Helsemessige fordelaktige egenskaper av druefrøekstrakt og dens innflytelse på utvalgte biokjemiske markører i blod, lever og nyrer av Rattus Norvegicus

edmund.chen@wecistanche.com

Abstrakt:Kadmium (Cd) er et tungmetall som forekommer i alle områder av miljøet, inkludert næringskjeden. I kroppen forårsaker det oksidativt stress ved å produsere frie radikaler som er skadelige for cellene. Druefrøekstrakt (GSE) inneholder et bredt spekter av biologisk aktive komponenter som bidrar til å nøytralisere de negative effektene av frie radikaler. I denne studien ble effektene av GSE tilberedt fra semi-resistente vinranker Season, som er rik på fenoler, overvåket på biokjemiske markører av brune rotter utsatt for effekten av kadmium. GSE økte plasmaantioksidantaktiviteten og inyrerog leveren, ble Cd-innholdet betydelig redusert ved samtidig administrering av GSE. Følgelig ble økningen i kreatinininnhold og alaninaminotransferaseaktivitet og reduksjonen av katalase- og superoksiddismutaseaktiviteter forårsaket av kadmium bremset av GSE samtidig administrering. Resultatene av dette arbeidet viser at druefrøekstrakt gir en beskyttende effekt mot inntak av tungmetaller i organismen.

1. Introduksjon

Kadmium (Cd) er et tungmetall som forekommer i alle områder av miljøet; den er en del av jordskorpen, er inneholdt i vann, akkumuleres i planter og finnes i organismer. I tillegg til næringskjeden (når det gjelder planter, er de fleste korn, rotvekster og grønnsaker kilder, mens blant dyreorganer, først og fremst lever ognyrerer en kilde), en viktig kilde til kadmium for mennesker er sigarettrøyk, utåndinger fra ulike typer forbrenning, metallurgisk industri og enkelte elektriske installasjoner [1,2]. I kroppen binder kadmium seg hovedsakelig til metallothionein, albumin og andre plasmaproteiner i blodet. Kadmium er et farlig giftig metall som forårsaker oksidativt stress ved å produsere frie radikaler som er skadelige for cellene. Frie radikaler kan skade proteiner, lipider, enzymer og DNA, og må derfor nøytraliseres av antioksidanter før de kommer inn i cellene [3].

Hvis ikke nøytralisert, forårsaker Cd desintegrering av røde blodlegemer [4], akkumuleres i organismen—, spesielt i leveren ognyrer– og på grunn av sin likhet med sink, som er et essensielt element, går det lett inn i enzymatiske reaksjoner og deltar i biokjemiske prosesser [5]. Det skilles ut kun svært sakte og vanskelig fra organismen [6]. Det er velkjent at antioksidanter kan ha en beskyttende effekt mot oksidativt stress og tungmetallskader, og dette eksperimentelle arbeidet var basert på dette faktum. Druefrøekstrakt (GSE) inneholder et bredt spekter av biologisk aktive komponenter i matrisen [7] som hjelper til med å nøytralisere de negative effektene av frie radikaler. GSE beskytter cellene mot skade ved å regulere cellulær oksidativ skade, redusere organskader, forbedre balansen mellom oksidanter og antioksidanter, og redusere frigjøring av inflammatoriske mediatorer. Det har også anti-inflammatoriske, antiapoptotisk og pro-proliferative effekter [8]. Det høye innholdet av kondensert flavan-3-ol eller procyanidiner, som er under utredning som en alternativ behandlingsmetode for alvorlige sykdommer, er spesielt signifikant [9,10]. Imidlertid kan innholdet og sammensetningen av druefrøfenoler, så vel som antioksidantaktiviteten til frøekstraktet, påvirkes av vinkultivar, grunnstamme, klimatiske forhold eller dyrkingsteknikker [11–13] og derfor antioksidantegenskaper, som samt beskyttende effekter av et betongekstrakt, kan ikke lett forutsies. Målet med dette arbeidet var å studere den beskyttende effekten av GSE tilberedt fra semi-resistente vinranker Cerason på biokjemiske markører i blod, plasma, lever ognyrerav brune rotter som var blitt utsatt for effekten av kadmium.

Nøkkelord:druefrøekstrakt; antioksidanter; kadmium; rattus norvegicus; biokjemiske markører; beskyttende effekt; nyre, nyre

CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYREFUNKSJONEN

2. Resultater og diskusjon

2.1. Antioksidantaktivitet og fytokjemisk sammensetning av druefrøekstrakt

Druefrøekstraktet fremstilt fra den semi-resistente varianten Cerason ble testet for antioksidantaktivitet, totalt polyfenolinnhold og utvalgte individuelle antioksidanter. Antioksidantaktivitet ble bestemt spektrofotometrisk ved bruk av fire metoder basert på forskjellige prinsipper (DPPH• , ABTS• plus , FRAP, FR) og de totale polyfenoliske forbindelsene ble bestemt med Folin-Ciocalteu-metoden. Avhengig av metoden som ble brukt, varierte antioksidantaktiviteten fra 7 til 31 mg/g gallussyreekvivalent (GAE) og det totale polyfenolinnholdet var 9,3 mg/g GAE (tabell 1). Resultatene fra denne delen av eksperimentet pekte på det høye antioksidantpotensialet i druefrø.

2.2. In vivo-bestemmelse av druefrøekstrakteffekten hos rottene

2.2.1. Bestemmelse av kadmiuminnhold i blod, lever og nyrerKadmium er det mest utbredte giftige metallet i fôr. Etter oral administrering blir det absorbert fra tarmen, transportert til leveren og konjugert til tiolgrupper av metallothionein (MT). Utenom dette kan Cd også være bundet til albumin, eller andre proteiner i blodet [14]. Deretter akkumuleres Cd i kroppen, skilles ut kun sakte fra kroppen via urin og avføring og har en biologisk halveringstid på ca. 20 år. Den største mengden (omtrent en tredjedel) kadmium finnes inyrecortex. I blodet er mest kadmium (omtrent 90 prosent) tilstede i de røde blodcellene. Det er giftig for et bredt spekter av organer, og hovedmålene ernyrer, bein og lunger [15–17]. GSE har blitt rapportert å senke kadmiumkonsentrasjoner i de røde blodcellene og inyrer,mens innholdet i leveren har blitt rapportert å øke [14]. Resultatene for kadmiuminnholdet i blodet i denne studien er vist i figur 1A. Ved begynnelsen av forsøket ble det funnet 3,2 µg/kg kadmium i blodet til dyrene. Under forsøket, etter 14 dager, var gjennomsnittlig kadmiumverdi i gruppen med tillegg av GSE og kadmium signifikant høyere enn i andre grupper (10,8 µg/kg, p=0.023). Etter 28 dager var variabiliteten av dataene for høy til å observere en statistisk signifikans.

Ved begynnelsen av forsøket ble det ikke påvist kadmium i leverene (Figur 1B) til forsøksdyrene. Følgelig ble det ikke påvist kadmium i leveren til dyrene fra kontroll- og GSE-gruppene under forsøket. På den annen side, etter 14 dager av forsøket, var gjennomsnittlig kadmiumverdi i gruppen med tilsetning av kadmium 5,8 mg/kg og i gruppen med tilsetning av kadmium og GSE var gjennomsnittsverdien 5,2 mg/kg. Begge disse verdiene var signifikant forskjellige fra kontrollgruppen (p=0.002 og p=0.018 for henholdsvis gruppen med kun kadmium og gruppen med kadmium og GSE). Etter 28 dager var gjennomsnittsverdien i gruppen med tilsetning av kadmium økt til 6,7 mg/kg, noe som skilte seg betydelig fra kadmiumnivået i gruppen med tilsetning av kadmium og GSE, som hadde gått litt ned til 4,8 mg/kg. (s=0.008).

Ved begynnelsen av forsøket ble det ikke påvist kadmium inyrer(Figur 1C) av forsøksdyrene. Følgelig ble det ikke påvist kadmium inyrerav dyrene fra kontroll- og GSE-gruppene under forsøket. På den annen side, etter 14 dager, var gjennomsnittlig kadmiumverdi i gruppen med tilsetning av kadmium 9,5 mg/kg og i gruppen med tilsetning av kadmium og GSE var gjennomsnittsverdien 6,5 mg/kg. Begge disse verdiene var signifikant forskjellige fra kontrollgruppen (p < 0.001="" for="" begge="" gruppene).="" etter="" 28="" dager="" var="" middelverdien="" i="" gruppen="" med="" tilsetning="" av="" kadmium="" økt="" til="" 16,6="" mg/kg,="" noe="" som="" skilte="" seg="" betydelig="" fra="" kadmiumnivået="" i="" gruppen="" med="" tilsetning="" av="" kadmium="" og="" gse,="" som="" hadde="" økt="" bare="" litt="" til="" 10,4="" mg/="" kg="" (p="0.009)." således,="">nyrerog i leveren ble Cd-innholdet betydelig redusert ved GSE-administrasjon. GSE inneholder fenoliske forbindelser som kan chelatere Cd, og dermed redusere akkumuleringen av Cd. Dannelsen av disse chelatene resulterte sannsynligvis i en redusert evne til proteinene til å binde Cd, som dermed kunne elimineres mer effektivt fra kroppen [18].

2.2.2. Bestemmelse av kreatinin- og ureainnhold

Med hensyn til kadmiumakkumuleringen inyrer, dennyreer et av de viktigste målorganene for Cd-indusert toksisitet. derfornyremarkører kreatinin og urea ble bestemt i plasma. Bestemmelsen av kreatinin er en god indikator på glomerulær filtrasjon og brukes hovedsakelig til å overvåke forløpet avnyresykdom. Forholdet mellom kreatininkonsentrasjon og glomerulær filtrasjon er hyperbolsk; ettersom glomerulær filtrasjon avtar, reduseres også kreatininsekresjonen [19]. Økt inntak av tungmetallet kadmium fører tilnyreskade, og derfor redusert kreatininsekresjonseffektivitet. Som et resultat indikerer et forhøyet kreatininnivå i blodet ennyrelidelse [20].

I vår studie ble nivåene av kreatinin økt med Cd, i samsvar med tidligere publiserte resultater [21]. Gjennomsnittlig kreatinininnholdsverdi (figur 2A) i forsøksdyrene ved begynnelsen av forsøket var 3,0 mg/L. I gruppen som fikk kadmium var det en signifikant økning i de overvåkede verdiene til 5,1 mg/L (etter 14 dager, p=0.015) og til 6,2 mg/L (etter 28 dager, p < 0.001).="" i="" gruppen="" der="" gse="" ble="" administrert="" samtidig="" med="" kadmium,="" var="" økningen="" i="" denne="" markøren="" lavere="" (4,2="" mg/l="" etter="" 14="" dager="" og="" 5,5="" mg/l="" etter="" 28="" dager)="" og="" statistisk="" signifikant="" først="" etter="" 28="" dager,="" sammenlignet="" med="" kontroll="" (="" p="">< 0,001).="" dermed="" ble="" økningen="" i="" kreatininkonsentrasjon="" bremset="" av="" gse="" samtidig="" administrering,="" noe="" som="" tyder="" på="" en="" reduksjon="" av="" den="" toksiske="" effekten="" forårsaket="" av="" kadmium.="" i="" gruppen="" som="" bare="" fikk="" gse,="" var="" det="" normale="">

Urea er kvantitativt det viktigste nedbrytende produktet av aminosyrer og proteiner. Det dannes i leveren fra ammoniakk frigjort ved deamineringsreaksjoner under aminosyremetabolisme. Det skilles ut fra organismen hovedsakelig avnyrerved glomerulær filtrasjon og tubulær resorpsjon [22]. I tilfelle avnyresykdommer, overskrider ureaproduksjonshastigheten klaringshastigheten, noe som resulterer i en økning i ureanivået i blodet. Dessuten hemmer kadmium inkorporeringen av aminosyrer i proteiner, og forårsaker uremi [21]. På den annen side, når leverfunksjonen svikter, reduseres ureasyntesen og dermed også konsentrasjonen i plasma [20]. Dermed avhenger ureakonsentrasjonen i blodet av proteininnholdet i kosten,nyreutskillelse og leverens metabolske funksjon.

I vår studie ble nivåene av urea økt med Cd, i samsvar med tidligere publiserte resultater [21]. Gjennomsnittlig ureainnholdsverdi (figur 2B) i forsøksdyrene ved begynnelsen av forsøket var 207 mg/L. I gruppen som fikk kadmium var det en signifikant økning i de overvåkede verdiene til 329 mg/L (etter 14 dager) og 425 mg/L (etter 28 dager). I gruppen der GSE ble administrert samtidig med kadmium, var økningen i denne markøren bare litt lavere – 325 mg/L etter 14 dager og 381 mg/L etter 28 dager. Begge gruppene som bare fikk kadmium og kadmium sammen med GSE skilte seg signifikant fra kontrollgruppen etter henholdsvis 14 (p=0.001 og p=0.002) og 28 dager av eksperimentet (p < 0,001="" for="" begge).="" i="" gruppen="" som="" kun="" fikk="" gse,="" ble="" det="" funnet="" normale="">

2.2.3. Bestemmelse av plasmaantioksidantaktivitet

Kadmium induserer en rekke effekter knyttet primært til oksidativt stress. Siden Cd ikke er redoksaktiv, genererer den ikke reaktive oksygenarter direkte. Ikke desto mindre har produksjonen deres etter Cd-eksponering blitt rapportert i mange studier og gjennomgått av Cuypers et al. [23]. Mekanismene som fører til redoksforstyrrelser under Cd-eksponering inkluderer utarming av redusert glutation forårsaket av affiniteten til Cd til tiolgrupper, erstatning av Fe med Cd i proteiner som fører til økte konsentrasjoner av redoksaktivt fritt Fe, mitokondriell dysfunksjon og induksjon av NADPH-oksidaser, som katalyserer dannelsen av superoksidradikaler [23]. Under oksidativt stress kan antioksidative forbindelser som fenoler avslutte produksjonen av nye reaktive arter via deres omdannelse til stabile radikale former. Derfor kan planteekstrakter rike på fenoler gi beskyttende effekter mot Cd eller Cd-holdige forbindelser [24].

I denne studien var den gjennomsnittlige plasmaantioksidantaktivitetsverdien (figur 3) i forsøksdyrene ved begynnelsen av eksperimentet 0,71 mg/L. En svak økning ble observert i alle eksperimentelle grupper sammenlignet med kontrollgruppen. Den eneste signifikante forskjellen var imidlertid den mellom den GSE-behandlede gruppen og kontrollgruppen etter 28 dager (p=0.012), noe som bekrefter en positiv effekt av GSE på plasmaantioksidantaktivitet. Tidligere rapporterte resultater er tvetydige; noen ganger ble det funnet en økning i plasmaantioksidantpotensial forårsaket av GSE [25] og noen ganger ikke [14].

2.2.4. Bestemmelse av ALT- og AST-aktiviteter

Oksidativt stress er relatert til tap av funksjonell integritet av membranarkitektur forårsaket av økt lipidperoksidasjon. I sin tur fører den økte permeabiliteten til den cytoplasmatiske membranen til lekkasje av hepatiske markørenzymer (ALT og AST) til blod [14]. Faktisk er ALAT og ASAT diagnostisk signifikante selv ved begrenset leverskade på grunn av forgiftning, og deres økning i serum forårsaket av kadmium er rapportert tidligere [14] og ble bekreftet av denne studien. Gjennomsnittlig ALT-aktivitetsverdi (Figur 4A) i forsøksdyrene ved begynnelsen av eksperimentet var 0.84 µkat/L. I gruppen som fikk kadmium ble en signifikant økning i de overvåkede verdiene registrert til et gjennomsnitt på 1,52 µkat/L etter 14 dager (p < 0.001),="" og="" 1,87="" µkat/l="" etter="" 28="" dager="" (p="" {{="" 13}}.004).="" i="" gruppen="" der="" gse="" ble="" administrert="" samtidig="" med="" kadmium,="" var="" økningen="" av="" denne="" markøren="" signifikant="" langsommere="" enn="" i="" gruppen="" som="" bare="" fikk="" kadmium="" (1,23="" µkat/l="" etter="" 14="" dager="" og="" 1,92="" µkat/l="" etter="" 28="" dager).="" etter="" 14="" dager="" med="" eksperimentet="" var="" denne="" gruppen="" forskjellig="" fra="" både="" kontrollgruppen="" (p="0.009)" og="" kadmiumgruppen="" (p="0.026)," mens="" den="" etter="" 28="" dager="" skilte="" seg="" signifikant="" forskjellig.="" bare="" fra="" kontrollgruppen="" (s="0.003)." i="" gruppen="" som="" kun="" fikk="" gse,="" økte="" verdiene="" også="" til="" 1,17="" µkat/l="" etter="" 14="" dager.="" denne="" verdien="" skilte="" seg="" betydelig="" fra="" kontrollgruppen="" (p="0.024)" og="" var="" sammenlignbar="" med="" verdien="" av="" gruppen="" som="" fikk="" både="" gse="" og="" kadmium.="" etter="" 28="" dager="" lignet="" verdiene="" for="" gse-bare-gruppen="">

Gjennomsnittlig AST-innholdsverdi (figur 4B) i forsøksdyrene ved begynnelsen av forsøket var 2,07 µkat/L. I gruppen som fikk kadmium ble en statistisk signifikant økning i de observerte verdiene registrert først etter 28 dager etter forsøket (3,52 µkat/L, p=0.001). Overraskende nok, i gruppen der GSE ble administrert sammen med kadmium, var økningen av denne markøren raskere og signifikant forskjellig fra kontrollgruppen etter både 14 dager og 28 dager (henholdsvis 2,67 og 2,84 µkat/L, p {{15 }}.043 for begge), selv om verdien var litt lavere enn for gruppen med kun kadmium etter 28 dager. Den eneste GSE-varianten hadde normale verdier.

I vårt eksperiment var GSE-administrasjon i stand til å bremse økningen av ALT-aktivitet. Denne effekten tilsvarer resultatene rapportert tidligere [14] og kan være forårsaket av fjerning av lipidperoksider via hydrogenoverføring fra en fenolforbindelse til det frie radikal-holdige lipidperoksidet. På den annen side, på lengre sikt, var denne effekten lav. Økningen av AST-aktivitet forårsaket av kadmium ble ganske akselerert av GSE-administrasjon. På lengre sikt var det imidlertid en liten nedgang i AST-aktivitet. Dermed kan GSE delvis kompensere for den toksiske effekten av Cd på cellemembraner.

2.2.5. Bestemmelse av SOD- og CAT-aktiviteter i leveren

I tillegg til direkte deltakelse i oksidative reaksjoner, hemmer kadmium aktiviteten til antioksidantenzymer som SOD og CAT, enzymer som er i stand til å avgifte henholdsvis superoksidradikaler og hydrogenperoksid [14]. SOD er ​​et enzym som effektivt slukker superoksidradikalet og omdanner det til det mindre giftige hydrogenperoksidet, som kan spaltes ytterligere av katalase eller peroksidase [26]. CAT er et enzym som finnes i nesten alle levende organismer som utsettes for oksygen. Det fungerer som en katalysator for dekomponering av hydrogenperoksid til vann og oksygen [27]. Det har et av de høyeste konverteringstallene blant enzymer [28], og som et antioksidantenzym er det en av de beskyttende mekanismene som fører til opprettholdelse av balanse i menneskekroppen [29]. Mekanismen for Cd-indusert reduksjon i enzymaktivitet er sannsynligvis direkte binding av Cd til de aktive stedene til enzymene [30].

Nedgangen i SOD- og CAT-aktiviteter ble også observert i denne studien. Ved begynnelsen av forsøket var gjennomsnittlig SOD-enzymaktivitet i leveren (figur 5A) til forsøksdyrene 18,4 U/mg av proteinet. Etter 14 dager med eksperimentet var SOD-aktiviteten signifikant høyere i gruppen som fikk GSE (21,1 U/mg) enn i begge de kadmiummottakende gruppene (p < 0.001="" og="" p="" {{="" 9}}.009="" for="" henholdsvis="" kadmium-="" og="" kadmium="" med="" gse-gruppene,="" men="" bare="" i="" gruppen="" som="" fikk="" kadmium="" alene="" var="" sod-aktiviteten="" signifikant="" lavere="" (16,7="" u/mg)="" enn="" i="" kontrollgruppen="" (p="0" .005).="" etter="" 28="" dager="" med="" eksperimentet="" skilte="" begge="" de="" kadmiummottakende="" gruppene="" seg="" signifikant="" fra="" begge="" kontrollgruppene="" (16,4="" u/mg,="" p="0.002" og="" 17.6="" u/mg,="" p="0.023" for="" kadmium="" henholdsvis="" kun="" og="" kadmium="" med="" gse)="" og="" gruppen="" behandlet="" med="" kun="" gse="" (p="">< 0,001="" og="" p="0,005" for="" henholdsvis="" kun="" kadmium="" og="" kadmium="" med="">

Ved begynnelsen av eksperimentet var gjennomsnittlig CAT-enzymaktivitet i leveren (figur 5B) 32,7 U/mg av proteinet. Etter 14 dager med eksperimentet var CAT-aktiviteten signifikant høyere i gruppen som fikk GSE (33,5 U/mg) enn i begge gruppene som fikk kadmium (p=0.002 og p=0.031 for henholdsvis kadmium og kadmium med GSE-grupper), men bare i gruppen som fikk kadmium alene var CAT-aktiviteten signifikant lavere (23,8 U/mg) enn i kontrollgruppen (p=0.005). Etter 28 dager sank imidlertid CAT-aktiviteten i gruppen som fikk GSE sammen med kadmium ytterligere til 27,1 U/mg, nådde verdiene for gruppen som bare hadde kadmium (25,8 U/mg), og skilte seg betydelig fra kontrollgruppen (p { {21}}.033). Gruppen som ble behandlet med GSE skilte seg kun signifikant fra begge kadmiumgruppene (henholdsvis p=0.026 og p=0.012 for kun kadmium og kadmium med GSE). Interessant nok ble reduksjonene forårsaket av kadmium bremset av GSE-samadministrasjon. For CAT har disse effektene av GSE blitt observert tidligere [14]. Den chelaterende effekten av de fenoliske forbindelsene i GSE vil sannsynligvis redusere evnen til kadmium til å binde seg til det aktive setet til enzymet.

2.2.6. Bestemmelse av MT-innhold

Kadmium er ikke utsatt for noen direkte metabolske omdannelser, men i alt vev er det hovedsakelig bundet til metallothionein (MT). MT tilhører en gruppe av intracellulære, lavmolekylære, cysteinrike proteiner med en molekylvekt på 6–10 kDa. Den primære rollen til MT i organismen inkluderer å opprettholde sinkhomeostase, avgifte tungmetaller og beskytte mot oksidativt stress. MT-ekspresjon kan induseres av mange eksogene og endogene faktorer som UV-stråling, tungmetaller, stresshormoner, frie oksygenradikaler, mediatorer av betennelse, infeksjon, traumer og onkogenese [31,32]. MT syntetiseres i stor grad i leveren ognyreog slippes ut i blodet. Selv om MT er ansvarlig for kadmiumakkumulering i vev ved å senke dets utskillelse, beskytter MT mot akutt så vel som kronisk Cd-indusert toksisitet [33]. I vår studie ble MT-innholdet overvåket i blod, lever ognyre.

Gjennomsnittlig MT-innholdsverdi i blodet (figur 6A) til forsøksdyrene ved begynnelsen av forsøket var 23,9 nmol/g. Etter 14 dager var endringene minimale, og etter 28 dager ble det observert stor variasjon mellom replikatene, noe som forårsaket statistisk inkonklusjon (p=0.948). Den gjennomsnittlige MT-innholdsverdien fornyrer(Figur 6B) av forsøksdyrene ved begynnelsen av forsøket var 21,46 nmol/g. Verdiene endret seg ikke signifikant i noen eksperimentell gruppe under eksperimentet (p=0.938). Gjennomsnittlig MT-innholdsverdi i leveren (figur 6C) til forsøksdyrene ved begynnelsen av forsøket var 17,15 nmol/g. Etter 14 dager økte MT-innholdet noe i alle forsøksgruppene, og forskjellene fra kontrollgruppen var signifikante for gruppen som bare hadde Cd og gruppen som bare hadde GSE (p=0.008 og p=0 .046, henholdsvis). Etter 28 dager gikk MT-innholdet i GSE-gruppen tilbake til verdien av kontrollgruppen, mens MT-innholdet i Cd-gruppen forble økt og skilte seg fra både kontrollen og GSE-gruppen (p=0.046 og henholdsvis p=0.035). I gruppen som fikk GSE sammen med kadmium, skilte MT-innholdet seg ikke signifikant fra kontrollen - som var i samsvar med det lavere kadmiuminnholdet funnet i leveren til denne gruppen - sammenlignet med Cd-gruppen (forskjellen var signifikant etter 28 dager etter eksperimentet).

Totalt sett ble statistisk signifikante endringer i MT-innholdet forårsaket av Cd bare observert i leveren. Tidligere ble en MT-økning i blodet til forsøksdyr som fikk kadmium rapportert [34]. I dette tilfellet tyder resultatene på at avgiftning av Cd via MT snarere kan skje i leveren.

3. Materialer og metoder

3.1. EksperimentdesignBrune rotter av Wistar-slekten (åtte uker gamle, 235 ± 3 g) ble delt inn i fire grupper på seks individer: A) en kontrollgruppe av rotter som fulgte en vanlig diett (n=6); B) en gruppe rotter hvis diett GSE ble lagt til (200 mg GSE/dag) (n=6); C) en gruppe gitt kadmium (2 mg Cd/dag – konkret, CdCl2 oppløst i vann) (n=6); og D) en gruppe gitt en diett som inneholder kadmium (2 mg Cd/dag) som GSE ble tilsatt (200 mg GSE/dag) (n=6). Ekstraktet ble tatt fra frøene til druesorten Cerason; dens utarbeidelse og karakterisering er beskrevet i avsnitt 3.2. (Grapevine frøekstrakt). Ekstraktet ble veid daglig i en dose på 200 mg før det ble administrert til de eksperimentelle brunrottene (200 mg GSE til hver rotte; 0,85 g/L kg kroppsmasse). GSE ble administrert med vann. Rottene fikk fuktige fôrblandinger og ufarlig (spedbarns)vann ad libitum. En gang i uken fikk dyrene skiftet sengetøy. Etter 14 og 28 forsøksdager ble tre dyr fra hver gruppe avlivet og blodet deres ble samlet via en hjertepunktur. Før samlingen ble intraperitoneal medisin tildelt Fraxiparin (0,01 ml/kg), og etter det ble dyrene gitt dietyleter under inhalasjonsanestesi. En blodprøve ble deretter samlet inn i heparinbelagte mikroreagensrør (eller rør med EDTA – for analyser av MT og kadmium; uten påfølgende sentrifugering), og dette ble etterfulgt av skånsom sentrifugering (800 g/10 min) og oppsamling av blod plasma for videre analyse. Leveren og høyrenyreble hentet ut for videre analyse. Studien ble utført i samsvar med Helsinki-erklæringen, og protokollen ble godkjent av Expert Commission for Ensuring the Welfare of Experimental Animals ved Mendel University i Brno (for prosjekt IGA-ZF/2016-AP011).

3.2. Grapevine frø ekstrakt

Vinrankefrø (Cerason-sorten—Merlot × Seibel 13 666) ble sortert, renset, tørket og malt. Sorteringen foregikk via marskene på en separeringsmaskin, hvor frøene ble skilt fra skallene. Frøene som ble separert på denne måten ble deretter skylt, de tomme frøene fjernet og de resterende frøene renset. De rensede og vaskede frøene ble tørket i en tørketrommel ved 50 ◦C i 12 timer. Dette ble etterfulgt av maling av frøene med en IKA MF 10 Basic laboratoriekvern (IKA Werke, Staufen im Breisgau, Tyskland). De malte frøene ble ekstrahert i 75 prosent etanol i 120 timer (22 ◦C, ristet ved 50 RPM; IKA KS 260 Basic, produsent: IKA Werke, Staufen im Breisgau, Tyskland) i forholdet en del malte frø til ti deler etanol (m/m). Etter dette ble ekstraktet plassert i 25 mL reagensrør (Eppendorf, Hamburg, Tyskland) og sentrifugert (Hettich MIKRO 220 Centrifuge; Hettich, Westphalia, Tyskland) ved 4 ◦C og RCF 25,000× g. En sentrifugert prøve ble tatt fra reagensrøret og overført til en vakuumfordamper destillasjonskolbe (IKA RV 10 digital VC; IKA Werke, Staufen im Breisgau, Tyskland), hvor etanolen fordampet. Fordampningen foregikk i vakuum ved 90 ◦C, og ekstraktet ble overført til petriskåler og lyofilisert i vakuum ved 53 ◦C (Heto PowerDry PL 3000 lyophilizer; Trigon-plus, Cestlice, Tsjekkia). Etter å ha blitt tilberedt, ble ekstraktet administrert til forsøksdyrene.

CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYREINFEKSJON

3.3. Bestemmelse av antioksidantaktivitet og totalt innhold av polyfenoler

For å sikre objektiviteten til resultatene ble det brukt fire fundamentalt forskjellige metoder for å bestemme antioksidantaktiviteten. Prøver ble analysert på et BS-400 automatisk spektrofotometer (Mindray, Shenzen, Kina). Alle prøver ble analysert i tre eksemplarer, den resulterende verdien tilsvarer gjennomsnittet av disse målingene. Disse analysene ble utført etter Sochor et al. [35].

3.3.1. Bestemmelse av antioksidantaktivitet ved bruk av ABTS-metoden

En løsning for bestemmelse av antioksidantaktivitet ved ABTS-analyse ble fremstilt ved å blande to løsninger – løsning 1: 7 mM løsning av ABTS fremstilt ved å veie m=9.60 mg per 5 ml destillert vann; og løsning 2: 4,95 mM løsning av kaliumpersulfat fremstilt ved å veie m=1,67 mg per 5 mL destillert vann. Den resulterende løsningen ble fortynnet 1:10 med destillert vann og ble stående i mørkt og kaldt i 12 timer. Deretter ble 150 µL reagens R1 (7 mM ABTS og 4,95 mM kaliumpersulfat) pipettert inn i plastkyvetter, etterfulgt av tilsetning av 3 µL av prøven, og målt i et spektrofotometer (λ=660 nm) i 12 min. I henhold til kalibreringskurven ble absorbansen konvertert til ekvivalent innhold av gallussyre; antioksidantaktiviteten ble beregnet fra kalibreringskurven ved bruk av gallussyre som standard (10–200 mg·L1), og resultatene ble uttrykt som gallussyreekvivalenter.

3.3.2. Bestemmelse av antioksidantaktivitet ved bruk av DPPH-metoden

Først ble m {{0}},35 mg radikal DPPH veid. Denne mengden ble overført til en 250 ml målekolbe og fylt opp med metanol. Deretter ble 150 µL reagens R1 (0,095 mM DPPH) pipettert i plastkyvetter, etterfulgt av tilsetning av 15 µL av prøven som skulle måles. DPPH-testen er basert på evnen til det stabile frie radikalet 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl til å reagere med hydrogendonorer. DPPH viser sterk absorpsjon i ultrafiolett-synlig spektroskopi (UV-VIS) spekteret. Absorbansen ble målt i 12 minutter ved λ=505 nm. I henhold til kalibreringskurven ble absorbansen konvertert til ekvivalent gallussyreinnhold.

3.3.3. Bestemmelse av antioksidantaktivitet ved bruk av Ferri-reduserende antioksidantkraftmetode

Tre løsninger ble brukt for å bestemme antioksidantaktiviteten ved å bruke FRAP-metoden (ferri-reduserende antioksidantkraft)—(1) TPTZ-løsning: 10 mM TPTZ (m=78,02 mg) oppløst i 25 ml av 40 mM HCl; (2) FeCl3-løsning: 20 mM FeCl3 (m=135.13 mg) oppløst i 25 ml destillert vann; og (3) acetatbufferløsning: 0,02 M acetatbuffer pH 3,6 (m=775 mg natriumacetat oppløst i 250 ml destillert vann, pH justert med eddiksyre). De tre løsningene ble blandet i forholdet 1:1:10 (TPTZ: FeCl3:acetatbuffer). Deretter ble 150 µL reagens pipettert inn i plastkyvetter og 3 µL av prøven ble tilsatt. Absorbansen ble målt i 12 minutter ved λ=605 nm. Antioksidantaktivitet ble beregnet fra kalibreringskurven ved bruk av gallussyre som standard (10–200 mg·L1). Resultatene ble uttrykt som gallussyreekvivalenter.

3.3.4. Bestemmelse av antioksidantaktivitet ved bruk av klorofyllinfrie radikalmetoden

Totalt 200 µL reagens R1 (0,1 M HCl, klorofyllekstrakt, reaksjonsbuffer, katalysator) ble pipettert inn i plastkyvetter og deretter ble 8 µL av prøven tilsatt. Denne metoden bruker evnen til klorofyllin (natrium-kobbersalt av klorofyll) til å akseptere og donere elektroner mens den stabilt endrer absorpsjonsmaksimum. Denne prosessen er betinget av det alkaliske miljøet og tilsetning av en katalysator. Absorbansen ble målt i 12 minutter ved λ=450 nm. De siste måleverdiene ble brukt til beregningen. Resultatene ble uttrykt som gallussyreekvivalenter.

3.3.5. Bestemmelse av total polyfenolkonsentrasjon

Folin-Ciocalteu-metoden ble brukt for å bestemme totale polyfenoliske forbindelser. Alle prøver ble analysert i tre eksemplarer, og den resulterende verdien ble oppnådd som gjennomsnittet av disse målingene. En 40 µL prøve ble pipettert inn i en kyvette (3 mL) og fortynnet med 1960 µL destillert vann. Deretter ble 50 µL Folin-Ciocalteu-reagens tilsatt til kyvetten. Blandingen ble ristet grundig, og etter 3 minutter ble 300 µL 20 prosent Na2CO3-dekahydratløsning tilsatt. Reaksjonsblandingen ble ristet og inkubert ved 22 ◦C i 120 min. Etter dette tidspunktet ble absorbansen (SPECORD 210; Carl-Zeiss, Jena, Tyskland) målt ved λ=750 nm mot en blank. Resultatene ble uttrykt som gallussyreekvivalenter.

3.4. Bestemmelse av antioksidanter ved HPLC

Bestemmelse av individuelle antioksidantkomponenter ved bruk av høyytelses væskekromatografi med massespektrometer. Analyser av prøver brukt for estimering av flavonoider og proantocyaniner ble utført i et Agilent Technologies 12{{10}}0 (Jet Stream Technologies, Santa Clara, CA, USA) kromatografisk system bestående av følgende enheter: mobilfasereservoar, avgasser, binær pumpe, prøvereservoar med en autosampler og massedetektor med en Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS (Jet Stream Technologies, Santa Clara, CA, USA). Separasjon av prøver ble utført i Zorbax SB C18 kromatografiske kolonner med dimensjoner 50 × 2,1 mm og størrelsen på partikler 2,7 µm. Analyseperioden var alltid 6 min. Medhastigheten til bærergassen var 0,6 ml·min1. Den organiske komponenten i den mobile fasen var metanolgradientkvalitet (løsningsmiddel B) og den vandige komponenten inneholdt 0,05 M ammoniumformiat (løsningsmiddel A). Gradienten til den bevegelige fasen var som følger: tid 0 min: 50 prosent løsningsmiddel A og 50 prosent løsningsmiddel B; tid 2,5 min: 100 prosent løsningsmiddel A og 0 prosent løsningsmiddel B; tid 5 min: 50 prosent løsemiddel A og 50 prosent løsemiddel B. Temperaturen på kolonnetermostaten ble justert til 45 ◦C.

CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYRESMERTER

3.5. Bestemmelse av utvalgte biokjemiske markører

Biokjemiske markører i blod, plasma, lever ognyreav dyrene ble overvåket for å bestemme den beskyttende effekten av GSE mot de negative effektene av kadmium. Følgende analyser ble utført: (1) Plasmaanalyser: total plasma antioksidantaktivitet, kreatinin, urea, ALT, ASAT. (2) Blodanalyser: MT. (3) Leveranalyser: SOD, CAT, MT. (4)Nyreanalyser: MT.

3.5.1. Bestemme den totale plasmaantioksidantaktiviteten,Kreatinin, urea, ALT og AST En BS{{0}} automatisert biokjemisk analysator (Mindray, Shenzen, Kina) ble brukt til å analysere den totale antioksidantaktiviteten til plasma, kreatinin, urea, ALT og AST. Bestemmelse av total antioksidantaktivitet i plasma Friradikalmetoden ble brukt for å bestemme antioksidantaktiviteten til plasma [35]. Denne metoden bruker evnen til klorofyllin (natrium-kobbersaltet av klorofyll) til å akseptere og donere elektroner mens den stabilt endrer absorpsjonsmaksimumet. Denne prosessen er betinget av det alkaliske miljøet og tilsetning av en katalysator. Totalt 200 µL reagens R1 (0,1 M HCl, klorofyllinekstrakt, reaksjonsbuffer og katalysator) ble pipettert inn i plastkyvetter, hvoretter 8 µL av prøven ble tilsatt. Absorbansen ble målt i 12 minutter ved λ=450 nm, og den siste måleverdien ble brukt for beregningen. Antioksidantaktivitet ble beregnet fra kalibreringskurven ved bruk av gallussyre som standard, og resultatene ble uttrykt som en gallussyreekvivalent.

Bestemmelse av kreatinininnholdPrinsippet for metoden er fotometrisk bestemmelse av fargekomplekset til kreatinin med alkalisk pikrat, hvis dannelseshastighet er proporsjonal med konsentrasjonen av kreatinin i prøven. Et diagnosesett fra Greiner (Greiner GmbH, Pleidelsheim, Tyskland) ble brukt for å bestemme kreatinin. Totalt 18 0 µL reagens R1 (0,16 mM natriumhydroksid) ble pipettert inn i kyvetten, etterfulgt av tilsetning av 10 µL av prøven og 30 µL av reagensen R2 (4 mM pikrinsyre). Absorbansen ble målt i seks minutter ved λ=505 nm. Absorbansverdien til reagens R1 alene med prøven og absorbansverdien etter 6 min inkubering med reagens R2 ble brukt for beregningen.

Bestemmelse av alaninaminotransferaseEt diagnosesett fra Greiner (Greiner GmbH, Pleidelsheim, Tyskland) ble brukt for å bestemme ALT. Først ble 15 0 µL reagens R1 (100 mM Tris-buffer pH 7,5; 500 mM L-alanin, 1200 U/L laktatdehydrogenase) og 15 µL plasmaprøve automatisk pipettert inn i kyvettene. Deretter ble 30 µL reagens R2 (15 mM 2-oksoglutarat, 0,18 mM NADH) automatisk pipettert og blandingen ble inkubert i 5 minutter. Absorbansen ble målt ved λ=340 nm. Absorbansverdiene for reagens R1 alene med prøven og absorbansverdiene etter 5 min inkubering med prøven ble brukt for beregningen. Resultatet ble konvertert i henhold til kalibreringskurven til enzymaktiviteten i µkat/L.

Bestemmelse av aspartataminotransferaseEt diagnosesett fra Greiner (Greiner GmbH, Pleidelsheim, Tyskland) ble brukt for å bestemme AST. Først ble 15 0 µL reagens R1 (80 mM Tris-buffer pH 7,8, 240 mM L-aspartat, 1200 U/L malatdehydrogenase) og 15 µL plasmaprøve av forsøksdyr automatisk pipettert inn i kyvettene. Deretter ble blanding og inkubering utført ved 37 ◦C i 270 s. Deretter ble 30 µL R2-reagens (15 mM 2-oksoglutarat, 0,18 mM NADH) automatisk pipettert og blandingen ble inkubert i 5 minutter. Absorbansen ble målt ved λ=340 nm. Absorbansverdiene for reagens R1 alene med prøven og absorbansverdiene etter 5 min inkubering med prøven ble brukt for beregningen. Resultatet ble konvertert i henhold til kalibreringskurven til enzymaktiviteten i µkat/L.

Bestemmelse av ureaFølgende prosedyre ble brukt for å bestemme urea: 200 µL reagens R1 (Tris-buffer pH 7,8, ADP, urease og GLDH) og 200 µL reagens R2 (2-oksoglutarat, NADH) ble automatisk pipettert i kyvetter, etterfulgt av en prøve med volum 4 µL, hvoretter blandingen ble blandet og inkubert ved 37 ◦C i 30 s. Deretter ble absorbansen ved λ=340 nm målt og etter ytterligere 60 s ble absorbansen målt igjen. Absorbansverdiene etter 30 s og etter ytterligere 60 s ble brukt til beregningen. Verdiene ble trukket fra hverandre og resultatet ble konvertert i henhold til kalibreringskurven til ureainnholdet.

Bestemmelse av totalt proteiner ved bruk av Biuret-metodenBestemmelsen av totale proteiner ved Biuret-metoden er beskrevet i detalj i en annen publikasjon [9]. Totalt 180 µL Biuret-reagens (15 mM natriumkaliumtartrat, 100 mM NaI, 5 mM KI og 5 mM CuSO4) ble pipettert inn i kyvetten, etterfulgt av 45 µL av prøven. Etter ti minutters inkubering ved 37 ◦C ble absorbansen ved bølgelengden λ=546 nm målt. Prinsippet her er reaksjonen av peptidbindingen med Cu (II) i et alkalisk miljø, med dannelse av en blåfiolett farge. Absorbansverdien til reagenset alene og absorbansverdien etter ti minutters inkubering med prøven ble brukt for beregningen.

3.5.2. Bestemmelse av Superoxide Dismutase (SOD) og Catalase (CAT) Bestemmelse av SOD-aktivitetEt kommersielt sett (19160 SOD, Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland) ble brukt for å bestemme SOD-aktivitet (SOD, EC 1.15.1.1). Målingen ble utført i en plastkyvette på en BS 400 automatisk analysator (Mindray, Shenzen, Kina). Først ble 200 µL reagens R1 (20× bufferfortynnet WST-løsning) pipettert inn i kyvetten og reagensen ble inkubert ved 37 ◦C i 108 s (1 min, 48 s). Deretter ble 20 µL prøve pipettert, og ved 378 s (6 min, 18 s) ble reaksjonen startet ved å tilsette 20 µL reagens R2 (167× bufferfortynnet enzymløsning). Blandingen ble inkubert i 72 s (1 min, 12 s) og deretter ble absorbansen målt ved λ=450 nm. Reaksjonskinetikken ble målt i 180 s (3 min) og absorbansen ble avlest hvert niende sekund. Instrumentet beregnet den gjennomsnittlige økningen i absorbans per minutt (∆A) og SOD-aktiviteten til de målte prøvene, i henhold til kalibreringsligningen. Resultatene ble uttrykt i U/ml og deretter konvertert til mg protein.

3.5.3. Bestemmelse av metallothioneininnholdBestemmelsen av metallothioneinkonsentrasjonen i blodet, leveren ognyrerav de brune rottene ble utført ved bruk av adsorptive transfer stripping-teknikken (AdTS) med differensiell pulsvoltammetri (DPV). For analysen ble 200 µL av den analyserte supernatanten tatt og blandet med 1 800 µL av Brdiˇckas reagens i en målebeholder, hvoretter selve den elektrokjemiske bestemmelsen ble utført. Analysen ble utført i samsvar med en tidligere beskrevet protokoll [37]. Det ble brukt en klassisk kobling med tre elektroder. Arbeidselektroden var en hengende kvikksølvdråpeelektrode (HMDE) med et fallareal på 0,4 mm2, mens referanseelektroden var Ag/AgCl/3 M KCl og hjelpemidlet var en platinaelektrode. Basiselektrolytten (1 mmol·L1 [CO(NH3)6] Cl3 og 1 mol·L1 ammoniumbuffer; NH3(aq) pluss NH4Cl, pH 9,6) ble endret for hver målte prøve. DPV-parametrene var som følger: initialpotensial 0,7 V, sluttpotensial 1,75 V, boblende 5 s, avsetningstid 240 s, modulasjonstid 0.0 5 s, intervalltid 0,25 s, potensialtrinn 0,00105 V, skannehastighet 0,0042 V/s, og modulasjonsamplitude 0,02505 V. MT-bestemmelsen ble utført på en måleenhet bestående av en 695 Autosampler koblet til en VA Standing-enhet 693 meledasur. av en 693 VA TraceAnalyser kontrollenhet (alle Metrohm, Herisau, Sveits). Hele målesystemet ble avkjølt til 4 ◦C ved bruk av en Julabo F25 (Julabo, Seelbach, Tyskland). De oppnådde voltammogrammene ble eksportert til VA Database 2.2-programmet (Metrohm, Herisau, Sveits), og de analyserte prøvene ble deoksygenert ved aktiv bobling av argon med en renhet på 99,999 prosent.

3.5.4. Bestemmelse av kadmiuminnhold i blod, lever og nyrer nedbrytning av prøver  En Ethos One mikrobølgeekstraktor (Milestone, Sorisole, Italia) ble brukt til nedbryting av leveren ognyreprøver, og en Multiwave 3000 Microwave Extractor (Anton Paar Graz, Østerrike) ble brukt for dekomponering av blodprøvene. Mineralisering skjedde på en våt måte, ved bruk av 65 prosent salpetersyre (HNO3 supra pure) (Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland) og 30 prosent hydrogenperoksid (H2O2 supra pure) (Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland) Totalt 0,4 g av lever ellernyreprøven ble veid inn i en serie teflflonbeholdere, og 5 ml 65 prosent HNO3, 3 ml 30 prosent H2O2 og 2 ml Milli Q H2O ble tilsatt prøven. Beholderne ble lukket og instrumentet startet i henhold til produsentens instruksjoner. Mikrobølgenedbrytningen varte i 40 minutter ved 210 ◦C. Deretter ble prøvene avkjølt i 45 minutter og lagret ved 4 ◦C i PE-beholdere. Totalt 0,01 g av en blodprøve ble veid inn i en serie glassbeholdere, og 300 µL 65 prosent HNO3 og 200 µL 30 prosent H2O2 ble tilsatt prøven. Beholderne ble lukket og instrumentet startet i henhold til produsentens instruksjoner. Mikrobølgenedbrytningen varte i 40 minutter ved en temperatur på 140 ◦C. Deretter ble prøvene avkjølt i 45 minutter og lagret ved 4 ◦C frem til bestemmelse ved AAS.

Bestemmelse av kadmium ved atomabsorpsjonsspektrometriKadmiumet ble bestemt på en Agilent 280/240 Series AA Systems-enhet (Agilent Technologies). Leveren ognyrePrøvene ble analysert i acetylen-luftflamme (Fa AAS), og blodprøvene ved elektrotermisk forstøvning (ETA AAS) ved en bølgelengde på 228,8 nm. En kalibreringsserie med konsentrasjoner på 0–20 µg·Lfor analyser på ETA AAS og 0–10 mg·L1for Fa AAS ble fremstilt fra en standardløsning av kadmium (Analytika Praha, Prag, Tsjekkia), med en konsentrasjon på 1.000 ± 0,002 g·L1. Dette ble fulgt av en måling av kalibreringsserieløsningene og konstruksjon av kalibreringskurvene, hvoretter mineraliseringen av blod, lever ognyreprøver ble målt.

3.6. Statistisk analyseAlle målinger ble utført i tre eksemplarer. Ytterligere verdier ble identifisert med Grubbs-testen og ekskludert (totalt ble det funnet to uteliggere). Før statistisk analyse ble dataene transformert ved logaritmisk transformasjon og analysert ved enveis ANOVA (hvert tidspunkt separat) med en Tukey HSD post-hoc test. Terskelen for statistisk signifikans ble satt til p <>

4. Konklusjoner

Det har vært en nylig farmasøytisk og økonomisk trend å se etter nye medisiner blant plantesekundære metabolitter, som er stoffer som kan bidra til å beskytte mot en rekke sykdommer. Takket være de viktige biologisk aktive komponentene som vinrankefrø inneholder i matrisen, kan de brukes (og er allerede) til medisinske formål. Druefrøekstrakter er kjent for å beskytte vev mot oksidativt stressrelatert skade forårsaket av det giftige tungmetallet kadmium. Denne beskyttelsen er sannsynligvis påvirket av den fenoliske sammensetningen til de brukte druefrøene. I denne studien ble et druekjerneekstrakt fremstilt fra den semi-resistente varianten Cerason med et ganske høyt fenolinnhold testet for beskyttende effekter mot kadmium-induserte endringer. Den studerte GSE var i stand til å øke plasma antioksidantaktivitet når den ble administrert alene og senke kadmiuminnholdet i leveren ognyrerav rottene ved samtidig administrering. Følgelig øker hepatisk markør enzym ALT ognyremarkør kreatinin forårsaket av kadmium ble bremset av GSE. Videre ble reduksjonen i aktivitetene til antioksidantenzymene SOD og CAT forårsaket av kadmium bremset av GSE samtidig administrering. Disse resultatene viser at GSE er et kraftig beskyttende middel mot effekten av tungmetaller.