for hvert mål, genuttrykk ble normalisert i forhold til hypoxantin-guanin-fosforibosyltransferase (Hprt). Smeltekurver ble vurdert for tegn på primerdimerisering og ikke-spesifikk amplifikasjon. På hver plate ble det brukt minst én negativ kontroll og ingen malkontroll for hvert mål for å sikre at forurensning ikke var tilstede i hver masterblanding eller ddH2O som ble brukt.

RT2 Profiler Array

RT² ProfifilerTM PCR Array Mouse Extracellular Matrix & Adhesion Molecules (Qiagen) ble utført i henhold til produsentens instruksjoner, og data ble lastet opp og deretter analysert av nettverktøyet, tilgjengelig fra https://dataanalysis. qiagen.com/pcr/arrayanalysis.php. Denne matrisen tillater profilering av 84 gener i maksimalt 4 prøver, derfor ble like mengder cDNA for hvert replikat i en gruppe samlet fra WT-mus på dag 1, 3 eller 7 etter IRI, og sham-poolet fra hvert replikat fra hver av disse tidspunktene. For hvert mål ble foldendringen etter IRI sammenlignet med falsk uttrykk.

Statistisk analyse

Alle data ble analysert med Graphpad Prism-programvare v8.02 ved bruk av ikke-parametriske uparrede t-tester (Mann-Whitney U-test). P < 0.05="" ble="" satt="" som="" terskelen="" for="" å="" bestemme="" statistisk="" signifikante="" forskjeller.="" ∗p="">< 0,05,="" ns="" ikke="" signifikant.="" alle="" data="" er="" uttrykt="" som="" gjennomsnitt="" ±="" sem.="" i="" hver="" analyse="" var="" det="" n="4–8" replikater="" per="" gruppe,="" og="" resultatene="" var="" representative="" for="" minst="" to="" eksperimenter.="" prøvestørrelsen="" for="" hvert="" eksperiment="" er="" beskrevet="" i="" den="" tilsvarende="">

RESULTATER

Renale ILC2-er uttrykker konstitutivt IL-5 og er lokalisert til nyrevaskulaturen under homeostatiske forhold

En detaljert analyse av renal ILC2-fenotype og lokalisering under homeostatiske forhold ble utført. Det var signifikant flere ILC2-er (CD45 pluss Lineage IL- 7R pluss CD90.2 pluss ST2 pluss FSClowSSClow enkeltceller), i nyrene sammenlignet med lungen når representert som en prosentandel av totalt CD45 pluss enkeltceller (Figur 1A; Supplerende figurer 1A, B). t-SNE-analyse av nyre- og lunge-ILC2-er viste unik klynging, selv om disse klyngene ikke var helt forskjellige fra hverandre (figur 1B). Imidlertid hadde nyre-ILC2-er markant lavere ekspresjon av CD25, konsistent uttrykk av ICOS og KLRG1, men høyere ekspresjon av IL-5 sammenlignet med lunge-ILC2-er (figur 1C). Nyre-ILC2-er hadde et høyere konstitutivt uttrykk for IL-5 enn IL-13 (figur 1D; tilleggsfigurer 1C, D). ILC2-er ble bestemt til å være den viktigste IL-5-produserende celletypen i nyren, med et ubetydelig bidrag fra T-hjelpertype-2 (TH2)-celler (figur 1E, tilleggsfigurer 1E, F). Derfor ble IL-5 brukt som en surrogatmarkør for å identifisere plasseringen av ILC2-er i musenyren, slik det er beskrevet for flere perifere organer (29–31). Dette ble oppnådd ved å bruke mus som uttrykker en IL-5-koblet Cre-rekombinase krysset til en Rosa-tomat-avstamningssporer (30, 31). IL-5 plussceller (hovedsakelig ILC2s) ble funnet gjennom helenyremen var først og fremst lokalisert til hovedvaskulaturen, som visualisert med alfa-glattmuskelaktin (-SMA) positiv farging (figur 2A; tilleggsfigurer 2A, B), i samsvar med vår nylige rapport (29). ILC2s ble funnet å være assosiert med både interlobulære og bueformede nyrekar i cortex og medullære regioner, som vist av lymfatisk endotelial hyaluronanreseptor-1 (LYVE1) uttrykk (figur 2B). Ytterligere avbildning viste at svært få av CD3 pluss-cellene (hovedsakelig TH2-celler) bidro til det endogene IL-5 pluss-signalet (figur 2C). ILC2s ble identifisert i adventitia av fartøyet ved bruk av pseudofargede overflaterekonstruksjoner av arteriell -SMA.

Reduksjon, mangel eller uttømming av ILC2s endrer ikke alvorlighetsgraden av eksperimentell nyreiskemi-reperfusjonsskade hos mus

Given ILC2s were present in the kidney and localized to the renal vasculature, the impact of ILC2 reduction, deficiency, or depletion on the severity of experimental renal IRI was assessed. This was achieved by using ILC2-reduced (Roraflfl/+Il7rcre/+)-deficient (Roraflfl/flfl Il7rcre/+), and -depleted (DTx-treated Icosdtr/+Cd4cre/+) mice compared to WT and vehicle (saline-treated Icosdtr/+Cd4cre/+) controls. These mice have been previously described as appropriate tools for assessing ILC2 function in vivo in other organs such as the lung (27, 32). Here we show that these tools are also appropriate for assessing ILC2 function in the kidney. Indeed, kidney ILC2s were significantly lower in the ILC2-reduced, -defificient, and -depleted groups compared to WT or saline-treated controls (Figure 3A). Time-course analysis of IRI in wild-type mice identified day 7 as the most appropriate time point for the assessment of injury severity due to the presence of histopathological features of acute tubular necrosis, collagen deposition and increased mRNA expression of extracellular matrix, injury-associated, and inflflammatory factors (Supplementary Figures 3, 4). At day 7, 25/84 extracellular matrix factors were increased >2- ganger sammenlignet med falske kontroller, mens 1/84 og 6/84 ble økt på henholdsvis dag 1 og 3 (tilleggsfigur 4A). IRI induserte akutt tubulær nekrose preget av utvidede tubuli og gipsdannelse, sammenlignet med falske kontroller (figur 3B, tilleggsfigurer 3A, 4B). Dette ble kvantifisert som en tubulær skadescore og alvorlighetsgraden av skaden var lik i alle genotyper (figur 3C). IRI induserte også kollagenavsetning, preget av metylblått innhold mellom tubuli i medulla og cortex, sammenlignet med falske kontroller (Figur 3D; Supplerende Figur 3B). Kollagenavsetning var upåvirket av fraværet av ILC2s. IRI økte også mRNA-ekspresjonen av skadeassosierte faktorer, kjemokiner og pro-inflammatoriske cytokiner (figur 3E–J, tilleggsfigurer 4C–K). Nøytrofil gelatinase-assosiert lipokalin, (Lcn2; NGAL), en biomarkør for nyreskade (33, 34), ble økt av IRI og upåvirket av ILC2-reduksjon, -mangel eller -deplesjon (Figur 3E). CXC-motiv kjemokinligand 1 (Cxcl1) og Cxcl2 ble også betydelig økt av IRI i alle genotyper (figur 3F, G). Tilsvarende ble den pro-inflammatoriske cytokintumornekrosefaktoren (Tnf) økt av IRI, sammenlignet med falske kontroller (figur 3H). I samsvar med synlig kollagenavsetning ble mRNA-ekspresjon av de ekstracellulære matriksfaktorene kollagen type I alfa 1-kjede (Col1a1) og fibronektin 1 (Fn1) økt av IRI i alle genotyper (figur 3I, J).

DISKUSJON

ILC2-er er kritiske regulatorer av vevshomeostase, men deres rolle i nyrene gjenstår å bli fullstendig belyst. Mens ILC2-er kan induseres til å spre seg og beskytte mot de skadelige konsekvensene av eksperimentell nyreskade, er det ennå ikke kjent hva som skjer i fravær av disse cellene. Vi undersøkte først om ILC2-tall, som andel av CD45 pluss hematopoietiske celler, er forskjellige i lunge og nyre. ILC2s sto for en større andel av CD45 pluss-celler i nyrene enn i lungen. t-SNE-analyse grupperte ILC2-er fra begge steder forskjellig, men klyngene var ikke helt forskjellige mellom disse vevene. Det var forskjeller i deres celleoverflateantigen og type 2-cytokinekspresjon, med nyre-ILC2-er som uttrykker større mengder IL-5. Faktisk uttrykte nyre-ILC2-er konstitutivt høye nivåer av IL-5 under homeostatiske forhold. ILC2-er var også hovedkilden til IL-5 i nyrene, med ubetydelig bidrag fra TH2-celler. Derfor ble IL-5 brukt som en surrogatmarkør for å bestemme plasseringen av disse cellene i nyrene. ILC2-er ble identifisert i nyrene og ble lokalisert nesten utelukkende langs nyrevaskulaturen. I disse studiene ble en IL-5-koblet Cre-recombinase brukt i forbindelse med en flox-stop-flox-sekvens oppstrøms for en CAG-RFP-WPRE-kassett i det konstitutivt uttrykte ROSA26-lokuset for å lokalisere ILC2-ene. LYVE1, som uttrykkes av renale lymfatiske endotelceller, ble brukt til å definere plasseringen av disse cellene ytterligere i musenyren (35). Som forventet ble LYVE1-farging innebygd i bindevevet til nyrearteriene i cortex, men ikke i medulla siden det ikke eksisterer noe merkbart lymfatisk nettverk i denne regionen av nyren (35–37). Antagelig er ILC2-er lokalisert nær det vaskulære, da nyre-endotelceller er en hovedkilde til IL-33 i nyrene (38, 39). For å bekrefte vår observasjon fra FACS av enkeltcellede nyresuspensjoner, ble ILC2s igjen funnet å være de viktigste produsentene av IL-5 i nyrevevsseksjoner, med minimalt bidrag fra CD3 pluss T-celler. Selv om disse studiene viser plasseringen av ILC2-er i nyrene ved bruk av reportermus, gjenstår det å fastslå om ILC2-er også er lokalisert ved siden av vaskulaturen i den menneskelige nyren, og om plasseringen av ILC2-er endres som svar på nyreskade. Selv om flere rapporter har funnet at ILC2-tall er uendret av nyreskade, krever deres fenotype og aktiveringstilstand etter skade ytterligere belysning (12–16). Deretter karakteriserte vi den funksjonelle rollen til ILC2s i nyrene ved å bruke en tap-av-funksjon tilnærming. For å oppnå dette, tok vi fordel av ILC2-reduserte og -mangelfulle mus, og mus som kan bli betinget utarmet for ILC2s etter administrering av DTx (27). Vi validerte bruken av disse verktøyene for knockdown eller ablasjon av ILC2s i nyrene. En eksperimentell modell av IRI ble valgt, gitt ILC2s nærhet til nyrevaskulaturen. Selv om trekk ved skade var synlig etter IRI, endret ikke en reduksjon, mangel eller uttømming i ILC2s grov histopatologi i nyrene, og forårsaket heller ikke dødelighet. Faktisk skjedde IRI-indusert ombygging og kollagenavsetning uavhengig av ILC2-er. Selv om det er mulig at et tidligere tidspunkt etter skade kan ha identifisert forskjeller i histopatologi og genuttrykk, tillot tidspunktet i vår studie også vurdering av kollagenavsetning, et viktig trekk ved remodellering som er regulert av ILC2s (16, 32, 40) –44). Det er også sannsynlig at en reduksjon i ILC2s under

AKI kan være skadelig for nyrestruktur og funksjon ved vurdering på senere tidspunkt på grunn av potensielle maladaptive reparasjonsresponser i fravær av ILC2s. For å adressere dette, vil fremtidige studier måtte undersøke rollen til ILC2 i utviklingen av AKI til kronisk nyresykdom (45, 46).

Samlet viser denne studien at en reduksjon, mangel eller uttømming i ILC2s ikke endrer alvorlighetsgraden av eksperimentell AKI hos mus. Mens aktivering av ILC2-er og tilhørende amplifisering av lokal type 2-immunitet tidligere har vist seg å redusere de skadelige konsekvensene av AKI, oppstår sammenlignbare skader når ILC2-er er redusert, fraværende eller utarmet, noe som tyder på mulig redundans og kompensasjon av andre immunceller, slik som Treg , AAM og TH2-celler. Dette konseptet støttes av studier som bruker Rag1 / eller Rag2 / mus som mangler modne T- og B-celler, i modeller avnyreskade(13, 15, 47, 48). I en studie ble anti-CD90.2 administrering brukt for å tømme ILC2s, men disse dyrene hadde også mangel på Treg- og TH2-celler (15). I dette modellsystemet, til tross for uttømming av ILC2-er med anti-CD90.2, er kompensasjon fra T-cellerommet ikke mulig. Våre data viser at et tap av ILC2s, når T-cellerommet forblir intakt, har minimale effekter på alvorlighetsgraden av IRI. Dataene våre støtter konseptet om at ILC2-ene i tillegg til andre immunceller, som Treg og AAM, bidrar til AKI. Treg-deplesjon forverret faktisk histopatologi etter IRI (15). På samme måte fremmer makrofagpolarisering mot AAM oppløsningen av skade (5, 12, 46, 49, 50). Ytterligere studier er nødvendig for å klargjøre årsaken til tilstedeværelsen av ILC2-er i nyrene, inkludert stigende urinveisinfeksjoner og andre nyrefornærmelser, samt progresjon tilkronisk sykdom.

ETISK ERKLÆRING

Alle kirurgiske prosedyrer ble godkjent av University of Newcastles Animal Care and Ethics Committee i samsvar med Australian Code for stell og bruk av dyr til vitenskapelige formål. Prosedyrer for immunfluorescerende avbildning ble godkjent og utført i samsvar med retningslinjer etablert av UCSF Animal Care and Use Committee og Laboratory Animal Resource Center.

FORFATTERBIDRAG

Arbeidet som ble presentert ble utført i samarbeid med alle forfatterne. GC utførte den kirurgiske modellen, flowcytometri, histologisk vurdering, genekspresjonsanalyse og analyserte dataene. KC og ABM utførte immunfluorescenseksperimentene. SL hjalp til med dyreovervåking og flowcytometri. SJ og AD ga klinisk innsikt for studiedesign og operasjonsteknikk. ANM opprettet, leverte og ga råd om bruk av ILC2-deficient & -depleted og Il13td tomatmus. PF leverte og ga råd om bruk av Il5venus reporterlinje. PF og PH ga råd om eksperimentell design. MS designet, veiledet og tilrettelagt alle aspekter av studiene. Alle forfattere deltok i tolkningen av data, utarbeidelse og redigering av manuskripter for intellektuelt innhold.

FINANSIERING

MS støttes av et Australian Research Council (ARC) Discovery Early Career Researcher Award (DECRA) stipend og tilskudd fra National Health and Medical Research Council (NHMRC), Hunter Medical Research Institute og Hunter Children's Research Foundation.

REFERANSER

1. Susantitaphong P, Cruz DN, Cerda J, Abulfaraj M, Alqahtani F, Koulouridis I, et al. Verdensforekomst av AKI: en metaanalyse.Clin J Er Soc Nephrol. (2013) 8:1482–93.

2. Hall AM, Unwin RJ, Parker N, Duchen MR. Multifotonavbildning avslører forskjeller i mitokondriell funksjon mellom nefronsegmenter.J Am Soc Nephrol. (2009) 20:1293–302.

3. Devarajan P. Oppdatering om mekanismer for iskemisk akutt nyreskade.J Am Soc Nephrol. (2006) 17:1503–20. 

4. Bonventre JV, Yang L. Cellulær patofysiologi av iskemisk akutt nyreskade.J Clin Invest.(2011) 121:4210–21. DOI: 10.1172/JCI 45161

5. Lee S, Huen S, Nishio H, Nishio S, Lee HK, Choi BS, et al. Distinkte makrofagfenotyper bidrar til nyreskade og reparasjon.J Am Soc Nephrol. (2011) 22:317–26. 

6. Friedewald JJ, Rabb H. Inflammatoriske celler ved iskemisk akutt nyresvikt.Nyre Int.(2004) 66:486–91. 

7. Spits H, Artis D, Colonna M, Diefenbach A, Di Santo JP, Eberl G, et al. Medfødte lymfoide celler - et forslag til enhetlig nomenklatur.NatRev Immunol.(2013) 13:145–9. 

8. Moro K, Yamada T, Tanabe M, Takeuchi T, Ikawa T, Kawamoto H, et al. Medfødt produksjon av T(H)2-cytokiner av fettvevsassosierte c- Kit( plus )Sca-1( pluss ) lymfoide celler.Natur. (2010) 463:540–4. 

9. Neill DR, Wong SH, Bellosi A, Flynn RJ, Daly M, Langford TKA, et al. Nuocytter representerer en ny medfødt effektorleukocytt som medierer type-2 immunitet.Natur. (2010) 464:1367–70. 

10. Loering S, Cameron GJM, Starkey MR, Hansbro PM. Lungeutvikling og nye roller for type 2-immunitet.J Pathol.(2018) 247:686–96. 

11. Monticelli LA, Sonnenberg GF, Abt MC, Alenghat T, Ziegler CG, Doering TA, et al. Medfødte lymfoide celler fremmer lungevevshomeostase etter infeksjon med influensavirus.Nat Immunol. (2011) 12:1045–54. 

12. Huang Q, Niu Z, Tan J, Yang J, Liu Y, Ma H, et al. IL-25 fremkaller medfødte lymfoide celler og multipotente progenitor type 2-celler som reduserer iskemisk/reperfusjonsskade i nyrene.J Am Soc Nephrol.(2015) 26:2199–211. 

13. Riedel JH, Becker M, Kopp K, Duster M, Brix SR, Meyer-Schwesinger C, et al. IL-33-mediert utvidelse av type 2 medfødte lymfoide celler beskytter mot progressiv glomerulosklerose.J Am Soc Nephrol.(2017) 28:2068–80. 

14. Stremska ME, Jose S, Sabapathy V, Huang L, Bajwa A, Kinsey GR, et al. IL233, et nytt IL-2- og IL-33-hybridcytokin, forbedrer nyreskade.J Am Soc Nephrol. (2017) 28:2681–93. 

15. Cao Q, Wang Y, Niu Z, Wang C, Wang R, Zhang Z, et al. Potensiere vevsresidente type 2 medfødte lymfoide celler ved IL-33 for å forhindre nyreiskemi-reperfusjonsskade.J Am Soc Nephrol.(2018) 29:961–76. 

16. Sabapathy V, Cheru NT, Corey R, Mohammad S, Sharma R. Et nytt hybrid cytokin IL233 medierer regenerering etter doksorubicin-indusert nefrotoksisk skade.Sci Rep. (2019) 9:3215. 

17. Cameron GJM, Jiang SH, Loering S, Deshpande AV, Hansbro PM, Starkey MR. Fremvoksende terapeutisk potensial for gruppe 2 medfødte lymfoide celler ved akutt nyreskade.J Pathol. (2019) 2019:5242. 

18. Singh AP, Junemann A, Muthuraman A, Jaggi AS, Singh N, Grover K, et al. Dyremodeller for akutt nyresvikt.Pharmacol Rep. (2012) 64:31–44. 

19. Ramesh G, Ranganathan P. Musemodeller og metoder for å studere menneskelig sykdom, akutt nyreskade (AKI).Metoder Mol Biol.(2014) 1194:421–36. 

20. Skrypnyk NI, Harris RC, de Caestecker MP. Iskemi-reperfusjonsmodell av akutt nyreskade og post-skade fibrose hos mus.J VisExp.(2013) 9:78. 

21. Wei Q, Dong Z. Musemodell av iskemisk akutt nyreskade: tekniske notater og triks.Am J Physiol Renal Physiol.(2012) 303:F1487–94? 

22. Starkey MR, McKenzie ANJ, Belz GT, Hansbro PM. Lungegruppe 2 medfødte lymfoide celler: overraskelser og utfordringer.Mucosal Immunol.(2019) 12:299–311. 

23. Jang HR, Rabb H. Immunceller ved eksperimentell akutt nyreskade.Nat Rev Nephrol.(2015) 11:88–101. DOI: 10.1038/nrneph.2014.180

24. Turner JE, Becker M, Mittrucker HW, Panzer U. Vevsresidente lymfocytter i nyren.J Am Soc Nephrol.(2018) 29:389–99. 

25. Jang HR, Rabb H. Den medfødte immunresponsen ved iskemisk akutt nyreskade.Clin Immunol. (2009) 130:41–50. 

26. Langford DJ, Bailey AL, Chanda ML, Clarke SE, Drummond TE, Echols S, et al. Koding av ansiktsuttrykk av smerte i laboratoriemus.NatMetoder.(2010) 7:447–9.

27. Oliphant CJ, Hwang YY, Walker JA, Salimi M, Wong SH, Brewer JM, et al. MHCII-mediert dialog mellom gruppe 2 medfødte lymfoide celler og CD4 pluss T-celler potenserer type 2-immunitet og fremmer utstøting av parasittisk helminth.Immunitet. (2014) 41:283–95. 

28. Shih W, Hines WH, Neilson EG. Effekter av ciklosporin A på utviklingen av immun-mediert interstitiell nefritt.Nyre Int. (1988) 33:1113–8.

29. Dahlgren MW, Jones SW, Cautivo KM, Dubinin A, Ortiz-Carpena JF, Farhat S, et al. Adventitielle stromaceller definerer gruppe 2 medfødte lymfoide cellevevsnisjer.Immunitet. (2019) 50:707–22. 

30. Molofsky AB, Nussbaum JC, Liang HE, Van Dyken SJ, Cheng LE, Mohapatra A, et al. Medfødte lymfoide type 2-celler opprettholder viscerale fettvevseosinofiler og alternativt aktiverte makrofager.J Exp Med.(2013) 210:535–49. 

31. Nussbaum JC, Van Dyken SJ, von Moltke J, Cheng LE, Mohapatra A, Molofsky AB, et al. Type 2 medfødte lymfoide celler kontrollerer eosinofil homeostase.Natur.(2013) 502:245–8. 

32. Donovan C, Starkey MR, Kim RY, Rana BMJ, Barlow JL, Jones B, et al. Roller for T/B-lymfocytter og ILC2-er i eksperimentell kronisk obstruktiv lungesykdom.J Leukoc Biol.(2019) 105:143–50. 

33. Mishra J, Ma Q, Prada A, Mitsnefes M, Zahedi K, Yang J, et al. Identifikasjon av nøytrofil gelatinase-assosiert lipocalin som en ny tidlig urin biomarkør for iskemisk nyreskade.J Am Soc Nephrol.(2003) 14:2534–43. 

34. Supavekin S, Zhang W, Kucherlapati R, Kaskel FJ, Moore LC, Devarajan P. Differensiell genuttrykk etter tidlig nyreiskemi/reperfusjon.Nyre Int.(2003) 63:1714–24. 

35. Skorecki K, Chertow GM, Marsden PA, Taal MW, Alan SL, Luyckx V. Anatomy of the kidney: Lymphatics. I:Brenner ogRektorsNyre-e-boken. 10. utg. Amsterdam: Elsevier (2015). s. 80–1.

36. Banerji S, Ni J, Wang SX, Clasper S, Su J, Tammi R, et al. LYVE-1, en ny homolog av CD44-glykoproteinet, er en lymfespesifikk reseptor for hyaluronan.J Celle Biol. (1999) 144:789–801. 

37. Lee HW, Qin YX, Kim YM, Park EY, Hwang JS, Huo GH, et al. Ekspresjon av lymfatisk endotelspesifikk hyaluronanreseptor LYVE-1 i den utviklende musenyren.CelleVevRes.(2011) 343:429–44.

38. Shelite TR, Liang Y, Wang H, Mendell NL, Trent BJ, Sun J, et al. IL- 33-avhengig endotelaktivering bidrar til apoptose og nyreskade hos orienterte tsutsugamushi-infiserte mus.PLoS Negl Trop Dis.(2016) 10:e0004467.

39. Ferhat M, Robin A, Giraud S, Sena S, Goujon JM, Touchard G, et al. Endogen IL-33 bidrar til nyreiskemi-reperfusjonsskade som et alarmin.J Er Soc Nephrol. (2018) 29:1272–88. 

40. Mchedlidze T, Waldner M, Zopf S, Walker J, Rankin A, Schuchmann M, et al. Interleukin-33-avhengige medfødte lymfoide celler medierer hepatisk fibrose.Immunitet. (2013) 39:357–71. 

41. Moretti S, Renga G, Oikonomou V, Galois C, Pariano M, Iannitti RG, et al. En mastcelle-ILC2-Th9-bane fremmer lungebetennelse ved cystisk fibrose.Nat Commun. (2017) 8:14017. 

42. Hams E, Armstrong ME, Barlow JL, Saunders SP, Schwartz C, Cooke G, et al. IL-25 og type 2 medfødte lymfoide celler induserer lungefibrose.ProcNatlAcad Sci USA. (2014) 111:367–72.

43. Wohlfahrt T, Usherenko S, Englbrecht M, Dees C, Weber S, Beyer C, et al. Type 2 medfødte lymfoide celletall øker hos pasienter med systemisk sklerose og korrelerer med omfanget av fibrose.Ann Rheum Dis.(2016) 75:623–6. 

44. Li D, Guabiraba R, Besnard AG, Komai-Koma M, Jabir MS, Zhang L, et al. IL-33 fremmer ST2-avhengig lungefibrose ved induksjon av alternativt aktiverte makrofager og medfødte lymfoide celler i mus.J Allergy Clin Immunol. (2014) 134:1422–32. 

45. Sharp CN, Doll MA, Megyesi J, Oropilla GB, Beverly LJ, Siskind LJ. Subklinisk nyreskade indusert av gjentatt cisplatinadministrasjon resulterer i progressiv kronisk nyresykdom.Am J Physiol Renal Physiol.(2018) 315:F161–72? 

46. ​​Liu J, Kumar S, Dolzhenko E, Alvarado GF, Guo J, Lu C, et al. Molekylær karakterisering av overgangen fra akutt til kronisk nyreskade etter iskemi/reperfusjon.JCI Insight.(2017) 2:94716. 

47. Li L, Huang L, Sung SJ, Lobo PI, Brown MG, Gregg RK, et al. NKT-celleaktivering medierer produksjon av nøytrofil IFN-gamma og nyreiskemi-reperfusjonsskade.J Immunol.(2007) 178:5899–911.

48. Chan AJ, Alikhan MA, Odobasic D, Gan PY, Khouri MB, Steinmetz OM, et al. Medfødt IL-17A-produserende leukocytter fremmer akutt nyreskade via inflammasom- og Toll-lignende reseptoraktivering.Am J Pathol.(2014) 184:1411–8? 

49. Cao Q, Wang C, Zheng D, Wang Y, Lee VWS, Wang YM, et al. IL-25 induserer M2-makrofager og reduserer nyreskade ved proteinurisk nyresykdom.J Am Soc Nephrol. (2011) 22:1229–39.

50. Chung S, Overstreet JM, Li Y, Wang Y, Niu A, Wang S, et al. TGF-beta fremmer fibrose etter alvorlig akutt nyreskade ved å øke nyremakrofaginfiltrasjonen.JCI Insight.(2018) 3:123563.