Hypoglykemiske og hypolipidemiske effekter av blåbæranthocyaniner ved AMPK-aktivering: in vitro og in vivo-studier del 1

Vær så snill og kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mer informasjon

Abstrakt:Blåbær er rike på bioaktive antocyaniner, med et høyt nivå av malvidin, som er assosiert med antioksidantfordeler som bidrar til å redusere risikoen for diabetes. Målet med denne studien var å undersøke de hypoglykemiske og hypolipidemiske effektene av blåbærantocyaninekstrakt (BAE),malvidin(Mv), malvidin-3-glukosid (Mv-3-GLC) og malvidin-3-galaktosid (Mv-3-gal) i både human hepatokarsinomcellelinje HepG2 og i en høy- fettdiett som kombinerer streptozotocin-induserte diabetiske mus. Høy glukosebehandling økte signifikant hepatisk oksidativt stress opptil 6-fold og reduserte HepG2-cellelevedyktighet. Forbehandling med BAE, Mv, Mv-3-glc og Mlv{10}}gal reduserte disse skadene betydelig ved å senke de reaktive oksygenarter (ROS) med 87,80,76 og 91 prosent, og øke cellelevedyktigheten med henholdsvis 88,79,73 og 98 prosent. Disse forbehandlingene hemmet også effektivt henholdsvis hyperglykemi og hyperlipidemi ved å redusere ekspresjonsnivåene til enzymer som deltar i glukoneogenese og lipogenese og forsterke de involverte i glykogenolyse og lipolyse, via adenosinmonofosfataktivert proteinkinase (AMPK)-signalveien i HepG2-signalveien. For å bestemme rollen til AMPK i BAE-indusert reaksjon av glukose og lipidmetabolisme in vivo, doser på 100 mg/kg (blåbærantocyaninekstrakter-lav konsentrasjon, BAE-L) og 400 mg/kg (blåbærantocyaninekstrakter -høy konsentrasjon , BAE-H) ble administrert per dag til diabetiske mus i 5 uker. BAE-behandlinger hadde en signifikant (P<0.05) effect="" on="" body="" weight="" and="" increased="" the="" ampk="" activity,="" achieving="" the="" decrease="" of="" blood="" and="" urine-glucose,="" as="" well="" as="" triglyceride="" and="" total="" cholesterol.="" this="" research="" suggested="" that="">antocyaninerbidratt til blåbærekstrakt-induserthypoglykemiog hypolipidemiske effekter ved diabetes og BAE kan være en lovende funksjonell mat eller medisin for diabetesbehandling.

Klikk her for å vite mer

1. Introduksjon

Diabetes mellitus (DM) er en velkjent sykdom som typisk kjennetegnes ved manglende evne til å opprettholde normale blodsukkernivåer. Denne kroniske metabolske lidelsen forårsaker alvorlig skade på menneskers helse og påfører verdensomspennende helsevesen en stor økonomisk byrde [1]. Denne sykdommen er klassifisert i to hovedtyper basert på årsaken til blodsukkerdysregulering. Type 1 DM er forårsaket av autoimmun ødeleggelse av beta-celler som fører til manglende evne til å produsere insulin, mens type 2 diabetes er preget av insulinresistens insulinreseptorer, som har redusert funksjon, ikke lar cellene reagere tilstrekkelig på økende blodsukker.

Cistanche kan forbedre immuniteten

I tillegg til hyperglykemi har diabetikere en tendens til å hahøyt kolesterolbegge tilstandene kan resultere i skade på organer og vev via økt glyoksidativt stress [2]. Insulinproduksjon og insulinreseptorskade er blant faktorene som forårsaker hyperglykemi hos diabetikere. I leveren frigjør overekspresjon av glukoneogenese og glykogenolyse glukose til blodet [3], mens overekspresjon av glukosetransportør 2(GLUT2) i tynntarmen forårsaker en økning i glukosetransport [4]. Hyperlipidemi forårsaket av overuttrykk av lipogenese i fettvev [5] kan også forårsake nedsatt insulinstimulert glukoseopptak og glykogensyntese som fører til insulinresistens og dermed bidra til progresjon av diabetes 6]. Langsiktige komplikasjoner relatert til diabetes påvirker ulike organer og inkluderer hypertensjon, aterosklerose, retinopati, nefropati, fotsår og perifer nevropati [7].

Det finnes foreløpig ingen kur for diabetes, men effektene kan lindres [8]. For personer diagnostisert med type 1 diabetes er en kombinasjon av diettregulering og riktig inntak av insulin i henhold til forbrukte karbohydrater den vanlige behandlingen. Nåværende utfordringer for type 1 diabetikere inkluderer manglende evne eller vanskeligheter med å estimere totale karbohydrater og passende insulindose; imidlertid nesten ideellglykemisknivåer er mulig gitt teknologisk fremgang inkludert insulinpumper [9]. For pasienter som lider av type 2-diabetes, kan behandlingen være mer kompleks, inkludert kombinasjoner av diettregulering, trening, insulin og andre legemidler med en rekke virkningsmekanismer som virker for å senke blodsukkeret[10]. Den vanlige kostholdsanbefalingen er å følge en diett med lite karbohydrater [11,12].

Blåbær er en av fruktene som diabetespasienter kan spise og kan redusere risikoen for type 2 diabetes mellitus (T2DM)[13,14]. Blåbær er rike på en lang rekke forbindelser som er gunstige for menneskers helse, inkludert mineraler, organiske fibersyrer, fenolsyrer og flavonoider inkludert flavonoler og antocyaniner [15,16]. Imidlertid inkluderer typiske antocyaninprofiler galaktosidene, glukosidene og arabinosiden av delfinidin, malvidin, cyanidin, petunidin og peonidin [17] med malvidin og delfinidiner som vanligvis er den viktigste bidragsyteren til totalt antocyanininnhold [18,19]. I vår forrige studie [20] var malvidin det mest tallrike anthocyanidinet som ble funnet i rabbiteye blåbærfruktekstrakt sammen med delfinidin, cyanidin, petunidin og peonidin, som er i samsvar med andre forfattere som også fant at malvidin var en viktig bidragsyter til totalt antocyanininnhold i ulike typer blåbær [17,21].

Blåbærantocyaniner kan forbedre insulinfølsomheten gjennom antioksidantkapasitet og gjennom andre regulatoriske interaksjoner ettersom effektene deres ikke kan forklares helt av førstnevnte [13,22]. Studier har også funnet fordelene med blåbærantocyaniner for andre diabetesrelaterte bekymringer. I en in vitro-studie har Huang et al. [23] fant at blåbærantocyaniner hadde betennelsesdempende og antioksidanteffekter på menneskelige retinale celler under høye glukoseforhold. Celler eksponert for høy glukose hadde 64 prosent levedyktighet, mens når de ble eksponert for blåbærantocyaninekstrakt, malvidin, malvidin-glukosid eller malvidin-galaktosid, var levedyktigheten deres 7-9 prosent ,83 prosent ,91- prosent , eller { {11}} prosent henholdsvis. På den annen side, Song et al. [24] fant at blåbærantocyaniner reduserte oksidativt stress og betennelse i diabetisk rottenetthinne. Diabetiske rotter ble gitt 20, 40 og 80 mg/kg blåbærantocyaniner oralt i 12 uker. Rotter med høye doser blåbærantocyaniner hadde lavere blodsukker, høyere antioksidantkapasitet og lavere betennelse i netthinnen, og lavere reaktive oksygenarter sammenlignet med de uten blåbærantocyaniner.

Selv om blåbærantocyaniner gir helsemessige fordeler til leveren og andre organer for diabetikere, er hypoglykemiske og hypolipidemiske virkninger av blåbærantocyaninekstrakt (BAE) i humane leverceller uklare. I denne studien ble det spekulert i at BAE, så vel som Mv, Mv-3-glc og Mv-3-gal, har hypoglykemiske og hypolipidemiske aktiviteter i humane hepatokarsinomceller (HepG2) og mus, og at de kunne opprettholde glukolipid homeostase og dermed lindre utviklingen av diabetes.

2. Materialer og metoder

2.1. Kjemikalier og reagenser

Brightwell rabbiteye blåbær (Vaccinium ashei ble høstet fra Fujiabian Orchard Picking (Nanjing, Kina) og deres antocyaninekstrakter ble deretter oppnådd og lagret i mørket ved {{0}} grad . Reagenset 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyl-2H-tetrazoliumbromid (MTT) og standardene malvidin (Mv), malvidin-3-glukose (Mv{ {11}}glc), og malvidin-3-galaktose(Mv-3-gal) ble anskaffet fra Sigma Aldrich (Shanghai, Kina). HepG2 primære celler, bicinchoninsyre (BCA) proteinanalysesett og forbedret kjemiluminescens (ECL) western blotting-deteksjonsreagenser ble anskaffet fra CW Biotechnology (Beijing, Kina). Føtalt bovint serum (FBS), Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) og penicillin-streptomycin ble anskaffet fra Gibco (Auckland, New Zealand). BioFroxx streptozotocin (STZ) ble kjøpt fra Saiguo Biotech (Guangzhou, Kina). Dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA) deteksjonssett ble kjøpt fra Beyo-time Institute of Technology (Shan) ghai, Kina). Bovint serumalbumin (BSA) ble anskaffet fra Shyuanye (Shanghai, Kina). Fôret med høyt fett og høyt sukkerinnhold (fett 35,5 prosent, protein 20 prosent, karbohydrat 36,4 prosent, 0,1 prosent cellulose) og normalfôret (fett 4,5 prosent, protein 23 prosent, karbohydrat 31,9 prosent, 3,7 prosent fruktose og 5,3 prosent cellulose) for mus ble oppnådd fra Xietong Bioengineering Co., Ltd (Nanjing, Kina). Assaysettene for insulin, triglyserid (TG), totalkolesterol (TCHD, glutationperoksidase(GSH-Px) og superoksiddismutase (SOD) ble kjøpt fra Jiancheng Bioengineering Research Institute (Nanjing, Kina). AndyGene human Forkhead Box O1(FOXO1) , glukose-6-fosfatase(G6Pase), glykogensyntase-fosforylering (p-GS), glykogensyntasekinase-3 beta-fosforylering (p-GSK3 ), glukosetransportør 2(GLUT2), acetylkoenzym A-karboksylase (ACC), hormonsensitiv triglyseridlipase (HSL), 3-hydroksy-3-metylglutaryl-koenzymreduktase (HMGCR) og fastende insulin enzym-koblet immunosorbent assay (ELISA)-sett ble alle kjøpt fra Bluegene Biotech (Shanghai, Kina) Kjemikaliene og reagensene som ble brukt i denne studien var alle av rene analytiske kvaliteter.

2.2. Antistoffer

Primære antistoffer mot GS, p-GS (Ser641), sterolregulatorisk elementbindende protein-1c(SREBP-1c) og fosfoenolpyruvatkarboksykinase (PEPCK) ble anskaffet fra Abcam (Cambridge, Storbritannia) . Primære antistoffer mot adenosinmonofosfataktivert proteinkinase alfa (AMPKa), p-AMPK a (Thr172), peroksisom-proliferator-aktivert reseptor-y-koaktivator-1 (PGC-1), ACC, p- ACC (Ser79) og pepperrotperoksidase (HRP)-konjugerte sekundære antistoffer ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Antistoff mot glyceraldehyd 3-fosfatdehydrogenase (GAPDH) ble kjøpt fra Nanjing Beidi Biomed Technology (Nanjing, Kina), mens antistoff mot -aktin ble kjøpt fra Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Primære antistoffer ble brukt ved 1:1000 fortynninger, mens 1:4000 fortynninger ble brukt for sekundære antistoffer.

2.3. Fremstilling av blåbæranthocyaninekstrakt (BAE)

Ekstraksjonen av blåbærantocyaniner ble utført ved å bruke vår tidligere metode til Huang et al. [25]. De frosne rabbiteye blåbærene ble holdt ved romtemperatur til de ble tint. Deretter ble de slått med 10 000 rpm i 30 s med en T18 basic ULTRA-TURRAX homogenisator (IKA Works Guangzhou, Kina). En mengde på 250 g blåbær ble deretter bløtlagt i en løsning av 1000 ml metanol inneholdende 1 prosent HCl i 24 timer. Ekstraktet ble deretter samlet etter sentrifugering ved 5000 xg i 15 minutter. Etter fordampning av løsningsmidlet ved 40 grader i vakuum, ble resten ekstrahert med 1:1 (v/v) etylacetat tre ganger. Vannfasen inneholdende antocyaniner ble samlet og konsentrert ved bruk av vakuumfordampning for å oppnå det urene antocyaninekstraktet. Ekstraktet ble ytterligere renset med AB-8 makroporøs harpiks (Sigma Aldrich, Shanghai, Kina). For å fjerne fruktose og protein ble ekstraktet utsatt for kolonnekromatografi på 1000 g AB-8 makroporøs harpiks i 24 timers absorpsjon og deretter eluert med dobbeltdestillert vann. Antocyaninfraksjonen ble eluert med 80 prosent etanol inneholdende 1 prosent HCl-løsning, konsentrert i vakuum og deretter tørket med en Eyela FDU-1200 frysetørker (Tokyo Rikakikai, Japan) for å få et blåbæranthocyaninekstrakt (BAE) pulver.

2.4. Cellekultur og behandlinger

HepG2-cellelinjer, avledet fra et spesifikt humant hepatocellulært karsinom, har en høy andel leverspesifikke proteiner. Av denne grunn brukes de ofte som laboratoriemodeller for humane levercellestudier [26]. HepG2-celler ble dyrket i DMEM som inneholdt normal D-glukose (5,5 mM) supplert med 10 prosent FBS og 1 prosent penicillin-streptomycin og holdt ved 37 grader C og 5 prosent CO2 atmosfære inkubator (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Etter å ha nådd 70-80 prosent konfluens, ble HepG2-cellene subkulturert. Fire timer før eksperimentet ble HepG2-celler stanset i et redusert serummedium. Etter forbehandling med 5 ug/mLof Mv, Mv-3-glc, Mv-3-gal eller BAE i 24 timer, ble cellene eksponert for normale (5,5 mM) eller høye (30 mM) glukosekonsentrasjoner til etterligne normale og diabetiske tilstander. Cellene ble forberedt for Western Blot-analyse og supernatantene ble samlet for ELISA-analyse.

2.5. Dyr og eksperimentell design

C57BL/6J friske hannmus (20 ± 2 g) fra GemPharmatech (Nanjing, Jiangsu, Kina) ble holdt under standard laboratorieforhold, inkludert en konstant temperatur på 25 grader og en 12-t dag og natt veksling. Jiangsu Academy of Agricultural Sciences underkomité for forskning dyrepleie og brukskomité hadde tidligere godkjent alle dyreforsøksprosedyrer. En fettrik diett og streptozotocin (STZ) ble brukt for å indusere T2DM i dyremodellene i henhold til metoden brukt av Islam og Loots [27]. Alle mus ble matet med en diett med høyt fett og høyt sukker, bortsett fra kontrollgruppen som spiste et normalt kosthold. Etter 4 uker ble musene fastet i 12 timer og injisert intraperitonealt med 100 mg/kg STZ oppløst i natriumcitratbufferløsning (pH 4.2-4.5). En uke etter STZ-induksjon ble det tatt blodprøver fra halevenen til musene som hadde fastet over natten. Mus som viste diabetiske symptomer inkludert polyuri, polydipsi og hyperglykemi (fastende blodsukkernivå > 11,1 mmol/L) ble gjenkjent som T2DM og brukt for fremtidige studier. For å sjekke modellens T2DM-stabilitet ble alle mus matet med vanlig diett i en uke. De normale musene ble brukt som kontrollgruppe. De diabetiske musene ble deretter tilfeldig delt inn i tre grupper: modell, lavdose BAE (100 mg/kg) og høydose BAE (400 mg/kg). I 6 påfølgende dager ble intragastrisk administrering av enten samme volum løsemiddel (100 μL), 100 mg/kg eller 400 mg/kg BAE gitt til kontrollgruppen, modellgruppen, lavdose BAE og høydose BAE hhv. På den syvende dagen ble kroppsvekt og fastende blodsukker målt. Den samme intragastriske administreringen fortsatte i 5 uker. Mus ble deretter fastet over natten, og blodprøver ble samlet for serumpreparering fra den nedre vena cava og lagret ved -20 grad. Etter blodprøvetaking ble alle musene bedøvet og ofret. Musenes lever-, milt-, nyre- og thymusvev ble fjernet, veid og lagret ved -80 grad for videre eksperimenter.

2.6. Deteksjon av cellelevedyktighet

Cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT-metoden. Fem ug/mL Mv, Mv{0}}glc, Mv-3-gal eller BAE ble brukt til forbehandling av celler i 24 timer. Cellene ble deretter behandlet med 5 mMor 30 mM glukose i 24 timer og 10 μL 0,5 prosent (5 mg/mL) MTT ble tilsatt til cellene som deretter ble dyrket igjen. Etter 4 timer ble MTT-løsningen fjernet, og 100 μL dimetylsulfoksid (DMSO) ble tilsatt før blandingen ble ristet sakte i 10 minutter for å oppløse cellekrystallen. Absorbansen ved 490 nm ble målt på en StatFax-2100 mikroplateleser (Awareness Tech-nology Inc., Plam, FL, USA) for å oppnå verdiene for optisk tetthet (OD). Celler dyrket med normale glukosenivåer (5,5 mmol/L) ble brukt som kontrollgruppe, mens brønner uten celler ble brukt som blindprøve. Følgende formel ble brukt for å bestemme cellelevedyktighet: Cellelevedyktighet(prosent )=(prøvegruppe OD-verdi-blank gruppe OD-verdi)/(kontrollgruppe OD-verdi-blank gruppe OD-verdi)x 100 prosent .

2.7. ROS-fluorescensvisualisering

De reaktive oksygenartene (ROS) i HepG2-celler ble vurdert ved å bruke DCFH-DA-deteksjonssettet. Etter en innledende behandling med 5 ug/mL Mv, Mv-3-glc, Mv-3-gal eller BAE i 24 timer som senere ble fulgt av en 5 mM eller 30 mMglucosebehandling i 24 timer, cellene ble vasket med PBS, og deretter ble 10 μM DCFH-DA tilsatt til hver brønn og fikk reagere i 20 minutter ved 37 grader. Cellene ble igjen vasket grundig med PBS og deretter ble en gruppe av disse cellene umiddelbart observert under et IX53 invertert fluorescerende mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) ved 530 nm emisjon og 485 nm eksitasjonsfiltre. Bildene presenteres under 200× forstørrelse. Etter dissosiasjon ble en annen gruppe celler samlet og deres fluorescens ble registrert av en Synergy H4 multi-mode mikroplateleser (BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, USA). Den totale fluorescensintensiteten til cellene i hver brønn ble notert, og ROS-generering ble målt som en fold av kontrollen.

2.8. ELISA

ELISA-sett ble brukt til å kvantifisere proteiner involvert i glukoneogenese (FOXO1, G6Pase, p-GS), glykogenolyse (p-GSK3), glukosetransportør (GLUT2), lipogenese (ACC og HMGCR) og lipolyse (HSL) i supernatantene til HepG2 celler. Mengden GLUT2 i muselever ble også bestemt. BCA-proteinanalysesettet ble brukt til å kvantifisere det totale celleproteinet til supernatanten. Absorbansen ved 450 nm ble målt ved 37 grader på en StatFax{10}} mikroplateleser (Awareness Technology Inc., Plam, FL, USA) for å bestemme proteinnivåer.

2.9. Western blotting-analyse

Western blotting ble utført på HepG2-lysater for å måle proteinnivået til AMPK, p-AMPK, glukoneogenese (PGCl, PEPCK, glykogenolyse(GS, p-GS) og lipolyse (ACC, p-ACC, SREBP{{4} }c)i cellene. Western blotting ble også utført for å bestemme mengdene AMPK,p-AMPK på leverene til diabetesinduserte mus. Enten GAPDH eller -Actin ble brukt som belastningskontroll. LAS-3000-avbildning system (Fuji, Tokyo, Japan) ble brukt til å observere proteinbåndene, og deres tetthet ble kvantifisert ved å bruke Bio Profile 1D pluss (Vilbert Lour-mat, Marne La Vallee, Frankrike) programvare. Alle data ble uttrykt som en fold endring til kontrollen.

2.10. Fastende blodsukker og glukosetoleranseanalyse

Fastende blodsukker ble målt en gang i uken i en periode på 5 uker etter en 12-h fasteperiode. For glukosetoleranseanalyse ble mus fastet i 16 timer og matet med 2 g/kg 20 prosent glukose (200 μL) intragastrisk (ig) for å bestemme blodsukkeret ved 0 ,0,5,1,1,5 og 2t. Blodet ble samlet fra halevenen og glukosenivåene ble målt ved hjelp av et glukometer (Sinocare, Changsha, Kina). Glukosenivået i urinen til mus som fikk ig ble også målt i en periode på fem uker.

2.11. Estimering av serum biokjemiske indekser og enzymaktivitet i muselever

Mengden insulin, triglyserid og totalkolesterol i serumet ble målt, mens SOD og GSH-PX enzymaktivitet ble estimert ved bruk av kommersielle sett i henhold til produsentens protokoll. Absorbans ved 500 nm for triglyserider (TG) og totalkolesterol (TCH), og 450 nm for de andre (insulin, SOD og GSH-PX) ble målt ved 37 grader på en StatFax-2100 mikroplateleser (Awareness Technology) Inc., Plam, FL, USA).

2.12. Statistisk analyse

Alle data presenteres som middelverdi ± standardavvik (SD) for minst tre uavhengige eksperimenter. Tallene ble oppnådd ved bruk av GraphPad Prism versjon 8 (GraphPad Software, Inc., CA, USA). Enveis variansanalyse (ANOVA), t-tester eller Sidaks multiple sammenligningstest ble utført for å bestemme statistiske forskjeller mellom ulike grupper. Forskjeller ble ansett som betydelige ved P<>

Denne artikkelen er hentet fra https://doi.org/10.1016/j.redox.2021.102100 Mottatt 21. juli 2021; Mottatt i revidert form 9. august 2021; Godkjent 11. august 2021