Human Alpha Defensin 5 uttrykk i den menneskelige nyre og urinveier

For mer informasjon: ali.ma@wecistanche.com

John David Spencer et al

Abstrakt

Bakgrunn:Mekanismene som opprettholder sterilitet i urinveiene er ufullstendig forstått. Nyere studier har implisert viktigheten av antimikrobielle peptider (AMP) for å beskytte urinveiene mot infeksjon. Her karakteriserer vi uttrykket og relevansen til AMP human alfa-defensin 5 (HD5) i mennesketnyreog urinveier hos normale og infiserte personer.

Metodikk/hovedfunn:Bruker RNA isolert fra menneskernyre, urinleder og blærevev, utførte vi kvantitativ sanntids-PCR for å vise at DEFA5, genet som koder for HD5, er konstitutivt uttrykt i hele urinveiene. Med pyelonefritt økte DEFA5-ekspresjonen betydelig inyre. Ved å bruke immunoblotanalyse økte HD5-produksjonen også med pyelonefritt. Immunfarging lokaliserte HD5 til urotelet i blæren og urinlederen. I nyrene ble HD5 primært produsert i det distale nefronet og samlerørene. Ved bruk av immunoblot- og ELISA-analyser ble HD5 ikke rutinemessig påvist i ikke-infiserte humane urinprøver, mens det betyr at urin HD5-produksjonen økte med E.coli urinveisinfeksjon.

Konklusjoner/Betydning:DEFA5 uttrykkes i hele urinveiene hos ikke-infiserte personer. Spesielt uttrykkes HD5 gjennom urotelet i de nedre urinveiene og i samlerørene inyre. Med infeksjon øker HD5-ekspresjonen inyre, og nivåer blir detekterbare i urinen. Så vidt vi vet representerer funnene våre de første som kvantifiserte HD5-uttrykk og produksjon i den menneskelige nyren. Dessuten er dette den første rapporten som oppdager tilstedeværelsen av HD5 i infiserte urinprøver. Våre resultater tyder på at HD5 kan ha en viktig rolle i å opprettholde urinveissterilitet.

Cistanche bivirkninger og Cistanche tubulosa fornyresykdom, klikk her for å få prøven

Introduksjon

Urinveiene, bortsett fra urethral meatus, er vanligvis sterile til tross for nærhet til fekal flora. De nøyaktige mekanismene som gjør at urinveiene opprettholder sin sterilitet er ikke godt forstått. Foreslåtte mekanismer som bidrar til forsvaret av urinveiene inkluderer urinstrøm, endringer i urinens pH og osmolaritet, regelmessig blæretømming, kjemiske forsvarskomponenter i uroepitelet og epitelavgivelse/tilstrømning av effektorimmunceller med bakteriell stimulering [1]. I tillegg har antimikrobielle peptider (AMP) nylig vist seg å ha en viktig rolle i å opprettholde urinveissterilitet [2]. AMP, som fungerer som naturlige antibiotika produsert av nesten alle organismer, er en allestedsnærværende komponent i det medfødte immunsystemet. AMP er kationiske molekyler uttrykt av fagocytiske hvite celler og epitelceller. Hos mennesker og andre pattedyr er defensiner en hovedfamilie av AMP-er. Defensiner har typisk bredspektret antimikrobiell aktivitet mot gram-positive og gram-negative bakterier, virus, sopp og protozoer [2,3]. Defensiner syntetiseres først som preproproteiner og gjennomgår prosessering for å bli modne, biologisk aktive peptider [4]. Hos mennesker er defensiner klassifisert i en av to familier avhengig av deres disulfidbromønster - alfa-defensinene eller beta-defensinene [5].

I urinveiene er beta-defensiner mye uttrykt i hele uroepithelium. Epitelceller langsnyreløkke av Henle, distale tubuli og samlekanal uttrykker konstitutivt humant beta-defensin 1 (hBD1). Selv om urinnivåene av hBD1 er utilstrekkelige til å drepe invaderende bakterier, gir hBD1 et hurtigvirkende antimikrobielt belegg av tubulære lumen og forhindrer infeksjon ved å hemme bakteriell feste til urothelium [6]. Nyere studier indikerer at redokstilstanden til hBD1 signifikant påvirker antimikrobiell styrke, slik at det reduserte peptidet er mye kraftigere enn den disulfidbundne oksiderte formen [7]. Betydningen av dette ved uroteloverflaten er ikke bestemt. Et annet defensin, humant beta-defensin 2 (hBD2), er ikke konstitutivt uttrykt i sunt nyrevev; imidlertid induseres hBD2-ekspresjon av infeksjon [8].

I motsetning til beta-defensinene er rollen til epitelavledede alfa-defensiner ikke godt beskrevet i urinveiene. Ekspresjonen og funksjonen til alfa-defensinene HD5 og HD6 har for det meste blitt rapportert i tynntarmen hvor de skilles ut av Panethcells inn i tarmkryptene og bidrar til balansen av tarmmikrobiota [9]. HD5 har også blitt lokalisert i de mannlige og kvinnelige kjønnsorganene, med bevis som tyder på at det er induserbart og viktig for å utrydde infeksjon [10,11,12]. Urin HD5 har blitt påvist hos pasienter som har gjennomgått ileal neoblærerekonstruksjon og ileal conduit urinavledning hvor kilden til HD5-produksjon først og fremst ble kreditert til ileal Paneth-cellene [13,14]. HD5 har antibakteriell aktivitet mot vanlige uropatogene gram-positive bakterier og gram-negative bakterier [15]. HD5 har også antimikrobiell aktivitet mot uropatogene virus som adenovirus og BK-virus [16,17,18]. I denne studien gir vi den første beskrivelsen og kvantifiseringen av HD5-uttrykk i mennesketnyreog videre definere dets uttrykk i de nedre urinveiene under sterilitet og infeksjon.

Resultater

DEFA5 mRNA uttrykkes konstitutivt i den menneskelige blæren, urinlederen og nyrene

Kvantitativ sanntids-PCR viser at all testet blære, urinleder ognyreprøver uten infeksjon konstitutivt uttrykt DEFA5. DEFA5-ekspresjon var signifikant større i nedre urinveier enn øvre urinveier (p= 0.014). I blæren (n=4) var gjennomsnittlig DEFA5-uttrykk 4,656637 transkripsjoner per 10 ng RNA og i urinlederen (n=4) var gjennomsnittlig DEFA5-uttrykk 4,1126170 transkripsjoner per 10 ngRNA (figur 1A) . I nyren (n=6) var gjennomsnittlig DEFA5-uttrykk 2 9376274 transkripsjoner per 10 ng RNA. DEFA5-ekspresjon ble analysert separat i nyrebarken, medulla og bekken. DEFA5-ekspresjonen varierte ikke signifikant etter nyreregion (p= 0.45).

DEFA5-ekspresjon og HD5-peptidekspresjon øker med pyelonefritt

Kvantitativ sanntids PCR-analyse utført pånyrevev medpyelonefritt viste en signifikant økning i DEFA5-ekspresjon sammenlignet med ikke-infisert nyrevev. Med pyelonefritt (n= 6), økte gjennomsnittlig DEFA5-ekspresjon til 7.82961.052 transkripsjoner per 10 ng RNA (p= 0.019) (Figur 2A).

For ytterligere å evaluere denne økningen i ekspresjon med pyelonefritt, utførte vi immunoblotanalyse på sammenyrevev brukt for sanntids PCR-analyse for å evaluere for samtidige økninger i HD5-peptidproduksjon (Figur 2B, midtpanel). Immunoblotanalyse, ved bruk av polyklonale HD5-antisera, viste signifikant større HD5-peptidproduksjon i nyrevev med pyelonefritt (n {{5} }) sammenlignet med ikke-infisertenyrevev(n=6). Ikke-infisertnyrevev uttrykte 300625 ng HD5/gram våtvevsvekt mensnyrevev med pyelonefritt uttrykt 600621 ng HD5/gram våtvevsvekt (p,0,0001). Blots ble re-probed med GAPDH for å tjene som en belastningskontroll (Figur 2B, midtpanel) og en sølvfarging ble også utført for å bekrefte lik proteinbelastning (Figur 2B, topppanel).

HD5-peptid produseres i hele menneskets nyre og urinveier

Immunfarging ble utført for å lokalisere HD5-produksjon i urinveiene. Immunhistokjemi (IHC) viste at HD5-immunreaktivitet var tilstede i hele urotelet i urinlederen og blæren til alle undersøkte prøver (n=4, figur 3). IHC viste også at HD5 ble produsert i tubuli i nyrebarken og medulla av alle prøver (n= 6, figur 4). Immunfluorescens (IF) viste at HD5-ekspresjon var størst i det distale nefronet og samlerørene (figur 5). Interstitium og glomeruli viste ikke HD5-immunreaktivitet. Immunfargingen vist i figur 3, 4 og 5 ble utført ved å bruke et muse monoklonalt anti-HD5-antistoff (8C8) som gjenkjenner HD5-propeptidet (Abcam, Cambridge, MA). Resultatene var like ved bruk av polyklonalt anti-HD5-antistoff fra kanin som gjenkjenner HD5-propeptidet og det modne peptidet (data ikke vist) – noe som tyder på at HD5 er lagret som et propeptid.

Med pyelonefritt økte HD5-immunfarging markant. HD5-immunreaktivitet økte gjennom det proksimale nefronet, det distale nefronet og samlerørene (figur 4 og figur 5). Som i ikke-infiserte prøver, viste glomeruli og interstitium ingen HD5-ekspresjon med infeksjon. Negative kontroller viste ingen HD5-immunreaktivitet.

Infisert human urin inneholder målbare konsentrasjoner av HD5-peptid

Immunoblotanalyse, ved bruk av polyklonalt kaninantiserum som oppdager forløperen proHD5 og viderebearbeidede former identifiserte målbare nivåer av HD5 i 13 av de 15 testede urinprøvene infisert med uropatogen E.coli (Figur 6A og B). Når tilstede, varierte HD5-nivåer, normalisert til urinkreatinin, fra 299,8–669,7630 ng HD5/mg urin Cr (110,67 ng/mL–276,67 ng/mL), som tilsvarer 11,10–27,67 nmol/L. Inneninfiserte urinprøver (n=15), HD5 var ved eller under deteksjonsgrensen på (,50 ng). Enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) på de samme urinprøvene, ved bruk av det monoklonale museantistoffet (8C8) som bare detekterer forløperen proHD5, påviste målbare nivåer av proHD5 i 13 av de 15 infiserte prøvene som ble testet. UrinproHD5-konsentrasjoner varierte fra 122,78–490,060,03 ng HD5/mg urin Cr (30,02 ng/mL–200,5 ng/mL) når tilstede (Figur 7).

Diskusjon

I denne studien gir vi den første karakteriseringen av HD5 i mennesketnyre, urinleder og blære. HD5 har vist seg å være en viktig AMP som forhindrer invasiv infeksjon i tarmen og er oppregulert i kjønnsorganene under infeksjon[11,18,19,20,21]. Epitelavledede AMP-er, som HD5, har vist seg å være viktige for å opprettholde sterilitet i urinveiene [8,22,23,24]. Mangler i disse medfødte slimhinneforsvarene kan resultere i akutt og/eller kronisk infeksjon [25,26].

Våre kvantitative sanntids PCR-resultater viser at DEFA5 er konstitutivt uttrykt i mennesketnyrer, urinledere og blære. DEFA5-ekspresjonen øker fra de øvre urinveiene til de nedre urinveiene – etter strømmen av urinstrømmen og den økende nærheten til mikrobiotaens invasjonspunkt. Så vidt vi vet, er dette den første studien som kvantifiserer DEFA5-uttrykk i menneskets nyre og blære. Nylig demonstrerte Townes et al at normal distal urinleder kan uttrykke DEFA5 [14]. Resultatene våre tyder også på at DEFA5 er konstitutivt uttrykt av den distale urinlederen. Selv om DEFA5-ekspresjon i urinveiene er nesten 100- ganger lavere enn det som finnes i gastrointestinalt vev, er basal uroepithelial ekspresjon av DEFA5 sammenlignbar med uttrykket av tidligere beskrevne urinsporforsterkere som cathelicidin, hBD-1, hBD -2 og ribonuklease 7[6,8,22,24,27].

I motsetning til den modne mage-tarmkanalen hvor DEFA5 uttrykkes ved høye nivåer i både helsetilstander og infeksjon/betennelse, viser våre kvantitative sanntids PCR-data at DEFA5-uttrykk inyreer betydelig oppregulert med infeksjon [27,28,29]. Dette induserbare uttrykksmønsteret er analogt med DEFA5-ekspresjon i den kvinnelige reproduksjonskanalen hvor DEFA5-ekspresjonen øker med salpingitt [30]. I urinveiene har Townes et al vist en trend mot større ureteral ekspresjon av DEFA5 hos pasienter med UTI som har gjennomgått urinavledning i ilealkanalen [14]

Vår immunoblotanalyse utfyller sanntids PCR-data ved å demonstrere at HD5-peptidproduksjonen øker med pyelonefritt. Dette induserbare mønsteret for HD5-produksjon ligner det som sees hos noen medlemmer av beta-defensin-familien. hBD2 viser et induserbart produksjonsmønster med infeksjon i urinveiene og/eller kronisk pyelonefritt [8,31,32]. HD5-peptidproduksjon har vist seg å øke i øvre kvinnelige kjønnsorganer og mannlig urinrør med betennelse [11,30].

Ved å bruke immunfarging demonstrerer vi at HD5 produseres jevnt gjennom urothelium i urinlederen og blæren. Fordi det store flertallet av UVI er et resultat av fekal flora som stiger opp i blæren, tyder disse resultatene på at HD5-ekspresjon er tilstede på steder der mikrobiell eksponering forekommer hyppigst [33]. Derfor er HD5 ideelt plassert for å forhindre en stigende mikrobiell infeksjon. Inyre, HD5 produseres primært i det distale nefronet og samlerøret. Disse funnene tyder på at HD5 produseres på steder hvor det vil være posisjonert for å ha optimal antimikrobiell aktivitet. Tidligere studier har vist at defensiners antimikrobielle egenskaper er avhengig av saltkonsentrasjon – med høyere saltkonsentrasjoner som reduserer antimikrobiell aktivitet [23,34,35]. Vi spekulerer i at de lave saltkonsentrasjonene til det distale nefronet og samlerørene gir et gunstig miljø for HD5 antimikrobiell aktivitet.

Immunoblot og ELISA-analyse viser også at HD5 skilles ut i urinen ved lave nivåer. Gitt størrelsen (8,1 kDa og 3,7 kDa) og den positive ladningen til proHD5 og fullt behandlet HD5, er det mulig at noe HD5-peptid fra urin stammer, i det minste delvis, fra plasmafiltrat. Likevel er det lite som tyder på at HD5 vedvarer i plasma [27]. I tillegg, for å vises i urinen, må HD5 unnslippe de effektive peptidabsorpsjonsmekanismene i den proksimale tubuli [6,36]. Til slutt gjennomgikk urinprøver som ble brukt sentrifugering før analysene ble utført, og fjernet cellulære kilder til HD5.

Ved de påviste konsentrasjonene er det usannsynlig at urin HD5 er direkte antimikrobiell mot uropatogene mikroorganismer, da fullbearbeidet HD5 har en minimal inhiberende konsentrasjon (MIC) mellom 6–10 mg/ml mot vanlige gramnegative uropatogene bakterier [15]. Imidlertid vil konsentrasjoner av slimhinner sannsynligvis være høyere. Videre viser immunoblotanalyse at HD5-konsentrasjoner er betydelig høyere inyre. Disse resultatene tyder på at HD5 er involvert i slimhinneforsvaret i urinveiene. Et analogt mønster sees med hBD1, hvor urinkonsentrasjoner av hBD1 er utilstrekkelige til å vise antimikrobiell aktivitet, men høyere peptidkonsentrasjoner påvises nær nyretubuli [6,31].

Fordi IHC viser at proHD5 er en hovedform for HD5 inyreog fordi både moden og proHD5 blir oppdaget i urinen, spekulerer vi i at HD5 primært utskilles som et forløpermolekyl og deretter gjennomgår proteolytisk prosessering for å generere modne former – lik gastrointestinale og genitourinære trakter [11,30,37]. I tynntarmen produserer Paneth-celler trypsin, som spalter HD5-propeptidet slik at det ferdigbearbeidede peptidet er den dominerende formen i tarmlumen [37]. I det mannlige urinrøret er nøkkelprosesserings- og aktiveringsenzymene for HD5 nøytrofile proteaser bidratt av nøytrofiler rekruttert til infeksjonsstedet [11]. Bidragene fra epiteltrypsinogen, urintrypsin og/eller nøytrofile proteaser på HD5-prosessering i urinveiene under infeksjon gjenstår å bestemme. Dessuten gjenstår det fortsatt å bestemme effekten av endringer i urinmiljøet på HD5-funksjonen (endringer i osmolaritet, pH og kationiske konsentrasjoner).

Avslutningsvis er dette den første studien som identifiserer og kvantifiserer uttrykket og produksjonen av HD5 i urinveiene. Resultatene våre tyder på at HD5 er en epitelavledet AMP som kan spille en viktig rolle i den medfødte immuniteten til det menneskelige uroepithe lium som forhindrer translokasjon av invaderende patogener inn i sirkulasjonen. Belysning av faktorene som regulerer HD5-produksjon kan gi ny innsikt i patogenesen av UVI hos pasienter med risiko for UVI og pasienter med kroniske infeksjoner.

Metoder

Studiegodkjenning

Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra alle pasienter som deltok i denne studien. For forsøkspersoner under 18 år ble det innhentet skriftlig samtykke fra foreldre/foresatte. NationwideChildren's Hospital (NCH) Institutional Review Board godkjente denne studien sammen med samtykkeprosessen og dokumenter (IRB07-00383).

Menneskelig vev og urinprøver

Ikke-infisert distalt ureter og blærevev (n= 4) ble oppnådd fra barn som gjennomgikk ureteral re-implantasjon av andre grunner enn tilbakevendende infeksjon. Ikke-infisertnyreprøver (n=6) ble hentet fra pasienter som gjennomgikk nefrektomi for nyresvulster. Vevsprøver var fri for makroskopiske tegn på sykdom eller betennelse.Nyrevev fra pasienter med kronisk pyelonefritt ble levert av Cooperative HumanTissue Network (n=6) [38]. To uavhengige patologer bekreftet den histopatologiske diagnosen pyelonefritt. Vevsprøver ble hurtigfrosset eller konservert som nøytrale formalinfikserte parafininnstøpte seksjoner. Deler av ikke-infisert nyrevev ble dissekert i cortex, medulla eller nyrebekken før lagring (n=4).

Ikke-infiserte og infiserte urinprøver ble tatt fra barn som oppsøkte NCH akuttmottak eller nefrologisk klinikk. Diagnosen UVI ble stilt av en positiv urinkultur i henhold til American Academy of Pediatrics Guidelines [39]. Alle infiserte urinprøver hadde 0,106 CFU/mL E.coli. Urin pH-verdier varierte fra 5,5 til 8,5 (gjennomsnittlig urin 6,9). Ionesammensetningen i urinen ble ikke målt. Urinprøver ble sentrifugert for å fjerne urinsediment, og proteasehemmercocktail ble tilsatt (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).

Ribonukleinsyreisolering og omvendt transkripsjon

Totalt RNA ble isolert fra frossent vev ved å bruke PromegaTotal RNA Isolation System (Promega, Madison, WI, USA). ForcDNA-syntese, 4–8 mg totalt RNA ble revers transkribert med Superscript III revers transkriptase ved bruk av en oligo-(dT)12–18primer i henhold til leverandørens protokoll (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).

Kloning av genspesifikke plasmider for standardkurver

cDNA som koder for DEFA5 og GAPDH ble klonet inn i en 4-Topo-plasmidvektor (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Plasmider ble sekvensert for å bekrefte at det var riktig

konstruksjoner ble oppnådd. Seriefortynninger av genspesifikke plasmider ble kvantifisert (ved spektrofotometrisk absorbans ved 260 og etidiumbromid-farget agarosegelelektroforese) og brukt i sanntids PCR for å generere standardkurver for hver reaksjon.

Kvantitativ sanntids PCR

Kvantitativ sanntids-PCR ble utført ved bruk av enkelttrådet cDNA fra menneskernyre, urinleder og blærevev med spesifikke oligonukleotidprimerpar ved bruk av 7500 sanntids PCR-systemet (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). : 59- TCC CTC CTG CAG GTG ACC CCA-39 og DEFA5 revers primer 59-GTG GCT CTT GCC TGA GAA CCT GA-39).

Kort oppsummert, cDNA tilsvarende 10 ng RNA tjente som forbilde i en 25 ml reaksjon inneholdende 2,0 mM av hver primer og 16 Light-Cycler-Fast Start DNA Master SYBR Green mix. PCR-betingelser var: initial denaturering ved 95uC i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser med hver syklus bestående av denaturering ved 94uC i 30 sekunder, annealing ved 64uC i 30 sekunder, og forlengelse ved 72uC i 30 sekunder. Syklus-til-syklus-fluorescensemisjonen ble overvåket ved 530 nm og analysert ved bruk av 7500Software V2.0.3 (Applied Biosystems). Genspesifikke plasmidstandarder ble inkludert i hvert sett med reaksjoner. Som en positiv kontroll ble terminal ileum RNA inkludert i hvert sett av reaksjoner, og resultatene ble sammenlignet med tidligere publiserte standarder [27].

For å bekrefte PCR-amplifisering av det tiltenkte produktet, ble en representativ prøve analysert ved elektroforese på en 1,5 prosent agarosegel. Produktene ble visualisert ved etidiumbromidfarging og sammenlignet med DNA-størrelsesstandarder med bekreftet produktstørrelse (ikke vist). I tillegg ble en smeltetemperaturprofilkurve for hver PCR-reaksjon bestemt ved slutten av hver reaksjon.

HD5 antistoffer

HD5-propeptidet (AA20-94) og delvis prosesserte former (AA36-94 og 56–94) ble identifisert ved å bruke et kommersielt tilgjengelig musemonoklonalt (8C8) anti-HD5-antistoff (Abcam). HD5-propeptidet og det modne peptidet (AA63-94) ble identifisert ved å bruke tidligere beskrevet polyklonalt kaninantiserum[13,40].

Immunoblot

Deler av det sammenyrePrøver brukt til kvantitativ sanntids-PCR-analyse (3–6 mg våtvekt) ble pulverisert ved hjelp av en morter og støder i flytende nitrogen og oppløst i RIPA-buffer med proteasehemmere. Urinproteiner ble ekstrahert fra urinprøver ved å bruke ProteospinTM Urine Protein Concentration Micro Kit (Norgen Biotek Corporation, Thorold, ON, Canada). Nyre- og urinproteinkonsentrasjoner ble kvantifisert ved bruk av en modifisert Bradford-analyse og bekreftet ved bruk av en anOD280 nm-avlesning. Like konsentrasjoner av nyrevev eller urinprotein ble lastet på 18 prosent natriumdodecylsulfatgradientgeler og utsatt for elektroforese. For å sikre lik proteinbelastning ble det utført en sølvfarging.

Etter elektroforetisk separasjon ble proteiner overført til en nitrocellulosemembran. Etter fiksering med 0.05 prosent glutaraldehyd i TBS, ble membranene blokkert i 5 prosent fettfri melk i 30 til 60 minutter og inkubert i en 1:1,000 fortynning av polyklonalt HD5-antiserum fra kanin over natten . Etter vasking ble det sekundære antistoffet, en anti-kanin pepperrot peroxidase-konjugert anti-kanin IgG fortynnet 1:10,000 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), påført i 1 time ved romtemperatur. Immunoblots franyrevev ble også probet med anti-GAPDH-antistoff (Sigma Aldrich) i to timer ved romtemperatur og deretter inkubert med det sekundære antistoffet beskrevet ovenfor. Proteinene ble visualisert ved bruk av et ECL-deteksjonssystem og kjemiluminescensfilm i henhold til produsentens instruksjoner (BioExpress, Kaysville, UT, USA).

HD5 ble kvantifisert ved å sammenligne resulterende båndintensiteter med en seriefortynning av rekombinant standard proHD5-protein (Peptides International, Louisville, KY, USA).NyreHD5-konsentrasjoner ble standardisert til våtvevsvekt. Urin HD 5-konsentrasjoner ble delt med urinkreatinin for å etablere standardiserte urin HD5-til-kreatinin-forhold (mg/mg) for å ta hensyn til urinfortynning. Urinkreatininkonsentrasjoner ble bestemt ved å bruke Oxford Biomedical Research kreatinin mikroplateanalyse (Rochester Hills, Michigan, USA).

Immunhistokjemi

Etter avparafinisering, rehydrering og antigeninnhenting ble det utført en biotinblokk og en serumfri proteinblokk (Superblock, ScyTek Laboratories, Logan, UT, USA). Objektglassene ble inkubert over natten ved 4uC med monoklonalt muse HD5(8C8) antistoff (1:2{{10}}0; Abcam) eller kanin polyklonalt antiserum (1:500) etterfulgt av anti-polyvalent biotinylert antistoff forfalsket Streptavidin/HRP (ScyTek Laboratories). Seksjoner ble utviklet ved bruk av 0,1 prosent diaminobenzidintetraklorid med 0,02 prosent hydrogenperoksid og motfarget med hematoksylin. Negative kontrollseksjoner ble inkubert med ikke-immunserum i stedet for HD5-antistoff.

Immunfluorescens

Dobbeltmerket immunfluorescens ble utført for å hjelpe til med å lokalisere HD5-ekspresjon inyre. Samlekanalen ble dobbeltmerket for hovedceller med geit polyklonalt anti-humant aquaporin-2 antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) [41]. Sløyfen til Henle ble dobbeltmerket med musepolyklonalt anti-humant uromodulin-antistoff (Sigma-Aldrich) og den proksimale tubuli ble dobbeltmerket med geitpolyklonalantihumant aquaporin-1 (Santa Cruz) [41,42]. Rhodamine esel polyklonal anti-geit (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA), rhodamine geit anti-mus (JacksonImmunoResearch Laboratories), og FITC esel polyklonal anti-kanin (Santa Cruz) fungerte som sekundære antistoffer.

Alle seksjoner ble utarbeidet som skissert ovenfor. De ble inkubert med en blanding av museantisera mot HD5 (1:200)(Abcam), AQP-2 (1:500), uromodulin (1:500), AQP-1 (1:400) i rommet temperatur i 90 minutter. Det sekundære antistoffet ble påført i 90 minutter ved romtemperatur og seksjonene ble montert ved bruk av monteringsmedier med DAPI. Ikke-immunserum ble brukt som en negativ kontroll. Objektglassene ble undersøkt med aLeica DM4000B mikroskop og digitalt fotografert ved bruk av Spot RT kamera/programvare (Diagnostic Instruments, SterlingHeights, MI, USA).

ELISA

Link Biotin Antibody Labeling Kit, Novus Biologicals) musemonoklonalt antistoff i 2 timer ved romtemperatur, streptavidin-pepperotperoksidase (Biolegend, San Diego CA, USA) ble tilsatt i 30 minutter. Etter inkubering med TMB-substratløsning i 15 minutter (Kem-En-Tec Diagnostics), ble reaksjonen avsluttet med STOP-løsning (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) og avlest ved en bølgelengde på 450 nm. HD5-konsentrasjoner fra ELISA-analysen ble delt med urinkreatinin for å etablere standardiserte urin HD5-til-kreatininforhold (mg/mg) for å ta hensyn til urinfortynning som beskrevet ovenfor.

Referanser

1. Weichhart T, Haidinger M, Horl WH, Saemann MD (2008) Nåværende konsepter av molekylære forsvarsmekanismer som virker under urinveisinfeksjon. European journal of clinical study 38 Suppl 2: 29–38.

2. Zasloff M (2007) Antimikrobielle peptider, medfødt immunitet og de normalt sterile urinveiene. J Am Soc Nephrol 18: 2810–2816.

3. Lehrer RI, Lichtenstein AK, Ganz T (1993) Defensiner: antimikrobielle og cytotoksiske peptider fra pattedyrceller. Annu Rev Immunol 11: 105–128.

4. Valore EV, Ganz T (1992) Posttranslasjonell prosessering av defensiner i umodne humane myeloidceller. Blood 79: 1538–1544.

5. Liu L, Zhao C, Heng HH, Ganz T (1997) Det menneskelige beta-defensin-1 og alfa-defensiner er kodet av tilstøtende gener: to peptidfamilier med forskjellig disulfidtopologi deler en felles aner. Genomics 43: 316–320.

6. Valore EV, Park CH, Quayle AJ, Wiles KR, McCray PB, Jr., et al. (1998) Human beta-defensin-1: et antimikrobielt peptid av urogenitale vev. J Clin Invest 101: 1633–1642.

7. Schroeder BO, Wu Z, Nuding S, Groscurth S, Marcinowski M, et al. (2011) Reduksjon av disulfidbindinger avslører potent antimikrobiell aktivitet av humant beta-defensin 1. Nature 469: 419–423.

8. Lehmann J, Retz M, Harder J, Krams M, Kellner U, et al. (2002) Uttrykk av humane beta-defensiner 1 og 2 i nyrer med en kronisk bakteriell infeksjon. BMC Infect Dis 2: 20.

9. Bevins CL (2006) Paneth-celledefensiner: nøkkeleffektormolekyler for medfødt immunitet. Biochemical Society transaksjoner 34: 263–266.

10. Quayle AJ, Porter EM, Nussbaum AA, Wang YM, Brabec C, et al. (1998) Genekspresjon, immunlokalisering og sekresjon av humant defensin-5 i den menneskelige kvinnelige reproduktive kanalen. Am J Pathol 152: 1247–1258.

11. Porter E, Yang H, Yavagal S, Preza GC, Murillo O, et al. (2005) Distinkte defensinprofiler i Neisseria gonorrhoeae og Chlamydia trachomatis uretritt avslører nye epitelcelle-nøytrofile interaksjoner. Infect Immun 73: 4823–4833.

12. Com E, Bourgeon F, Evrard B, Ganz T, Colleu D, et al. (2003) Uttrykk av antimikrobielle defensiner i den mannlige reproduksjonskanalen til rotter, mus og mennesker. Reproduksjonsbiologi 68: 95–104.

13. Porter EM, Poles MA, Lee JS, Naitoh J, Bevins CL, et al. (1998) Isolering av humane intestinale defensiner fra ileal neoblæreurin. FEBS brev 434: 272–276.

14. Townes CL, Ali A, Robson W, Pickard R, Hall J (2011) Toleranse av bakteriuri etter urinavledning er knyttet til antimikrobiell peptidaktivitet. Urology 77: 509 e501–508.

15. Wang AP, Su YP, Wang S (2010) Antobakteriell aktivitet og mekanisme for rekombinant humant alfa-defensin 5 mot klinisk antibiotika-resistente stammer. Afr J Microbiol Res 4: 626–633.

16. Gropp R, Frye M, Wagner TO, Bargon J (1999) Epiteliale defensiner svekker adenoviral infeksjon: implikasjon for adenovirusmediert genterapi. Human genterapi 10: 957–964.

17. Smith JG, Nemerow GR (2008) Mechanism of adenovirus neutralization by Human alpha-defensins. Cellevert & mikrobe 3: 11–19.

18. Dugan AS, Maginnis MS, Jordan JA, Gasparovic ML, Manley K, et al. (2008) Humane alfa-defensiner hemmer BK-virusinfeksjon ved å aggregere virioner og blokkere binding til vertsceller. The Journal of Biological Chemistry 283: 31125–31132.

19. Zhang D, Liu ZH, Liao QP, Ma JM, Sun YF, et al. (2009) Studie av lokal immunitet for infeksjoner i nedre kjønnsorganer. Zhonghua fu chan ke za zhi 44: 13–15.

20. Quayle AJ (2002) Den medfødte og tidlige immunresponsen på patogenutfordring i det kvinnelige kjønnsorganet og den sentrale rollen til epitelceller. Journal of reproductive immunology 57: 61–79.