Materialer og metoder

6. Cellulære opptaksanalyser

Internalisering av EV-er i celler ble overvåket ved først å farge LEV-er og SEV-er med lipofile DiI (MOP-D -3911) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Etter å ha behandlet celler med fargede elbiler i 1, 3, 6, 12, 24 og 48 timer, ble vekstmediet fjernet og cellene ble fiksert med 4 prosent paraformaldehyd (Wako, Japan). Hoechst 33342 (Invitrogen) ble tilsatt og cellene ble inkubert i 15 minutter ved romtemperatur for å farge kjernene (blå). Til slutt ble cellene vasket med PBS inneholdende 1 prosent bovint serumalbumin, og fluorescens (rød og blå) ble observert under et fluorescensmikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland). Minst tre felt ble valgt og analysert ved hjelp av ImageJ-programvare.

7. Måling av melanininnhold

For å vurdere melanininnholdet ble B16BL6 melanomceller først inokulert i 24-brønnplater (5 × 104 celler/brønn) i et volum på 500 μL. Etter 24 timers inkubasjon, cellerble behandlet med 100 nM -MSH (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) alene eller 50 μL LEV og SEV ved 1, 5 og 10 µg/ml i 48 timer. Etter behandling ble cellene vasket med PBS og deretter inkubert med 2,5 prosent trypsin (Gibco, Thermo Fisher Scientific) for isolering. Cellemikrosfærer ble oppløst i 1 n natriumhydroksidløsning (Sigma-Aldrich) inneholdende 1 prosent DMSO (Sigma-Aldrich) i 1 time ved 80 grader. Cellelysatene ble overført til en 96-brønnplate og melanininnholdet ble bestemt ved å måle absorbansen ved 405 nm ved bruk av en enzymmarkør (BioTek). Melanininnholdet ble bestemt ved å bruke en melaninstandardkurve konstruert fra 0-100 µg/mL syntetisk melaninløsning (Sigma-Aldrich) (ekstracellulære vesikler figur som følger). Melanininnholdet ble beregnet ved sammenligning med kontroller.

8. Tyrosinaseaktivitetsanalyse

TYR-aktivitet ble målt ved å bruke L-DOPA-oksidaseaktivitet. B16BL6-celler ble inokulert i -MEM-medium inneholdende 100 nM Sigma-Aldrich -MSH (500 μL) og dyrket med en tetthet på 1 × 105 celler/brønn i 24-brønnkulturplater. Etter å ha behandlet celler med 50 μL LEV-er og SEV-er i konsentrasjoner på 10, 50 og 100 μg/mL i 24 timer, ble cellene vasket med PBS og lysert med 1 prosent Triton X -100 (Sigma-Aldrich). De lyserte cellene ble inkubert ved - 80 grad i 30 minutter og deretter lyofilisert og lagret ved romtemperatur i 10 minutter. De resulterende prøvene ble klargjort ved sentrifugering ved 12,000 x g i 15 minutter, hvoretter 2 mg/ml L-DOPA (Sigma-Aldrich) ble tilsatt og inkubert ved 37 grader i 1 time. Absorbansen ble deretter målt ved 490 nm ved bruk av en enzymmarkør (BioTek). Absorbansen ble deretter målt ved 490 nm ved bruk av BioTek.

Klikk her for å fåCistanche-fordelene med å bleke hudoghva er effekten av Cistanche tubulosa

9. Western blot-analyse

Proteinnivåer assosiert med den anti-melanogene veien ble bestemt intracellulært ved Western blot-analyse av helcelleekstrakter. Et volum på 500 μL B16BL6-musemelanomceller ble inokulert i 24-brønnplater (1 × 105 celler/brønn). Celler ble lysert ved inkubering i RIPA-buffer (Thermo Fisher Scientific) i 20 minutter i nærvær av proteasehemmerblanding (Roche, Tyskland) og behandlet med 50 μL 10, 50 og 100 μg/mL EVs i 24 timer. Cellelysatene ble sentrifugert ved 17 709 g i 15 minutter og proteinkonsentrasjonen i de resulterende lysatene ble bestemt ved bruk av et BCA-analysesett (Thermo Fisher Scientific). Like mengder protein (10-20 ug/prøve) ble lastet inn i brønnene med Bolt 4-12 prosent Bis-Tris Plus-geler (Invitrogen) og elektrooverført til PVDF (polyvinylidenfluorid)-membraner (GE Healthcare, Chicago, IL, USA). Membranene ble vasket med Tris-bufret saltvann inneholdende 0,2 prosent (v/v) ten -20 (TBST), lukket med TBST som inneholdt 5 prosent (w/v) skummet melk (Gibco, Thermo Fisher Scientific) i 1 time ved RT, og deretter inkubert ved 4 grader i en primær antistoffløsning fortynnet med 1 prosent (w/v) skummet melk. Inkubering ble utført over natten. Primære antistoffer som ble brukt inkluderte anti-TRP-1 (1:1000), anti-TRP-2 (1:1000) og anti-MITF(1:1000) antistoffer fra Abcam, Cambridge, Storbritannia; anti-TYR (1:500) antistoffer fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Anti- -aktinantistoff (1:500; Santa Cruz) ble brukt for standardisering på proteinnivå. Primære antistoffer ble påvist med pepperrotperoksidase (HRP)-merket sekundært antistoff fra Genetex (Irvine, CA, USA). Membraner ble vasket med TBST og inkubert i 1 time ved romtemperatur med en 1:2000 fortynning av det sekundære antistoffet i TBST. Signalet som ble generert etter vasking av membranen med TBST og inkubering med forsterket kjemiluminescens (ECL) reagens (GE Healthcare) ble oppdaget ved bruk av et ImageQuant 350 gel-bildesystem (GE Healthcare).

10. Elektronmikroskopi påvisning av intracellulær melanin produksjon

Celler ble behandlet med LEV eller SEV og inkubert i 48 timer. Etter behandling ble cellene fiksert ved inkubering med 200 mM kakodylatbuffer inneholdende 8 prosent glutaraldehyd og 20 prosent paraformaldehyd (Wako). Når de var dehydrert med etanol, ble ultratynne seksjoner forberedt ved bruk av en Leica EM UC7 mikrotom (Leica) og samlet på et 200-nett av kobbernett. Snitt ble farget med 1 prosent uranylacetat og blycitrat, og bilder ble tatt med et JEOL JEM 1010 transmisjonselektronmikroskop (JEOL) ved 80 kV.

Cistanche ekstrakt

11. Måling av blekingseffekt ved hjelp av en menneskelig hudmodell

Derm-me (Tego Science, Seoul, Korea) menneskehudmodell ble brukt til å teste blekingseffekten til LEV-er. Humant hudvev ble behandlet med 10 μg/mL lev i 7 dager som en negativ kontroll. Konsentrasjonen av arbutin var 70 µg/ml. Humant hudvev ble oppløst i 1 N NaOH og absorbansen ved 405 nm ble målt ved bruk av en enzymmarkør (BioTek) for å bestemme melanininnholdet. På dag 7 ble hudpigmentering sammenlignet ved mikroskopisk analyse av Fontana - murerfargede prøver. For Fontana-Masson-farging ble hudprøver fiksert over natten ved RT i 4 prosent paraformaldehyd (Waco), snittet og innebygd i parafinvoks. Parafininnstøpte seksjoner ble deretter oppvarmet i en ovn ved 60 grader i 1 time for å tørke. Seksjonene ble deretter bløtlagt tre ganger i xylen, to ganger i 95 prosent etanol og to ganger i 100 prosent etanol, og deretter vasket med destillert vann. Fontana-Masson-farging ble utført ved bruk av ammoniakksølvløsningen ved 56 grader og vasket med destillert vann. Objektglassene ble deretter fiksert i 0,2 % gullkloridløsning og nedsenket i 5 % natriumtiosulfatløsning ved romtemperatur. Til slutt ble glassene dehydrert i fersk alkohol.

12. Statistisk analyse

Dataene oppnådd fra eksperimentene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Vi utførte eksperimenter med fire grupper av aktivitet, melanininnhold og TYR-aktivitet (tilleggsbilde S3). Enveis variansanalyse (ANOVA) og Dunnetts test ble utført ved bruk av GraphPad Prism (GraphPad Prism Software Inc., San Diego, CA, USA). p < forskjeller; 0.05, p < 0.01, p < 0.001 ble ansett som statistisk signifikante.

Cistanche tubulosa ekstrakt

Diskusjon

I motsetning til de fleste eukaryote celler har planter en kompleks cellevegg, som utgjør en viktig barriere for bevegelse av eksosomer. Som et resultat frigjør planteceller eksosomer gjennom en serie multivesikulære legemer smeltet sammen med plasmamembranen. De sekretoriske produktene frigjort av plantesekreter avsettes i det periplasmatiske gapet ved siden av plasmamembranen; når de akkumuleres, genererer de et trykk som gjør at sekretet kan krysse celleveggbarrieren. Som et resultat kan utskilt materiale, inkludert eksosomer, frigjøres uten behov for energi. Planteavledede EV-er er like i størrelse som eller større enn naturlig forekommende dyrecelleeksosomer og ligner på de som er observert i solsikkeeksosomal væske (50-200 nm) og Arabidopsis EV-er (50-300 nm). Cellulær opptakseffektivitet anses å være en nøkkeldeterminant for effektivitet, ettersom målene til mange terapeutiske midler er lokalisert intracellulært. Derfor bestemte vi den optimale timingen og konsentrasjonen av opptak av melanomceller og observerte rask overføring av LEV-er og SEV-er til melanomceller innen 12 timer.

TYR er et glykoprotein som katalyserer omdannelsen av l-tyrosinase til L-DOPA, det hastighetsbegrensende trinnet i melaninsyntesen. Begge EV-ene viser en anti-melanogen effekt, men den anti-melanogene effekten av LEV er betydelig større enn SEV.

Melaninproduksjonen reguleres av -MSH-MC1R, og hemming av PKC er kjent for å redusere hud- og hårpigmentering. Imidlertid antyder mange genetiske, biokjemiske og farmakologiske studier at -MSH-MC1R-signalveien er en viktig driver for melanogenese. Selv om eksperimentene våre ikke viste en direkte interaksjon mellom MITF og TYR, ble det vist at LEV-er hemmer melanogenese ved å redusere MITF-ekspresjon gjennom den UV-avhengige -MSHMC1R-veien, som igjen reduserer uttrykket av TYR, TRP-1, og TRP-2. Vi antar at TRP-familieproteinene er indirekte knyttet til hverandre, men ytterligere eksperimenter kan være nødvendig for å demonstrere en direkte interaksjon mellom dem. Videre viser rekonstruerte humane hudmodeller at UV-indusert melaninsyntese og melanininnhold effektivt hemmes av LEV-er.

Cistanche dulcis

Konklusjon

Våre funn tyder på at LEV-er er kandidater for nye anti-melanogene legemidler som reduserer melanogenese ved å hemme uttrykket av melanin-relaterte proteiner. Resultatene bekreftet at LEV-er reduserte MITF og dermed nedregulerte TRP-er i B16BL6-melanomceller. levs og arbutin hemmet TRY med henholdsvis 66 prosent og 67 prosent. Melanininnholdet i LEVs-behandlet rekonstruert hud ble redusert med henholdsvis 43 prosent og 28 prosent sammenlignet med den ubehandlede negative kontrollen og arbutin som positiv kontroll.

Basert på de tidlige funnene tror vi at planteavledede elbiler kan være nyttige som et anti-melanogen middel for utvikling av naturlig kosmetikk. Ytterligere forskning er nødvendig i fremtiden for å utvikle planteavledede elbiler som en effektiv ingrediens for hudforbedring, og det er nødvendig å demonstrere sikkerheten til planteavledede elbiler på menneskelige hudmodeller. Resultatene våre tyder på at EV kan brukes til å redusere melanin og dermed lysne huden. Imidlertid kan EV ha toksiske effekter på huden, og andre eksperimenter som allergitester eller Ames-tester bør utføres.

REFERANSER

[1] Nosanchuk JD, Nimrichter L, Casadevall A, et al. En rolle for vesikulær transport av makromolekyler over cellevegger i sopppatogenese. Commun Integr Biol. 2008;1(1):37–39.

[2] Robinson DG, Ding Y, Jiang L. Ukonvensjonell proteinsekresjon i planter: en kritisk vurdering. Protoplasma. 2016;253(1):31–43.

[3] Paiva EA. Hvordan krysser sekretoriske produkter plantecelleveggen for å bli frigjort? En ny hypotese som involverer sykliske mekaniske handlinger av protoplasten. Ann Bot. 2016;117(4):533–540.

[4] Hood JL, Scott MJ, Wickline SA. Maksimerer eksosome kolloidal stabilitet etter elektroporasjon. Anal Biochem. 2014;448(1):41–49.

[5] Rutter BD, Innes RW. Ekstracellulære vesikler isolert fra bladapoplasten bærer stress-responsproteiner. Plant Physiol. 2017;173(1):728–741.

[6] Luan X, Sansanaphongpricha K, Myers I, et al. Engineering exosomes som raffinerte biologiske nanoplattformer for medikamentlevering. Acta Pharmacol Sin. 2017;38(6):754–763.

[7] Videira IF, Moura DF, Magina S. Mekanismer som regulerer melanogenese. En Bras Dermatol. 2013;88(1):76–83.

[8] Park HY, Lee J, Kapasi S, et al. Lokal påføring av en proteinkinase C-hemmer reduserer hud- og hårpigmentering. J Invest Dermatol. 2004;122(1):159–166.

[9] Yamanishi DT, Graham M, Buckmeier JA, et al. Det differensielle uttrykket av proteinkinase C-gener i normale humane neonatale melanocytter og metastatiske melanomer. Karsinogenese. 1991;12(1):105–109.

[10] Borovansky J, Riley PA. Melaniner og melanosomer: biosyntese, biogenese, fysiologiske og patologiske funksjoner. Hoboken, NJ: Wiley-Blackwell; 2011

[11] D'Mello S, Finlay G, Baguley B, et al. Signalveier i melanogenese. Int J Mol Sci. 2016;17(7):1–18.