HPLC for samtidig bestemmelse av fire fenyletanolglykosidkomponenter i Cistanche Herba-avkoksstykker og Cistanche Tubulosa-ekstrakter

Sammendrag: Målet med denne studien er å etablere enhøyytelses væskekromatografi (HPLC)metode for samtidig bestemmelse av fire fenyletanolglykosider iCistanches Herba avkoksstykkerogCistanche tubulosa-ekstrakter. De kromatografiske forholdene brukte en Inertsil ODS{{0}}-kolonne (250 mm × 4,6 mm, 5 µm), med en mobil fase bestående av acetonitril - 0,1 % maursyre løsning ved bruk av gradienteluering. Strømningshastigheten ble satt til 1.0 mL/min, kolonnetemperaturen ble holdt på 30 grader, og deteksjonsbølgelengden var 330 nm med et injeksjonsvolum på 1{ {27}} µL. Lineariteten til toppområdet med konsentrasjoner varierte fra 2,53 til 201,60 µg/mL for forskjellige glykosider, med korrelasjonskoeffisienter (r) større enn 0,9993. Grensene for deteksjon (LOD) og kvantifisering (LOQ) var henholdsvis mellom 0,2249 til 1,1004 µg/mL og 0,3101 til 0,8161 µg/mL. Metoden viste god presisjon, stabilitet og repeterbarhet med RSD-verdier mindre enn 3,0 %. Gjennomsnittlig utvinningsgrad varierte fra 97,70 % til 100,95 %, noe som indikerer metodens nøyaktighet og effektivitet for samtidig kvantifisering av disse komponentene i prøvene.

Nøkkelord:Høyytelses væskekromatografi,Cistanches Herba, avkoksstykker,Cistanche tubulosa-ekstrakter, fenyletanolglykosider, innholdsbestemmelse.

HETIAN DICHENMICROBIAL LIMIT ROM

Cistanche, også kjent som Rou Cong Rong og Desert Ginseng, tilhører familien Orobanchaceae og brukes i tradisjonell medisin for sine kjøttfulle stilker dekket med skjell. Den parasitterer røttene til Chenopodiaceae-planter som Haloxylon og Tamarix, og finnes først og fremst i tørre områder i Indre Mongolia, Qinghai, Xinjiang og Ningxia i Kina. Den ble først oppført i den klassiske urteteksten "Shennong Bencao Jing" som en førsteklasses urt. Cistanche smaker søtt og salt, er varm i naturen og er assosiert med nyre- og tykktarmens meridianer. Det er kjent for sine fordeler i å styrke nyrene og yang, fukte tarmene og lindre forstoppelse, beskytte leveren, anti-aldring, bekjempe tretthet og forbedre immuniteten. Klinisk brukes det ofte til å behandle tilstander som nyre-yang-mangel, blodmangel-forstoppelse, infertilitet hos kvinner, svake knær og rygg og hukommelsessvikt. Cistanche er æret som "ørkenens ginseng" og en "dyrbar medisin."

Planten inneholder fenyletanolglykosider, iridoidterpener, alkaloider, lignaner og andre komponenter, med echinacoside og acteosid som representative fenyletanolglykosider kjent for sine effekter for å forbedre yang, antialdring, antioksidantegenskaper og minneforbedring. Disse komponentene er det primære grunnlaget for de medisinske effektene av Cistanche og er også nøkkelindikatorer for kvalitetsevaluering og kontroll i 2020-utgaven av Chinese Pharmacopoeia.

Det har vært rapporter om bestemmelse av fenyletanolglykosidinnhold i Cistanche-arter ved bruk av høyytelses væskekromatografi (HPLC), men disse har vært begrenset til rå Cistanche-materialer og skiver. Foreløpig er det ingen nasjonale standarder for Cistanche tubulosa-ekstrakt, og innholdsbestemmelsen er ikke rapportert. Vår foreløpige forskning fant at Cistanche tubulosa fra Xinjiang hovedsakelig inneholder fire representative fenyletanolglykosider: echinacosid, isoacteosid, acteosid og tubulosid A. Denne studien etablerte en HPLC-metode for samtidig bestemmelse av disse fire komponentene i både Cistanche-avkoksstykker og Cistanche tubulosa-ekstrakter, som tar sikte på å bedre evaluere kvaliteten på Cistanche-avkoksstykkene og bidra til å etablere kvalitetsstandarder for ekstraktene. Rapporten er som følger.

1 Instrumenter og reagenser

1.1 Instrumenter

• LC-20AT høyytelses væskekromatograf, inkludert en diode array-detektor (Shimadzu, Japan)

• AB135-S elektronisk balanse (Mettler Toledo, Sveits)

• KQ-500DE ultralydsrenser (Kunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd.)

• Aike ultrarent vannsystem (Chengdu Tangshi Corning Science and Technology Development Co., Ltd.)

1.2 Reagenser

• Standardstoffer av Pinoresinol diglucosid (batchnummer S-003-01904003), Isomucronulatol 7-O-glukosid (batchnummer Y-073-11803024), Mucronulatol 7-O-glukosid (batchnummer M{ {6}}), og Tubuloside A (batchnummer G-066-11812016), alle kjøpt fra Beijing Inlay Technology Development Co., Ltd., med en renhet på over 98 %.

• Acetonitril og metanol av kromatografisk kvalitet, maursyre av analytisk kvalitet, vann var ultrarent.

• Fire partier med Cistanches Herba-avkok (kode S1, S2 fra Indre Mongolia; kode S3, S4 fra Xinjiang) ble alle kjøpt fra fire apotek i Urumqi.

• Cistanche tubulosa-ekstrakter (kode S5, enzym-inaktivert tørr skive vannekstraksjon; kode S6, enzym-inaktivert tørr skive alkoholekstraksjon; kode S7, enzym-inaktivert tørr skive alkohol harpiksbundet ekstraksjon) ble alle kjøpt fra Xinjiang Hetian Dichen Pharmaceutical Biotechnology Co. ., Ltd.

2 Metoder og resultater

2.1 Kromatografiske forhold

• Kromatografisk kolonne: Inertsil ODS-3 kolonne (250 mm × 4,6 mm, 5 µm)

• Mobil fase: Acetonitril (A) - 0,1 % maursyre vandig løsning (B) med gradienteluering (fra 17 % A til 20 % A over 0-12 min, 20 % A til 22 % A over 12-30 min, 22 % A til 17 % A over 30-35 min)

• Strømningshastighet: 1.0 mL/min

• Deteksjonsbølgelengde: 330 nm

• Kolonnetemperatur: 30 grader

• Injeksjonsvolum: 10 µL

  

Hetia Dichen Fysisk-kjemiske laboratorium

2.2 Klargjøring av løsning

• Blandet standardløsning: Vei hver av de fire standardene nøyaktig og overfør til separate 10 mL målekolber, fyll opp til volum med 50 % metanol for å oppnå enkelt standardløsninger med konsentrasjoner på 1,008, 1,011, 1,012 og 1,012 mg/L for henholdsvis Pinoresinoldiglukosid, Tubulosid A, Mucronulatol 7-O-glukosid og Isomucronulatol 7-O-glukosid. Mål en passende mengde av hver, kombiner i en 10 mL målekolbe, bring til volum med 50 % metanol, bland godt for å tilberede en blandet standardløsning med konsentrasjoner på henholdsvis 201,60, 50,55, 101,20 og 50,60 µg/mL, og filtrer gjennom et 0,45 µm membranfilter.

• Prøveløsning: Omtrent 1,0 g Cistanches Herba avkokspulver (ført gjennom en sikt nr. 4) veies nøyaktig og overføres til en 1{{10}}0 ml ravfarget målekolbe . Tilsett nøyaktig 50 mL 50 % metanol, vei, ekstraher ultralyd i 40 minutter med en effekt på 250 W og frekvens på 35 kHz, avkjøl, vei på nytt og fyll opp den tapte massen med 50 % metanol. Bland godt, filtrer og samle filtratet. Pass gjennom et 0,45 µm membranfilter for å oppnå Cistanches Herba prøveløsning. På samme måte forbereder du Cistanche tubulosa-ekstraktprøveløsningen ved å bruke omtrent 0,2 g av ekstraktpulveret.

1. Echinacosid 2. Tubulosid A 3. Acteosid 4. Isoacteosid A. Blandet referanseløsning B. Testløsning av Cistanches Herba-avkoksbiter C. Testløsning av Cistanche Tubulosa-ekstrakt

2.3 Metodisk undersøkelse

Systemegnethetstest: Passende volumer av tre løsninger fra seksjon 2.2 ble tatt prøver under de kromatografiske forholdene skissert i seksjon 2.1, og kromatogrammer ble registrert. Resultatene indikerte at det teoretiske platenummeret for echinacoside-toppen ikke burde være mindre enn 3000, med separasjonsgrader større enn 1,5, noe som indikerer god grunnlinjeseparasjon. Se figur 1 for detaljer.

Linearitetsevaluering: Nøyaktige volumer av den blandede referanseløsningen fra avsnitt 2.2 (0.5, 1.0, 2.5, 5.0 og 10,0 mL ) ble overført til 10 ml målekolber, brakt til volum med 50 % metanol, blandet godt og brukt til å lage en serie med blandede referanseløsninger. Nøyaktig 10 µL av disse løsningene ble injisert under de kromatografiske forholdene i avsnitt 2.1. Topparealer ble registrert, og lineær regresjon ble utført ved å bruke konsentrasjonene av komponentene (X, µg/ml) som uavhengig variabel og topparealer (Y) som avhengig variabel. Regresjonsligningene og linearitetsområdet finner du i tabell 1.

Deteksjons- og kvantifiseringsgrenser: Nøyaktige volumer av den blandede referanseløsningen fra avsnitt 2.2 ble tatt, fortynnet tilsvarende og analysert under de kromatografiske forholdene i avsnitt 2.1. Konsentrasjoner tilsvarende signal-til-støy-forhold på 3:1 og 10:1 ble brukt som henholdsvis deteksjons- og kvantifiseringsgrenser. Resultatene er presentert i tabell 1.

Presisjonstest: Et passende volum av den blandede referanseløsningen fra avsnitt 2.2 ble analysert seks påfølgende ganger under de kromatografiske forholdene i avsnitt 2.1. RSD-verdiene for toppområdene for echinacosid, tubulosid A, acteosid og isoacteosid var henholdsvis 1,31 %, 0,91 %, 1,58 % og 0,58 % (n {{12} }), som indikerer god presisjon av instrumentet.

Stabilitetstest: Testprøveløsninger ble tilberedt og stående i romtemperatur i 0, 2, 4, 6, 8, 12 og 24 timer før de ble analysert under betingelsene i avsnitt 2.1. RSD-verdiene for toppområdene for echinacosid, tubulosid A, acteosid og isoacteosid var henholdsvis 1,84 %, 2,18 %, 1,05 % og 1,55 % (n=7), noe som indikerer at testløsningene var stabile i rommet temperatur i opptil 24 timer.

Repeterbarhetstest: En prøve (ID: S2) ble nøyaktig veid og delt i seks porsjoner. Hver porsjon ble fremstilt som en testprøveløsning i henhold til metoden i avsnitt 2.2 og analysert under de kromatografiske forholdene i avsnitt 2.1. Gjennomsnittlig innhold av echinacosid, tubulosid A, acteosid og isoacteosid var henholdsvis 0,779 %, 0.020 %, 0,155 % og 0,074 % , med RSD-verdier på 1,21 %, 3,12 %, 2,65 % og 2,96 % (n=6), noe som viser god repeterbarhet for metoden.

Gjenvinningstest: En kjent mengde prøve (ID: S2) ble tatt og delt i ni porsjoner. Hver porsjon ble tilsatt lave, middels eller høye konsentrasjoner av de individuelle referanseløsningene, fremstilt i henhold til metoden i avsnitt 2.2, og analysert under de kromatografiske forholdene i avsnitt 2.1. Toppområder ble registrert, og utvinningsgrad ble beregnet. Resultatene er vist i tabell 2.

Hetian DiChen HPLC Laboratory

2.4 Eksempel på innholdsbestemmelse

Passende volumer av hvert parti med prøver ble fremstilt som testløsninger i henhold til metoden i avsnitt 2.2, deretter analysert under de kromatografiske forholdene i avsnitt 2.1. Hver prøve ble testet i tre eksemplarer, topparealer ble registrert, og innholdet i prøvene ble beregnet. Resultatene er vist i tabell 3.

3 Diskusjon

I denne studien ble en diodearraydetektor brukt, og skanninger av de blandede referanseløsningene og testprøveløsningene ble utført innenfor bølgelengdeområdet 200 til 450 nm. Resultatene viste at echinacosid og acteosid viste maksimal absorpsjon ved 330 nm, tubulosid A ved 331 nm og isoacteosid ved 327 nm. I tillegg, med henvisning til 2020-utgaven av Chinese Pharmacopoeia, som spesifiserer en deteksjonsbølgelengde på 330 nm for echinacosid og acteosid, ble det observert at mange komponenter hadde betydelige kromatografiske topper og høye responsverdier ved 330 nm, noe som førte til valget av 330 nm den endelige målingens bølgelengde.

Fra resultatene av innholdsbestemmelsen av Cistanches Herba avkoksstykker, ble det funnet at echinacosid hadde det høyeste innholdet i både Cistanche tubulosa og ørken Cistanche, etterfulgt av akteosid, mens tubulosid A og isoacteosid hadde relativt lavere innhold. Det var en betydelig variasjon i innholdet av de fire fenyletanolglykosidkomponentene, og denne variasjonen var også uttalt mellom ulike batcher fra samme lokasjon eller ulike lokasjoner. Denne variasjonen kan tilskrives faktorer som det geografiske miljøet, temperaturen, klimaet og høstingsprosessene til råvarene, som påvirker akkumuleringen av kjemiske bestanddeler i plantene. Mens de kjemiske komponentene til Cistanche hentet fra forskjellige opprinnelser er like, varierer konsentrasjonene av disse komponentene, noe som fører til forskjeller i effektene deres. Derfor er det hensiktsmessig å velge råvarer basert på deres effektivitet for å oppnå bedre kliniske resultater.

Oppsummert er metoden etablert i denne studien enkel, rask, nøyaktig og effektiv. Den kan brukes til å bestemme fire fenyletanolglykosidkomponenter i Cistanches Herba-avkoksstykker og Cistanche tubulosa-ekstrakter samtidig. Resultatene av innholdsbestemmelsen kan gjenspeile kvalitetsnivåene til forskjellige partier og forskjellige utdrag fra samme eller forskjellige lokasjoner, og gir et teoretisk grunnlag for å etablere relevante kvalitetsstandarder.

Tab. 2 resultater av gjenopprettingstesten (n=9)

Tab. 3 Resultater av innholdsbestemmelse av fire fenyletanoidglykosider i prøvene (%,n=3)

Cistanche-fordeler

Referanser:

1. 中文 (kinesisk): 国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)［M］．北京:瑭升:{0,2,2 {1}}.
   英文 (engelsk): National Pharmacopoeia Commission. Farmakopéen til Folkerepublikken Kina (Vol. 1) [M]. Beijing: China Medical Science and Technology Press, 2020: 140-141.

2. 中文 (kinesisk): 朱乃亮,徐荣,吴海峰,等. 荒漠肉苁蓉和管花肉苁蓉指纹图谱比较研究［J］. 中国药学杂志,2016,51(13):1116-1119.
   英文 (engelsk): Zhu Nailiang, Xu Rong, Wu Haifeng, et al. Sammenlignende studie på fingeravtrykk av Cistanche deserticola og Cistanche tubulosa [J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2016, 51(13): 1116-1119.

3. 中文 (kinesisk): 闫暾,齐海平,李旻辉,等. 肉苁蓉和管花肉苁蓉的对比［J］. 包头医学院学报,2019,35(1):120-121.
   英文 (engelsk): Yan Tun, Qi Haiping, Li Minhui, et al. Sammenligning av Cistanche deserticola og Cistanche tubulosa [J]. Journal of Baotou Medical College, 2019, 35(1): 120-121.

4. 中文 (kinesisk): 吴波,顾少菊,傅玉梅,等. 肉苁蓉和管花肉苁蓉通便与补肾壮阳药理作用的研究［J］. 中医药学刊,2003,21(4):539-548.
   英文 (engelsk): Wu Bo, Gu Shaoju, Fu Yumei, et al. Studie på avføringsmiddel og tonifiserende nyre-yang-effekter av Cistanche deserticola og Cistanche tubulosa [J]. Journal of Chinese Medicine and Pharmacy, 2003, 21(4): 539-548.

5. 中文 (kinesisk): 范亚楠,黄玉秋,贾日柱,等. 肉苁蓉炮制前后对衰老模型大鼠抗衰老及免疫功能的影响［J］. 中华中医药学刊,2017,35(11):2882-2885.
   英文 (engelsk): Fan Yanan, Huang Yuqiu, Jia Tianzhu, et al. Effekter av Cistanche deserticola før og etter prosessering på anti-aldring og immunfunksjon hos aldrende modellrotter [J]. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy, 2017, 35(11): 2882-2885.

6. 中文 (kinesisk): 吴波,付玉梅. 肉苁蓉总苷对亚急性衰老小鼠抗脂质过氧化作用的研究［J］. 中国药理学通报,2005,21(5):639.
   英文 (engelsk): Wu Bo, Fu Yumei. Studie på antilipidperoksidasjonseffekten av Cistanche-glykosider på subakutt aldrende mus [J]. Chinese Pharmacological Bulletin, 2005, 21(5): 639.

7. 中文 (kinesisk): 胡余明,胡怡秀,刘秀英,等. 苁蓉总苷对正常小鼠学习记忆功能的影响研究［J］. 中国预防医学杂志,2007,8(4):370-373.
   英文 (engelsk): Hu Yuming, Hu Yixiu, Liu Xiuying, et al. Studie på effekten av Cistanche-glykosider på læring og hukommelsesfunksjon hos normale mus [J]. Chinese Journal of Preventive Medicine, 2007, 8(4): 370-373.

8. 中文 (kinesisk): 屠鹏飞,姜勇,郭玉海,等. 发展肉苁蓉生态产业推进西部荒漠地区生态文明［J］. 中国现代中药,2015,17(4):297-301.
   英文 (engelsk): Tu Pengfei, Jiang Yong, Guo Yuhai, et al. Utvikling av Cistanche deserticola økologisk industri for å fremme økologisk sivilisasjon i vestlige ørkenområder [J]. Modern Chinese Medicine, 2015, 17(4): 297-301.

9. 中文 (kinesisk): 覃文婷,宿美凤,雒晓梅,等. 定性分析不同产地荒漠肉苁蓉苯乙醇苷类及多糖类成分［J］. 辽宁中医药大学学报,2018,20(7):77-81.
   英文 (engelsk): Qin Wenting, Su Meifeng, Luo Xiaomei, et al. Kvalitativ analyse av fenyletanoidglykosider og polysakkarider i Cistanche deserticola fra forskjellige opphav [J]. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, 2018, 20(7): 77-81.

10. 中文 (kinesisk): 王力伟,曹瑞,房永雨,等. 超高效液相色谱-串联3重4极杆质谱联用法测定肉苁蓉中有效成分的含量［. 中药材,2017,40(2):295-300.
    英文 (engelsk): Wang Liwei, Cao Rui, Fang Yongyu, et al. Bestemmelse av aktive komponenter i Cistanche deserticola ved ultra ytelse væskekromatografi-tandem trippel kvadrupol massespektrometri [J]. Journal of Chinese Medicinal Materials, 2017, 40(2): 295-300.

11. 中文 (kinesisk): 初侨,席兴军,杨丽. 肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷闪提工艺研究［J］. 食品研究与开发,2015,36(16):49-52.
    英文 (engelsk): Chu Qiao, Xi Xingjun, Yang Li. Studie på flashekstraksjonsteknologi av echinacoside og verbascoside i Cistanche deserticola [J]. Matforskning og utvikling, 2015, 36(16): 49-52.

12. 中文 (kinesisk): 余逸凡. 肉苁蓉属植物化学成分及药理活性研究进展［J］. 化工管理,2019(13):111-112.
    英文 (engelsk): Yu Yifan. Forskningsfremgang på kjemiske bestanddeler og farmakologiske aktiviteter til Cistanche [J]. Chemical Management, 2019(13): 111-112.

13. 中文 (kinesisk): 王小新,骆婷婷. 肉苁蓉对小鼠抗疲劳及记忆力的影响［J］. 内蒙古中医药,2014,33(22):102–103.
    英文 (engelsk): Wang Xiaoxin, Luo Tingting. Effekt av Cistanche deserticola på anti-tretthet og hukommelse hos mus [J]. Inner Mongolia Journal of Traditional Chinese Medicine, 2014, 33(22): 102-103.

14. 中文 (kinesisk): 随家宁,李芳婵,郭勇秀,等. 肉苁蓉化学成分,药理作用研究进展及其质量标志物预测分析［J］. 辽宁中医药大学学报,2021,23(1):191-196.
    英文 (engelsk): Sui Jianing, Li Fangchan, Guo Yongxiu, et al. Forskningsfremgang på kjemiske bestanddeler og farmakologiske effekter av Cistanche deserticola og prediksjonsanalyse av dets kvalitetsmarkører [J]. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, 2021, 23(1): 191-196.

15. 中文 (kinesisk): 刘涛,殷松娜,栾昕. 肉苁蓉对卵巢早衰大鼠免疫因子和凋亡相关蛋白的影响［J］. 中国临床药理学杂志,2019,35(23):3084-3087.
    英文 (engelsk): Liu Tao, Yin Songna, Luan Xin. Effekt av Cistanche deserticola på immunfaktorer og apoptose-relaterte proteiner hos rotter med for tidlig eggstokksvikt [J]. Chinese Journal of Clinical Pharmacology, 20