Hvordan nitrogenoksidsyntase påvirker nyrene?

Kontakt: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Molekylær studie av diazinontoksisitet basert på induserbar nitrogenoksidsyntase (iNOS) uttrykk i hepatocytter og nyrehistopatologi hos rotter (Rattus norvegicus)

Abstrakt

Diazinon er et organofosfat insektmiddel som er mye brukt for å utrydde skadedyr, men som har en høyere toksisitet enn andre insektmidler. Diazinon som ved et uhell konsumeres oralt har en innvirkning på økte reaktive oksygenarter (ROS) i kroppen. Reaktive oksygenarter (ROS) vil aktivere pro-inflammatorisk cytokin som vil indusere det induserbareNitrogenoksidsyntase(iNOS) hvor iNOS (Nitrogenoksidsyntase) vil produsereNitrogenoksid(NO) som en fri radikal. Et høyt nivå av ROS vil forårsake skade på cellene. Denne studien var rettet mot å bestemme toksisitetseffekten av diazinon mot iNOS (Nitrogenoksidsyntase)uttrykk i lever ognyrehistopatologi av rotter (Rattus norvegicus). Rottene ble delt inn i 4 grupper som består av den negative kontrollgruppen og tre forsøksgrupper som fikk diazinon 20 mg/kg kroppsvekt(P1), 40 mg/kg kroppsvekt(P2), og 60 mg/kg kroppsvekt (P3). Parametrene som ble observert i denne forskningen er uttrykk for iNOS (Nitrogenoksidsyntase)i leveren ved bruk av immunhistokjemifarging og deretter analysert med enveis ANOVA etterfulgt av Tukey-test (a=0,05), ognyrehistopatologi som ble observert ved bruk av Hematoxylin-Eosin-farging og analysert kvalitativt beskrivende. Resultatene viste at administrering av diazinon oralt var signifikant økt iNOS (Nitrogenoksidsyntase)uttrykk (s<0,001)in the="" liver="" and="" caused="" damage="" to="" the="">nyrenescortex som ble vist ved inflammatorisk celleinfiltrasjon, nekrotisk avnyretubuliceller, og blødning i inter-tubulært rom.

Nøkkelord:Diazinon, Organofosfat, iNOS (Nitrogenoksidsyntase)uttrykk,nyrehistopatologi.

Cistanche forbedrer nyrefunksjonen

1. Introduksjon

Bruk av plantevernmidler har blitt følt å øke produksjonen, spesielt som et forebyggende middel mot skadedyr og ugress (Kusriani, 2012). Imidlertid kan hyppig bruk av plantevernmidler føre til at disse plantevernmidlene er giftige for forbrukere, inkludert dyr både ved innånding, oralt og gjennom huden (Ameriana, 2006). Et plantevernmiddel som er vanlig å bruke er diazinon. Diazinon er et organofosfat plantevernmiddel som har en mekanisme som hemmer funksjonen til enzymet kolinesterase. Disse plantevernmidlene har også mindre effekt på ikke-målorganismer og er mer giftige for virveldyr sammenlignet med klororganiske (Luthfanto, 2014). Normalt vil plantevernmidler nøytraliseres i leveren av hepatocytter gjennom avgiftning, men disse forbindelsene er også i stand til å danne frie radikaler på grunn av celleskade. Organofosfateksponering som skjer kontinuerlig kan utløse leverskade som et organ som spiller en rolle i avgiftningsprosessen (Ginting, 2014). Organofosfater som har blitt metabolisert i leveren har evnen til å hemme AChE-enzymet. Hemming av dette enzymet resulterer direkte i en økning i acetylkolinnivåer i nervesystemet og det nevromuskulære systemet. Økningen i AChE kan føre til at ioner i cellene blir ustabile og utløser dannelsen av Reactive Oxygen Species (ROS) (Uchendu, 2012). Økt ROS vil utløse produksjonen av proinflammatoriske cytokiner. Naik og Vishva (2011) uttaler at ROS påvirker transkripsjonen av proinflammatoriske cytokiner der høye nivåer av ROS vil bli fulgt av høye nivåer av proinflammatoriske cytokiner, samt at hvis ROS-produksjonen hemmes av inhibitorer vil det påvirke reduksjonen i produksjonen av proinflammatoriske cytokiner som f.eks. som IL-6 og TNF. Økt produksjon av proinflammatoriske cytokiner vil indusere iNOS (Nitrogenoksidsyntase)og danner NO i for store mengder (Aktan, 2004).

Denyreer hovedorganet som opprettholder balansen av ekstracellulær væske (ECF) ved å utføre funksjonene i utskillelse og metabolisme (Curthoys, 2014). Utskillelse eller eliminering av xenobiotisk metabolisme resultater utført inyre. Denyreskade kan redusere nivået av utskillelse av kjemikalier uten å øke toksisiteten til giftige stoffer (Gupta, 2012). Den oksidative stresstilstanden vil sette i gang lipidperoksidasjonsprosessen ved å ta hydrogenioner fra den polyumettede fettsyrebindingen (PUFA) for å danne et mer stabilt molekyl. Bindingsbrytende prosessen på PUFA kan forårsake celle- eller vevsnekrose (Sharma et al..2003).

Denne studien ble utført for å bestemme toksisitetseffekten av diazinon mot iNOS (Nitrogenoksidsyntase)uttrykk i lever- og nyrehistopatologi hos rotter.

Nitrogenoksidsyntase påvirker nyrefunksjonen

2. Materialer og metoder

2.1. Dyremodeller og eksperimentell design

Tjue rotter (Rattus norvegicus) ble delt inn i 4 grupper: negativ kontrollgruppe (friske rotter). P1-, P2- og P3-gruppene ble administrert med diazinon i 8 uker oralt ved bruk av en ernæringssonde med doser på henholdsvis 20 mg/kg kroppsvekt, 40 mg/kg kroppsvekt og 60 mg/kg kroppsvekt. Diazonium 600EC ble blandet med destillert vann til det inneholdt 5 mg diazonium i 1 mL (Baconi et al., 2013).

Rottene ble akklimatisert i en uke før de fikk behandling. Alle forhold og håndtering av dyr ble utført med protokollen godkjent av den etiske godkjenningskomiteen ved Brawijaya University (nr: 732-KEP-UB).

2.2. Forberedelse og observasjon av nyrehistopatologi

Forberedelse avnyrehistopatologi består av følgende stadier: fiksering, dehydrering, rydding, innstøping, seksjonering, festing til glassobjekter ifølge Muntiha (2001). Observasjoner avnyrehistopatologi ble utført ved bruk av et binokulært lysmikroskop med mikroskopforstørrelse 100x fulgt opp til 400x. Observasjonen ble gjort på renal glomerulus og renal tubuli.

2.3. Analyse av iNOS (Nitric Oxide Synthase) uttrykk på lever

iNOS (Nitrogenoksidsyntase)ekspresjon på leveren ble analysert med immunhistokjemimetoder, ved bruk av anti iNOS (Nitrogenoksidsyntase) som primært antistoff og anti-kanin IgG biotin-merket som sekundært antistoff. Målingen av iNOS (Nitrogenoksidsyntase)ekspresjon på leveren ble utført ved bruk av programvaren Immunoratio. Resultatene av iNOS-ekspresjonsprosentområdet ble analysert kvantitativt ved å bruke enveis variansanalyse (ANOVA)-testen og fulgt med Tukey-testen.

3. Resultater og diskusjoner

3.1. Analyse av iNOS (Nitric Oxide Synthase) uttrykk på leveren

For å analysere uttrykket til iNOS (Nitrogenoksidsyntase)på leverceller ble gjort ved hjelp av immunhistokjemimetoden. Uttrykket til iNOS (Nitrogenoksidsyntase)kan vises som et brunfargeuttrykk på hepatocyttene, som kan sees i figur 1.

Figur 1. iNOS (Nitrogenoksidsyntase)uttrykk på leveren.

(1) Negativ kontrollgruppe (K-). (2)P1(Indusert med diazinon 20 mg/kg kroppsvekt. (3) P2 (indusert med diazinon 40 mg/kg kroppsvekt).

(4) P3 (indusert med diazinon 60 mg/kg kroppsvekt. Den hvite sirkelen viser arealet til iNOS (Nitrogenoksidsyntase)uttrykk.

Immunhistokjemiresultatet ble analysert kvalitativt og viste at det er en økning av brunfargeintensiteten (Figur 1). Dette resultatet indikerer at det er en økning i iNOS (Nitrogenoksidsyntase)ekspresjonsnivåer i behandlingsgruppen sammenlignet med kontrollgruppen.

For å måle nivået på iNOS (Nitrogenoksidsyntase)uttrykk på hepatocytter brukt programvare immunreaksjon. Resultatene av kvantitativ analyse av iNOS (Nitrogenoksidsyntase)uttrykk i leveren til rotter kan sees i tabell 1 og det kan konkluderes med at det er en signifikant forskjell (p<0.001) between="" the="" treatment="" groups="" compared="" to="" the="" negative="" control="" group="" (k-).="" in="" the="" negative="" control="" group="" that="" was="" the="" group="" without="" diazinon="" organophosphate="" induction,="" the="" average="" percentage="" area="" of=""> (Nitrogenoksidsyntase)Sexpresjon var 1,340 ±0,092 prosent. I behandlingsgruppe 1(P1) var det gruppen indusert av diazinonorganofosfat ved en dose på 20 mg/kg kroppsvekt, gjennomsnittlig prosentvis areal av iNOS (Nitrogenoksidsyntase)uttrykket var 4,184±1,041 prosent. Behandlingsgruppe 2(P2) var en gruppe indusert av diazinonorganofosfat ved en dose på 40 mg/kg kroppsvekt og gjennomsnittet av iNOS (Nitrogenoksidsyntase)uttrykket var 7,496±0,997 prosent . Behandlingsgruppe 3(P3) var en gruppe indusert av diazinonorganofosfat ved en dose på 60 mg/kg kroppsvekt og gjennomsnittet av iNOS (Nitrogenoksidsyntase)uttrykket var 11,604 ± 0.864.

På negativ kontrollgruppe viste iNOS (Nitrogenoksidsyntase)uttrykk i lav intensitet (1,340 ± 0,092 prosent ). McNaughton et al.(2002) fant at iNOS (Nitrogenoksidsyntase)ble uttrykt i normal leveracini. Spredningen av iNOS (Nitrogenoksidsyntase)i normal lever viser området rundt portalen med det sterkeste uttrykket og intensiteten avtar langs leveren acini. I følge Kubes (2000), iNOS (Nitrogenoksidsyntase)kan gi terapeutiske effekter hvis det reguleres i riktig mengde og plassering, iNOS har en positiv rolle inkludert helbredelse av huden og tarmslimhinnen, bekjempelse av visse bakterier, potensial i reguleringen av T-celleproliferasjon og differensiering, og regulerer rekruttering av leukocytter .

Behandlingsgruppen viste en betydelig økning i prosentandelen av iNOS (Nitrogenoksidsyntase) (p<0,001). diazinon="" such="" as="" organophosphate="" in="" general="" will="" be="" metabolized="" which="" mainly="" takes="" place="" in="" the="" liver.="" the="" metabolism="" that="" occurs="" in="" phase="" 1="" metabolism="" is="" an="" oxidation="" process,="" where="" organophosphate="" will="" be="" broken="" down="" into="" oxon-organophosphate="" metabolites="" and="" free="" sulfur="" ions="" with="" the="" help="" of="" cytochrome="" enzymes(cyp)(gupta,="" 2009).="" metabolites="" from="" phase="" 1="" metabolism="" are="" free="" radicals,="" unstable="" substances="" that="" have="" no="" electron="" pairs.="" free="" radicals="" will="" produce="" reactive="" oxygen="" species="" (ros)such="" as="" superoxide,="" hydroxyl="" radicals,="" and="" hydrogen="" peroxide="" through="" interactions="" with="" other="" molecules.="" free="" radicals="" react="" with="" phospholipids="" from="" the="" plasma="" membrane,="" endoplasmic="" reticulum="" membrane,="" or="" mitochondrial="" membrane="" and="" cause="" cell="" death="" (gupta,="" 2012).="" organophosphate="" pesticides="" can="" also="" cause="" oxidative="" stress(mishra,="" 2013).="" this="" oxidative="" stress="" condition="" is="" caused="" by="" diethyl="" as="" an="" organophosphate="" free="" radical(diazinon)that="" is="" capable="" to="" produce="" large="" amounts="" of="" ros.="" oxidative="" stress="" is="" an="" impaired="" balance="" between="" prooxidants="" and="" antioxidants="" that="" causes="" potential="" damage="" (uchendu="" et="" al.,="">

Den økende ROS vil utløse produksjonen av proinflammatoriske cytokiner. Reaktive oksygenarter påvirker transkripsjonen av proinflammatoriske cytokiner der høye nivåer av ROS vil bli fulgt av høye nivåer av proinflammatoriske cytokiner, på samme måte vil hvis ROS-produksjonen hemmes med inhibitorer også påvirke reduksjonen i produksjonen av proinflammatoriske cytokiner som IL{{0 }} og TNF (Naik og Vishva, 2012). Dunlop et al.(2014) og Pahan et al.(2000) uttalte at TNF- og IL-1 spiller en rolle i å øke uttrykket av iNOS (Nitrogenoksidsyntase)i vev gjennom aktivering av Nappar Kappa B(NF-kB) der NF-kB kommer inn i kjernen og binder seg til promotorregionen til iNOS (Nitrogenoksidsyntase). Økt produksjon av proinflammatoriske cytokiner vil indusere iNOS (Nitrogenoksidsyntase)og danner for store mengder avNitrogenoksid(NO) (Aktan, 2004).

3.2.Analyse av nyrehistopatologi

Resultatene av denne forskningen på effekten av diazinon-toksisitet pånyrehistopatologiske trekk ved bruk av Hematoxylin-Eosin (HE)-farging er presentert i figur 2. Histologisk bilde av rottens nyrebark i den negative kontrollgruppen (K-)-gruppen ble vist en normal tilstand og det ble ikke funnet noen abnormitet. Dette bevises ved utseendet til nyrekorpus, de proksimale og distale konvulsive tubuli med et lag av kubiske epitelceller (Figur 2(1)).

Det histopatologiske bildet av nyrebarken til rotter i P1-gruppen viste abnormiteter, som er preget av tilstedeværelsen av celler som gjennomgår karyolyse og hypertrofi. Karyolysecellene ble karakterisert ved at cellekjernen forsvant, mens epitelceller som gjennomgår hypertrofi har kjennetegn ved forstørret cellestørrelse slik at strukturen til nyretubuli virker uregelmessig. Erytrocytter i det intertubulære rommet kan sees på dette bildet som indikerer tilstedeværelse av blødning (Figur 2(2). Det histopatologiske bildet i gruppe P2 viser abnormitetene som ligner gruppe P1. Abnormiteter som kan observeres i nyrebarken av P2-rotter inkluderer utseendet til celler som gjennomgår karyolyse, cellehypertrofi og blødninger. I tillegg er strukturen tilnyretubuli virker uregelmessige, sammenlignet med K-gruppen (Figur 2(3)). Histopatologisk bilde av nyrebarken til rotter i P3-gruppen viste abnormiteter som sett i det histopatologiske bildet av nyrebarken hos Pl- og P2-rotter, karakterisert ved utseendet av cellehypertrofi, karyolyse og erytrocytter i det inter-tubulære rommet (blødning ). Det kan også observeres tilstedeværelsen av inflammatorisk celleinfiltrasjon i vev (figur 2(4)).

Diazinon organofosfat som ble gitt til rottene oralt, vil bli fordøyd av fordøyelseskanalen som deretter vil bli absorbert av tarmen, spesielt av tolvfingertarmen. Organofosfatmetabolismen foregår hovedsakelig i leveren, men i mindre grad skjer metabolismen også i håndflaten og tarmen. Organofosfat vil gjennomgå fase 1 metabolisme som er en oksidasjonsprosess hvor organofosfat vil brytes ned til okson-organofosfatmetabolitter og frie svovelioner ved hjelp av cytokrom (CYP) enzymer (Gupta, 2009; Elersek og Metka 2011). Okson-organofosfatmetabolitten kommer deretter inn i blodet og går til leveren for videre metabolisme. I leveren vil okson-organofosfatmetabolitter hydrolyseres ved hjelp av enzymene karboksylesterase(CE) og paraoksonase (PON), spaltes til dialkylfosfat og forlate gruppen. Dialkylfosfatase vil da bli katalysert av enzymer i fase 2 metabolisme som vil produsere molekyler som er hydrofile og kan skilles ut i urinen mens de etterlater grupper (i form av dietyl) som kan indusere oksidativt stress i kroppen. Dietyl er et svært reaktivt molekyl og kan reagere med hydroksylradikalgrupper (-OH) for å danne nye frie radikaler (Elersek og Metka, 2011). Det høye antallet frie radikaler i kroppen kan ikke nøytraliseres av endogene antioksidanter, noe som resulterer i en ubalanse mellom frie radikaler og antioksidanter som forårsaker oksidativ skade (Caramori og Papi, 2004). Denne oksidative skaden oppstår fordi dietyl-hydroksyl som et fritt radikal fra organofosfatet diazinon er i stand til å produsere store mengder ROS (Uchendu et al., 2012). Den økende ROS vil da forårsake oksidative stressforhold og initiere prosessen med lipidperoksidasjon ved å ta hydrogenioner fra polyumettet fettsyre (PUFA) for å danne mer stabile molekyler. Bindingsbrytende prosessen til PUFA kan forårsake celle- eller vevsnekrose (Sharma et al., 2003).

Unormalitetene oppsto inyrerørformet epitel på grunn av den direkte kontakten av epitel med det giftige stoffet av diazinon, og inyretubuli, er det en prosess med reabsorpsjon og forsterkning i prosessen med urindannelse (Mescher, 2010). Det giftige stoffet av diazinon som fortsatt er i blodårene vil være i direkte kontakt med endotelet, og dermed forårsake forstyrrelse av den vaskulære membranpermeabiliteten. Blødning i inter-tubulært rom ble forårsaket av forstyrrelse av blodårenes membranpermeabilitet (peritubulære kapillærer) slik at erytrocytter kan komme inn i vevet (Djumadi et al., 2008). Skader på endotelceller setter i gang betennelsesreaksjoner, noe som resulterer i akkumulering av makrofager og blodplater utenfor og inne i arteriene. Utseendet til inflammatorisk celleinfiltrasjon i skadet vev indikerer at metabolitter fra diazinon forårsaker toksisitet tilnyre(Khudair et al., 2017).

Basert på resultatene av det histopatologiske utseendet, opplevde nyrebarken i behandlingsgruppen abnormiteter sammenlignet med K-gruppen. P1-gruppen med den laveste dosen på 20 mg/Kg kroppsvekt var kjent for å ha vist skaden pånyrerørformede celler sammenlignet med K-gruppen.

Cistanche forbedre nyrefunksjonen

4. Konklusjon

Administrering av diazinon med den laveste dosen på 20 mg/kg kroppsvekt ble vist å ha en toksisk effekt på rotter som indikert av en signifikant økning i iNOS (Nitrogenoksidsyntase)uttrykk (s<0.001)and showed="" the="" damage="" of="" the="" renal="" cortex="" in="" the="" form="" of="" renal="" tubular="" cell="" necrosis,="" hemorrhage,="" and="" renal="" tubular="" cell="">

5. Referanser

[1] Aktan, F 2004 iNOS (Nitrogenoksidsyntase)-Mediert nitrogenoksidproduksjon og dens regulering. Life Sciences,75:639-653.

[2] Ameriana, M. 2006. Perilaku Petani Sayuran dalam Menggunakan Pestisida Kimia.J. Hort.18(1):95-106,2008.

[3] Arthur,CGog EHJohn.1997.Fisiologi Kedokteran.EGC.Edisi9.1997.

[4] Aulanni'am, A. Rosdiana og NL Rahmah.2012. The Potency of Sargassum duplicated Bory Extracts on Inflammatory Bowel Extract Disease Disease Therapy in Rattus norvegicus.Journal of Life Sciences 6:144-154.

[5] Caramori, G.and A. Papi.2004.Antioxidants in Organophosphorus Compounds Poisoning. IntJ Pharm Bio Sci,59 (2): 170-173.

[6] Cox, C.2000.Diazinon: Toxicology.Journal of Pesticide Reform/ Summer 20(2).

[7] Curthoys, NPand WM Orson.2014. Proksimal tubulusfunksjon og respons på acidose. American Society of Nephrology. Clinical Journal of the American Society of Nephrology 9:1627-1638

[8] Djumadi, H., og H. Sugiyono.2008. Pengaruh Pemberian Insektisida Diazinon dan Kurkumin Kunyit(Curcuma domestica) Per-Oral terhadap Perubahan Struktur Histologis Duodenum Mencit (Mus musculus).Jurnal Penelitian Sains & Teknologi,Vol.9(1):62-83.

[9] Dunlop, K., G.Kiranjot, K. Crystal, I.Julijana, D.Rupinder, D.Jean-Francois, ACKim, J. Amish, PJ McNamara og PJ Robert. 2014. Terapeutisk hyperkapni forhindrer inhalert nitrogenoksid-indusert høyre-ventrikulær systolisk dysfunksjon hos juvenile rotter. Elsevier Inc. Free Radical Biology and Medicine 9: 35-49.

[10] Elersek,T.and F.Metka.2011.Pesticides: The Impacts of Pesticides Exposure.InTech Europe. Rijeka.

[11] Frazier, SK, CSJohn, CHGordon, B.Graham, B.Roger, N.Shinji, N.Akiyoshi, D.Beate og B. Axel.2012. Proliferative og ikke-proliferative lesjoner i rotte- og museurinsystemet. Toxicologic Pathology, 40:14S-86S

[12] Georgievskii, V.1.,BNAnnenkov og VTSamokhin.2013.Material Nutrition of Animals: Studies in the Agricultural and Food Sciences. Butterworths & Co.(Publishers)Ltd.London. 160-161.

[13] Gupta, RC2012.Veterinary Toxicology Second Edition.Elsevier inc. Waltham.USA.

[14]Hubrecht, R., og J. Kirkwood. 2010. The UFAW: Handbook of The Care and Management of Laboratory and Other Research Animals. Universitetsforbundet for dyrevelferd. Storbritannia.

[15]Khudair, ZW, ASHanan og KE Manal.2017. Histopatologiske endringer som induserte i de indre organene til hvit rotte etter eksponering for Diazinon.Bas..Vet.Res. 1(2)

[16] Kubes, P.2000.Inducible Nitric Oxide Synthase: A Little Bit of Good in All of Us. http://dx.doi.org/10.1136/gut.47.1.6 [24. juli 2019].

[17] McNaughton, L., P.Lakshmi, AMMaria, K. Norm, M. Irvin, M. Redwan, H. Outayba og WR Marek.2002. Fordeling av nitrogenoksidsyntase i normal og cirrhotisk menneskelig lever. Proceedings of the National Academy of Science Vol.99, nr.26 17161-17166.

[18] Mescher, AL2010.Junqueira's Basic Histology: Text &Atlas 12 Edition.The McGraw-Hill Companies, Inc.Amerikas forente stater.

[19] Mishra, BP 2013. Antioxidant Status and Oxidative Stress in Organophosphate Pesticide Poisoning.IOSR.Journal of Dental and Medical Sciences (IOSR-JDMS)e-ISSN:2279-0853, p-ISSN:2279-0861 .Volum 7, utgave 6 (mai–juni 2013), PP 20-24