Hypotermi indusert av okskarbazepin etter forbigående iskemi i forhjerne utøver terapeutisk nevrobeskyttelse gjennom forbigående reseptorpotensial Vanilloid type 1 og 4 hos gerbiler del 3

4. Materialer og metoder

4.1. Forsøksdyr

Hannrotte (totalt antall=252) ble brukt i en alder av 6 måneder (kroppsvekt, 63–78 g). Ørtenrottene ble avlet i det eksperimentelle dyresenteret ved Kangwon NationalUniversity (Chuncheon, Korea).

Gerbiler er veldig søte små dyr. De lever i ørkenområder, er flinke til å grave grotter og har sterke instinkter for å lagre og lokalisere mat. Blant disse små gutta har mannlige ørkenrotter en spesielt god hukommelse, noe som gjør at folk vil vite hemmelighetene deres.

For det første, når mannlige ørkenrotter ser etter mat, bruker de en rekke signaler som landemerker og terreng for å bestemme retningen. Gjennom langtidsobservasjon og praksis har de etablert et eget «geografisk informasjonssystem». Derimot har kvinnelige ørkenrotter dårligere hukommelse for disse signalene, spesielt i et miljø i stadig endring.

For det andre viser mannlige gerbiler også et sterkt minne når de kjemper mot naturlige fiender. Ifølge forskere, når ørkenrotten er truet, vil de raskt gå inn i hulen og prøve å rømme. Men når de står overfor den samme trusselen, vil mannlige gerbiler huske angrepsmodusen til naturlige fiender og unngå dem, noe som øker sjansene deres for å overleve.

Til slutt, minnet om mannlige ørkenrotter ligger også i deres sosiale oppførsel med hverandre. Hver gerbil har sin unike lukt. Når de møter andre ørkenrotter, vil de bruke luktesansen til å identifisere hverandres identitet og status. Denne minneevnen lar ikke bare ørkenrotter etablere en relativt stabil sosial forbindelse, men er også en viktig garanti for deres reproduksjon.

Oppsummert er forholdet mellom mannlige ørkenrotter og hukommelse uadskillelig. I prosessen med å søke overlevelse og reproduksjon i naturen, er de avhengige av deres sterke hukommelse for å konstant tilpasse seg miljøet og forbedre seg. Som mennesker bør vi lære av disse små gutta og stadig finpusse hukommelsen for å bedre tilpasse oss denne stadig skiftende verden. Det kan sees at vi trenger å forbedre hukommelsen vår, og Cistanche kan forbedre hukommelsen betydelig fordi den også kan regulere balansen av nevrotransmittere, som å øke nivåene av acetylkolin og vekstfaktorer, som er svært viktige for hukommelse og læring. I tillegg kan Cistanche også forbedre blodstrømmen og fremme oksygentilførsel, noe som kan sikre at hjernen får tilstrekkelig næring og energi, og dermed forbedre hjernens vitalitet og utholdenhet.

Klikk Know for å øke minnekraften

For denne studien ble den eksperimentelle protokollen godkjent (godkjenningsnr. KW-200113-1; godkjenningsdato, 18. februar 2020) av Institutional AnimalCare and Use Committee.

Forskningsprotokollen fulgte retningslinjene foreslått i "Current International Laws and Policies" i Guide for Care and Use of LaboratoryAnimals publisert av The National Academies Press (8. utgave, 2011).

4.2. Eksperimentelle grupper, induksjon av tFI og HyT- og OXC-behandlinger

For å bevise den beskyttende effekten av OXC mot iskemisk skade etter FI i ørkenrotter, ble ørkenrottene delt inn i seks grupper: (1) sham+vehicle group (n=24); (2) tFI+vehicle group (n {{5) }}); (3) sham+HyT-gruppe (n=24); (4) tFI+HyT gruppe (n=60); (5) sham+OXC (200 mg/kg) gruppe (n=24); og (6) tFI+OXC-gruppe (n=60).

Syv og fem gerbiler i de tre tFI-gruppene ble brukt til henholdsvis Western blot-analyse og histologisk undersøkelse etter 30 minutter, 12 timer, 1 dag, 2 dager og 4 dager etter tFI-operasjonen, og i de tre falske gruppene, syv og fem ørkenrotter ble brukt 30 minutter og 4 dager etter den falske operasjonen for å minimere antallet. I dette eksperimentet ble tFI utviklet som tidligere beskrevet [34].

Kort fortalt ble gerbilene bedøvet med 2,5 % isofluran (i 32 % oksygen og 68 % lystgass). Under bedøvelse ble begge vanlige halspulsårene isolert fra halspulsåren og okkludert med aneurismeklemmer (Yasargil FE 723K) (Aesculap, Tyskland, Tuttlingen, Tyskland) ) i fem minutter.

Den perfekte stopp av blodtilførselen til hjernen ble bekreftet gjennom observasjon av arteriell blodstrøm i begge retinalarteriene (grener av indre halspulsårer) ved bruk av et oftalmoskop (HEINE K180®) fra Heine Optotechnik (Herrsching, Tyskland).

Kroppstemperaturen før og under operasjonen i alle grupper ble kontrollert ved normotermi (37 ± 0,2 ◦C) ved bruk av et termometrisk teppe. Etter fem minutters okklusjon ble klipsene fjernet.

I denne studien ble en falsk operasjon utført ved å utsette dem for den samme tFI-operasjonen uten okklusjon av de vanlige halspulsårene. HyT i de to sham+HyT- og tFI+HyT-gruppene ble kontrollert (tilsvarende endringen i kroppstemperaturen i tFI+) OXC-gruppe) ved avkjøling av hele kroppen med en ispose i seks timer.

Kroppstemperaturen til de to sham+OXC- og tFI+OXC-gruppene ble registrert i seks timer etter umiddelbar intraperitoneal injeksjon av 200 mg/kg OXC (Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, USA) etter tFI-operasjonen.

Doseringen av OXC ble valgt basert på en tidligere studie som rapporterte at 200 mg/kg OXC effektivt beskyttet mot celledød i hjernen etter [36]. For å registrere kroppstemperaturendringer ble kroppstemperaturen målt i endetarmen hver time etter tFI, over en 6 timers periode, under romtemperatur (ca. 22 ◦C).

Gerbilene fikk en restitusjonstid på fire dager etter tFI fordi pyramidale celler lokalisert i hippocampus CA1-regionen begynner å dø fire dager etter tFI [30,34,62].

4.3. SMA-test

SMA-testen ble utført for å undersøke endringer i hyperaktivitet i alle grupper. Kort sagt, som beskrevet tidligere [63], ble SMA-testen utført på dag 1 etter tFI siden lokomotorisk aktivitet når det høyeste punktet på dag 1 etter iskemisk skade etter tFI.

Ørtenrottene til alle gruppene fikk miljøtilpasning i to timer, og de ble plassert i et åpent feltbur (bredde 44 cm; lengde 44 cm; høyde 30) hentet fra Ugo Basile SRL (Gemonio, Italia), hvor to parallelle horisontale infrarøde stråler 4 × 8 fra gulvet ble installert i en time. SMA ble registrert med et Photobeam Activity System-Home Cagefrom San Diego Instruments (San Diego, CA, USA).

Bevegelse (bane og total tilbakelagt distanse) ble oppdaget gjennom avbruddet av rekken av infrarøde stråler produsert av fotoceller.

SMA ble kontinuerlig overvåket i én time, og dataene ble samlet inn ved hjelp av en AMB-analysator fra IPC Electronics (Cumbria, Storbritannia).

Datainnsamlingen ble påbegynt 15 minutter etter tilvenning i frimarksburet. Til slutt ble de oppnådde resultatene evaluert som avstanden (meter) med bevegelse i testperioden (en time).

4.4. Tester av kognitive funksjoner

4.4.1. RAMT

For å sammenligne romlig minne på tvers av alle grupper, ble RAMT utført i henhold til tidligere studier [38,44]. En radiell 8-armlabyrint fra Stoelting Co (Wood Dale, IL, USA) ble brukt til denne testen.

Labyrintinstrumentet besto av en sentral plattform og åtte armer (hver armbredde 5 cm; høyde 9 cm; lengde 35 cm). Gerbilene ble trent en gang om dagen i tre dager før.

Pelletfôr hentet fra DBL Co (Chungbuk, Korea) ble nemlig satt i endedelen av hver arm, og hver ørkenrotte ble plassert på den sentrale plattformen. Deretter lette ørkenrotten etter fôret.

Etter sham- eller tFI-operasjonen ble den virkelige testen utført en gang om dagen i fire dager med start én dag etter operasjonen.

For analysen ble antall feil evaluert, med en feil som oppstod hver gang ørkenrotten gikk inn i en arm som allerede var besøkt før. Testen var ferdig da ørkenrotten spiste fôret.

4.4.2. KLAPPE

For å sammenligne korttidshukommelse på tvers av gruppene, ble PAT utført i henhold til tidligere rapporterte metoder [64,65] med noen modifikasjoner. Kort fortalt ble ørkenrottene testet ved hjelp av Gemini Avoidance System (GEM 392) fra San Diego Instruments (SanDiego, CA, USA), som består av to (mørke og lyse) rom som kommuniserer med hverandre via en vertikal skyveport.

Eksperimentøktene ble utført i to faser: en treningsøkt og en ekte testøkt utført én dag før og fire dager etter tFI- eller falske operasjonen.

Den virkelige testen ble utført 20 minutter etter treningsøkten ved å måle latenstiden (sekunder) under oppholdet i det mørke rommet. Nemlig i treningsøkten fikk ørkenrotten utforske de to avdelingene fritt i ett minutt mens porten ble åpnet .

Deretter, da ørkenrotten gikk inn i det mørke rommet, ble døren lukket og ørkenrotten fikk et elektrisk fotstøt (0,5 mA) fra et stålgitter på gulvet i fem sekunder.

I den virkelige testøkten, på dag 4 etter tFI, ble ørkenrotten plassert i det lyse rommet, og latenstiden i det lyse rommet før det gikk inn i det mørke rommet ble registrert.

4.5. Western blot-analyse for TRPV1 og TRPV4

For å undersøke ekspresjonsnivåene til TRPV1 og TRPV4 i gerbil hippocampal CA1, ble Western blot-teknikken utført i henhold til tidligere beskrevne metoder [66,67].

Kort fortalt, i henhold til den angitte tidsplanen (30 min, 12 timer, 1 dag, 2 dager og 4 dager etter sham- eller tFI-operasjon), ble ørkenrotter (n=5 for hver gruppe) gitt anestesi for eutanasi ved intraperitoneal injeksjon med 200 mg/kg pentobarbitalnatrium (JW Pharm.Co., Ltd., Seoul, Korea).

Deretter ble hjernene deres høstet og homogenisert med 50 mM fosfatbufret saltvann (PBS, pH 7.4) inneholdende 0.1 mM etylenglykol-bis (aminoetyleter)-N, N, N{{ 11}}, N0-tetraeddiksyre (EGTA) (pH 8.0), 10 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) (pH 8,0), 0,2 % Nonidet P{{17 }}, 15 mM natriumpyrofosfat, 100 mM -glyserofosfat, 2 mM natriumortovanadat, 50 mM NaF, 150 mM NaCl, 1 mMfenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) og 1 mM ditiotreitol (DTT).

Deretter ble prøvene sentrifugert, og supernatantene ble tatt for å bestemme proteinnivåer ved å bruke et Micro BCA-analysesett fra Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) med bovineserumalbumin fra Pierce Chemical Co (Rockford, IL, USA).

Alikvoter inkludert 20 µg totalt protein ble kokt i ladebuffer, 150 mM Tris (pH 6,8) inneholdende 6 % natriumdodecylsulfat (SDS), 3 mM DTT, 0,3 % bromfenolblått og 30 % glyserol.

Prøvene ble separert via 10 % SDS-polyakrylamidgelelektroforese (PAGE). Deretter ble gelene overført til nitrocellulosemembraner fra Pall Co (East Hills, NY, USA) ved 350 mA og 4 ◦C i 90 min.

For å blokkere ikke-spesifikk farging ble membranene inkubert i 5 % avfettet melk i 60 minutter ved romtemperatur. Deretter ble de immunreagert med hvert primære antistoff: kanin-anti-TRPV1 (fortynnet 1:1000) (Abcam, Cambridge, Storbritannia), kanin-anti-TRPV4 (fortynnet 1:1000) (Abcam) og kanin-anti- - aktin (fortynnet 1:2000) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ved 4 ◦C i 7 timer.

Deretter ble de reagert med pepperrotperoksidase (HRP)-konjugert esel anti-kanin IgG (fortynnet 1:4500) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) ved romtemperatur i 1 time.

Til slutt ble aluminol-basert kjemiluminescenssett fra Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) brukt for å forbedre visualisering.

Som beskrevet tidligere [68], ble immunoblotene til TRPV1 og TRPV4 analysert ved hjelp av Scion Image-programvare fra Scion Crop (Frederick, MD, USA). Båndene ble skannet, og densitometrisk analyse ble utført. Proteinnivåene ble normalisert versus det tilsvarende nivået av -aktin.

4.6. Utarbeidelse av histologiske snitt

For immunhistokjemiske og histopatologiske undersøkelser ble ørkenrotten (n=7 for hver gruppe) ofret i henhold til den angitte tidsplanen (30 minutter, 12 timer, 1 dag, 2 dager og 4 dager etter tFI- eller falsk operasjon).

Som tidligere beskrevet [34], ble ørkenrotten dypt bedøvet med pentobarbitalnatrium (200 mg/kg) (JW Pharmaceutical, Seoul, Korea). Under anestesi ble ørkenrotten skylt transkardialt med 0,1 M fosfatbuffer saltvann (pH 7,4) og fiksert med 4 % paraformaldehyd (i 0,1 M fosfatbuffer, pH 7,4).

Deretter ble hjernen deres oppnådd og etterfiksert ved bruk av samme fikseringsmiddel i seks timer. Deretter ble hjernevevet kuttet (25 µm tykkelse av koronale plan) i akryostat (Leica, Wetzlar, Tyskland).

4.7. Histokjemisk farging ved hjelp av CV

For å undersøke den morfologiske og nevronale skaden i hippocampus til hver gruppe, ble kresylfiolett (CV) farging utført som vi beskrevet tidligere [69]. Kort fortalt ble kresylfiolettacetat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) oppløst ved 1,0 % (vekt/volum) i destillert vann, og iseddik (0.28) %) ble tilsatt til denne løsningen. Seksjonene ble beiset og montert med kanadisk balsam (Kanto, Tokyo, Japan).

4.8. FJ B Farging

FJ B-farging ble utført for å undersøke neuronal degenerasjon (død eller tap). I henhold til den publiserte prosedyren [34] ble de tilberedte hjerneseksjonene dynket i 1 % natriumhydroksid, umiddelbart overført til 0.06 % kaliumpermanganat og omgående reagert med 0,0004 % Fluoro-Jade B (Histochem) , Jefferson, AR, USA).

Seksjonene ble kort vasket og satt på en lysbildevarmer (ca. 50 ◦C) for reaksjon med FJ B. For å vurdere den terapeutiske effekten av OXC mot tFI, ble antallet FJ B+-celler talt i CA1-regionen i henhold til en metode publisert i [ 70].

Kort fortalt ble digitale bilder av FJ B+-celler tatt fra fem seksjoner per gerbil ved hjelp av et epifluorescerende mikroskop (Carl Zeiss) (Oberkochen, Tyskland) ved 450–490 nm bølgelengde. Cellene ble talt i 250 µm2, som inkluderte SP, i sentrum av CA1-regionen ved å bruke et bildeanalysesystem (Optimas 6.5) (CyberMetrics, Scottsdale, AZ, USA).

4.9. Immunhistokjemi

For å undersøke endringer i NeuN, TRPV1 og TRPV4 immunreaktivitet i CA1-regionen, ble generell immunhistokjemi utført. I korte trekk, i henhold til en publisert metode [34], ble de forberedte hjerneseksjonene inkubert med primære antistoffer - muse-anti-NeuN (fortynnet, 1:1100) (Chemicon, Temecula, CA, USA), muse-anti-TRPV1 (fortynnet, 1:500) (Abcam, Cambridge, Storbritannia), og kanin-anti-TRPV4 (fortynnet, 1:500) (Abcam, Cambridge, Storbritannia).

Deretter ble disse inkuberte seksjonene inkubert i de tilsvarende sekundære antistoffene (fortynnet, 1:250) (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) og utviklet ved bruk av Vectastain ABC (fortynnet, 1:250) (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) , USA). Til slutt hadde disse immunreagerte seksjonene farge etter visualisering med 3,3'-diaminobenzidin.

Antallet NeuN+celler ble telt som følger. Digitale bilder av NeuN+celler ble tatt fra fem seksjoner per gerbil ved bruk av et lysmikroskop (AxioM1) (Carl Zeiss, Tyskland).

Cellene ble talt på samme måte som FJ B+celletallet. For å evaluere tettheten til TRPV1+ og TRPV4+strukturer, ble de tilsvarende områdene i CA1-regionen brukt i fem seksjoner per dyr. Bilder av TRPV1+- og TRPV4+-strukturene ble tatt med et AxioM1-lysmikroskop (Carl Zeiss) (Tyskland).

Tetthetene til TRPV{{0}} og TRPV4+strukturer ble evaluert som den relative optiske tettheten (ROD). Til dette ble bildene transformert til gjennomsnittlig grått nivå. ROD ble presentert som en prosentandel ved bruk av Adobe Photoshop (versjon 8.0) og NIH Image J-programvare (NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD, USA).

4.10. Statistisk analyse

Vi presenterte dataene som gjennomsnitt ± standardfeil for gjennomsnittet (SEM). Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av GraphPad Prism (versjon 5.0) (GraphPadSoftware, La Jolla, CA, USA). Forskjeller i gjennomsnittet blant de eksperimentelle gruppene ble statistisk analysert ved toveis variansanalyse (ANOVA) med en post hocBonferronis multiple sammenligningstest for å belyse tFI-relaterte forskjeller blant alle gruppene. Statistisk signifikans ble vurdert ved p < 0. 05.

Forfatterbidrag: Konseptualisering: M.-HW og T.-KL; Metodikk, J.-CL og DWK; Programvare, H.-IK og MCS; Validering, JHA, IJK og JHP; Undersøkelse, J.-CL, H.-IK og M.CS; Datakurering, JHC, IJK og JHP; Skrive-Original Draft Preparation, H.-IK, andJ.-CL; Skrive-gjennomgang og redigering, M.-HW; Tilsyn, S.-SL; Prosjektadministrasjon, M.-HW; Funding Acquisition, S.-SL og T.-KL Alle forfattere har lest og godtatt den publiserte versjonen av manuskriptet.

Finansiering: Dette arbeidet ble støttet av Brain Korea 21 (BK21) Fostering Outstanding Universities forResearch (FOUR, 4220200913807) finansiert av National Research Foundation (NRF) i Korea, og av Basic Science Research Program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av Kunnskapsdepartementet (NRF-2020R1I1A1A01070897).

Uttalelse fra institusjonell vurderingsstyre: Ørtenrottene ble avlet i det eksperimentelle dyresenteret ved Kangwon National University (Chuncheon, Korea). For denne studien ble den eksperimentelle protokollen godkjent (godkjenningsnr., KW-200113-1; godkjenningsdato, 18. februar 2020) av Institutional AnimalCare and Use Committee.

Forskningsprotokollen fulgte retningslinjene som ble foreslått i "CurrentInternational Laws and Policies" i Guide for Care and Use of Laboratory Animals publisert av The National Academies Press (8. utgave, 2011).

Informert samtykkeerklæring: Ikke relevant.

Datatilgjengelighetserklæring: Dataene presentert i denne studien er tilgjengelig på forespørsel fra den korresponderende forfatteren.

Anerkjennelser: Forfatterne setter pris på Hyun Sook Kim og Seung Uk Lee for deres tekniske hjelp i denne studien.

Interessekonflikter: Forfatterne har erklært at det ikke er noen økonomisk interessekonflikt.

Forkortelser

CA1: delfelt Cornu Ammonis 1; CNS, sentralnervesystemet; CV, kresylfiolett; DG, dentate gyrus;FJ B, Fluoro-Jade B; HyT, hypotermi; NeuN, nevronale kjerner; OXC, okskarbazepin; PAT, passiveunngåelsestest; ROD, relativ optisk tetthet; SMA, spontan motorisk aktivitet; SO, stratum oriens;SP, stratum pyramideformet; SR, stratum radiatum; tFI, forbigående forhjerneiskemi; TRPV1, transientreseptorpotensial vanilloid type 1.

Referanser

1. Busto, R.; Dietrich, WD; Globus, MY; Valdes, I.; Scheinberg, P.; Ginsberg, MD Små forskjeller i intraiskemisk hjernetemperatur bestemmer kritisk omfanget av iskemisk nevronal skade. J. Cereb. Blodstrømmetab. 1987, 7, 729–738. [CrossRef][PubMed]

2. Maher, J.; Hachinski, V. Hypotermi som en potensiell behandling for cerebral iskemi. Cerebrovasc. Hjernemetab. Rev. 1993, 5 277–300.

3. Sykepleier, S.; Corbett, D. Nevrobeskyttelse etter flere dager med mild, medikamentindusert hypotermi. J. Cereb. Blodstrømmetab. 1996, 16.474–480. [CrossRef]

4. Fisher, M.; Feuerstein, G.; Howells, DW; Hurn, PD; Kent, TA; Savitz, SI; Lo, EH; Group, S. Oppdatering av de prekliniske anbefalingene for slagterapi, akademisk industri. Slag 2009, 40, 2244–2250. [CrossRef]

5. Liu, L.; Yenari, MA Terapeutisk hypotermi: Nevrobeskyttende mekanismer. Front. Biosci. 2007, 12, 816–825. [CrossRef]

6. Lyden, PD; Krieger, D.; Yenari, M.; Dietrich, WD Terapeutisk hypotermi for akutt hjerneslag. Int. J. Stroke 2006, 1, 9–19. [CrossRef][PubMed]

7. Klassman, L. Terapeutisk hypotermi ved akutt hjerneslag. J. Neurosci. Sykepleiere. 2011, 43, 94–103. [CrossRef]

8. Groysman, LI; Emanuel, BA; Kim-Tenser, MA; Sung, GY; Mack, WJ Terapeutisk hypotermi ved akutt iskemisk slag. Nevrosurg. Fokus 2011, 30, E17. [CrossRef] [PubMed]

9. Schwab, S.; Georgiadis, D.; Berrouschot, J.; Schellinger, PD; Graffagnino, C.; Mayer, SA Gjennomførbarhet og sikkerhet for moderat hypotermi etter massivt hemisfærisk infarkt. Hjerneslag 2001, 32, 2033–2035. [CrossRef]

10. Katz, LM; Young, AS; Frank, JE; Wang, Y.; Park, K. Regulert hypotermi reduserer oksidativt stress i hjernen etter hypoksisk iskemi. Brain Res. 2004, 1017, 85–91. [CrossRef]

11. Liu, K.; Khan, H.; Geng, X.; Zhang, J.; Ding, Y. Farmakologisk hypotermi: Et potensial for fremtidig slagterapi? Neurol. Res.2016, 38, 478–490. [CrossRef]

12. Ma, J.; Wang, Y.; Wang, Z.; Li, H.; Wang, Z.; Chen, G. Nevroprotektive effekter av medikamentindusert terapeutisk hypotermi ved sykdommer i sentralnervesystemet. Curr. Narkotikamål 2017, 18, 1392–1398. [CrossRef]

13. Calabresi, P.; Cupini, LM; Centonze, D.; Pisani, F.; Bernardi, G. Antiepileptika som en mulig nevrobeskyttende strategi i hjernens iskemi. Ann. Neurol. 2003, 53, 693–702. [CrossRef]

14. Tanaka, T.; Litofsky, NS Antiepileptiske legemidler ved pediatrisk traumatisk hjerneskade. Ekspert Rev. Neurother. 2016, 16, 1229–1234.[CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com