Immunstimulerende antistoffkonjugater fremkaller robust myeloidaktivering og holdbar antitumorimmunitet (del 1)

Ta kontakt for å lære mer infodavid.wan@wecistanche.com

Abstrakt

Medfødte mønstergjenkjenningsreseptorer, inkludert toll-lignende reseptorer (TLR), kan endre tumormikromiljøet og prime adaptiv antitumorimmunitet.Imidlertid har TLR-agonister ikke blitt godt tolerert på grunn av toksisitet assosiert med utbredt immunaktivering etter systemisk administrering.Å designe et terapeutisk middel som er egnet for systemisk levering ogsom er i stand til å fremkalle en tumormålrettet respons, utviklet vi en ny klasse av immunstimulerende antistoffkonjugater (ISACs) som omfatter en TLR7/8-agonist konjugert til tumormålrettede antistoffer.Systemisk administrerte anti-HER2 ISAC-er ble godt tolerert in vivo og fremkalte robust aktivering av intratumorale myeloidceller, noe som resulterte i tumorclearance og påfølgende immunologisk hukommelse.In vitro-styrke og in vivo-effekt krevde tandemaktivitet drevet av intakt Fc-funksjonalitet og TLR-agonisme for å muliggjøre fagocytose og T-cellemediert antitumorimmunitet.ISAC-mediert immunologisk hukommelse var ikke begrenset til HER2, da ISAC-behandlede mus ble beskyttet mot gjenutfordring med en HER2-negativ svulst.Disse resultatene gir en sterk begrunnelse for den kliniske utviklingen av ISAC-er og viser at synergi mellom Fc R og TLR7/8-signalering bidrar til mekanismen for ISAC-mediert antitumorimmunitet.

Klikk her for å lære mer om Cistanche

Introduksjon

Før slutten av 1900-tallet hadde kreftpasienter generelt tre tilgjengelige behandlingsformer: kirurgisk reseksjon, stråling og kjemoterapi. Fremveksten av kreftimmunterapi la til en kraftig fjerde modalitet som i stor grad utvidet det onkologiske repertoaret, som startet med godkjenningen av rituximab for non-Hodgkins lymfom og utvidet seg til den utbredte bruken av sjekkpunkthemmere 1,2. Imidlertid er enhver terapi, inkludert immunterapi, tidsmessig begrenset med mindre den frembringer varige biologiske og immunologiske responser som overvinner tumorheterogenitet og mutasjonsbyrde 3–5. Sjekkpunkthemmere som anti-PD-1- og PD-L1-antistoffer forbedrer resultatene dramatisk i flere indikasjoner, inkludert hos pasienter med høy tumormutasjonsbelastning eller mikrosatellitt-ustabilitet, og en bestemmende faktor for tumorfølsomhet for sjekkpunktimmunterapi er omfanget av pre -eksisterende T-celle infiltrasjon. Pasienter med "kalde" svulster som har et sparsomt T-celleinfiltrat er mindre responsive på sjekkpunktblokade og har dårligere prognoser sammenlignet med pasienter med "varme" svulster der immunsupprimerte tumorreaktive T-celler er tilstede i tumormikromiljøet (TME) 6,7 . Tumorbiopsi og immunhistokjemi indikerer at profesjonelle antigenpresenterende celler (APCs) som dendrittiske celler (DCs) ofte er hyppigere i TME enn T-celler, men fortsatt mottakelige for immunsuppressive mekanismer 8,9. Gitt tilstedeværelsen av myeloide celler i TME og deres rolle i å fremme T-celleaktivering, har det vært en økende innsats for å utvikle terapier som aktiverer tumorassosierte APCer for å fremkalle utbredt T-celleimmunitet og en effektiv antitumoral immunrespons.

Figure 1: ISAC Design and Characterization. (a) Chemical structure of T785 (b) HEK-Blue-TLR7 or TLR8 reporter cells were cultured for 18 hours in the presence of T785, R848, or Poly-ICLC before the assessment of NF-κB- induced SEAP activity. Data shown are from 8 experiments and EC50 values are calculated as mean with SEM. (c) Freshly isolated human myeloid APCs were stimulated with 1 μM of T785 or R848 for 18 hours before the assessment of myeloid activation by flow cytometry. Data are from 1 experiment with 3 donors and are representative of >9 givere. (d) Rituximab ble reagert med SATA via lysinrester for å konvertere frie aminer til beskyttede sulfhydrylgrupper før deacetylering med hydroksylamin og påfølgende reaksjon med T785-MCC for å gi rituximab-ISAC. (e) LC-MS-analyse av rituximab-ISAC etter PNGase F-behandling. DAR ble beregnet basert på linker-agonist-massetilsetningen på 606 g/mol. (f) Fluorescensmerket rituximab eller rituximab-ISAC ble inkubert med CD20 pluss Toledo tumorceller ved 4 grader i 2 timer før analyse via flowcytometri. Data er fra 1 eksperiment med trippelprøver og er representative for 2 eksperimenter.(gh) Nyisolerte humane myeloide APC-er ble dyrket med rituximab, T785, rituximab og T785 eller rituximab-ISAC i nærvær av CFSE-merket CD20 pluss Toledo-tumorceller i et 3:1 effektor-til-mål-forhold. Rituximab-konsentrasjonen er avbildet på X-aksen med konsentrasjonen av T785 i disse analysene som samsvarer med mengden av T785

conjugated to the rituximab-ISAC. (g) Hoffman modulation contrast microscopy showed at 40X magnification after (g) 18 hours following stimulation with 80 nM of rituximab-ISAC. Data are representative of >10 donors. (h) Myeloid APCs were analyzed via flow cytometry 18 hours after stimulation. Data shown are from 3 donors and are representative of >10 givere (gjennomsnitt og SEM); *P<0.05,><0.01,><0.001,><>

Det er nå godt dokumentert at lokal levering av immunstimulerende midler i prekliniske modeller kan omprogrammere undertrykte tumorresidente APCer til aktiverte celler som er i stand til å behandle og presentere tumorassosierte antigener, inkludert neoantigener, til T-celler som deretter medierer antitumorimmunitet 10–13 . En slik strategi utviklet av Carmi et al. demonstrerte at intratumoral levering av allogene tumormålrettede antistoffer med en Toll-lignende reseptor (TLR)-3 agonist eller med TNF og CD40L funksjonelt reddet tumorassosierte APCer som fører til forbedret antigenopptak og påfølgende induksjon av anti-tumor T-celle immunitet. Denne kombinasjonsstrategien, som utnyttet antistoffeffektorfunksjonen med TLR-agonist, førte til å utrydde primære svulster og metastatiske lesjoner og beskyttet verten mot tilbakefall av tumor 11,14. Tilsvarende, et agonistisk anti-OX40-antistoff i kombinasjon med en TLR9-agonist, CpG, aktiverte APC-er og T-celler i svulsten, noe som resulterer i imponerende effekt mot flere tumortyper hos mus 13. Den effektive oversettelsen av APC-aktiveringsstrategier til klinikken blir undersøkt i flere indikasjoner med kliniske data hos pasienter med melanom som tyder på at intratumoral levering av TLR9-agonister i kombinasjon med anti-PD-1-antistoff kan føre til tumorkrymping og abskopale responser i ikke-injiserte lesjoner 15. Tilsvarende kan flere grupper forfølger TLR7/8-agonister for tumorimmunterapi, da ekspresjonsmønsteret til TLR7/8 i humane APC-er gjenspeiler ekspresjonsmønsteret til TLR7 og TLR9 i murine APC-er16–18 nærmere. Til syvende og sist vil bruken av intratumorale leveringsstrategier, hvis de er effektive, begrenses av tumortilgjengelighet ettersom systemisk levering av immunagonister rettet mot APC-er har blitt begrenset av toksisitet, korte halveringstider og suboptimal levering til målsteder.Målet vårt var å designe et immunstimulerende antistoffkonjugat (ISAC) som omfatter et tumormålrettet monoklonalt antistoff konjugert til en immunagonist som en ny terapeutisk tilnærming for å fremkalle varig antitumorimmunitet. Systemisk administrasjon av ISAC fremkalte lokalisert APC-aktivering i TME som var avhengig av Fceffektorfunksjon og TLR-aktivering mens man omgår typiske toksisiteter assosiert med systemisk levering av TLR-agonister. Systemisk administrering av disse konjugatene til tumorbærende mus muliggjorde dessuten antigenbehandling og presentasjon til T-celler som førte til vedvarende antitumorimmunitet i flere modeller som er resistente mot det ukonjugerte tumormålrettede antistoffet.

Resultater

ISAC-design og karakterisering For å muliggjøre konjugering av en TLR-agonist til et antistoff, ble molekylære dockingverktøy brukt for å designe en ny TLR7/8-agonist (T785) med et butylamin som fungerte som et løsningsmiddeltilgjengelig festepunkt til antistoffet ( Figur 1A, tilleggsfigur 1A–C). T785 engasjerte human TLR7 med en EC50 på 0,643 μM og human TLR8 med en EC50 på 1,60 μM i HEK293-cellelinjer som samuttrykker en NF-κB-induserbar utskilt alkalisk fosfatase-reporter og enten (8BLR7- eller TLR-Figure TLR7) ). Spesifisiteten til T785 for TLR7/8 ble bekreftet av manglende evne til T785 til å indusere NF-KB-aktivitet i HEK293-reporterceller som mangler TLR7/8-ekspresjon (tilleggsfigur 2A). For å bekrefte agonistisk aktivitet i primære celler, ble ferske isolerte monocytter og DC-er, kalt myeloide APC-er (~96 prosent monocytter, 4 prosent DC; Supplerende figur 3A), som uttrykker både TLR7 og TLR8, stimulert over natten med 1 μM T785 eller R848, en veletablert og karakterisert TLR7/8 agonist 19. T785 og R848 stimulerte myeloide APCer i tilsvarende grad (Figur 1C) 20,21. Aktiviteten til T785 ble også bekreftet i nylig isolerte humane plasmacytoid DCs (pDCs), som uttrykker TLR7, men ikke TLR8 (tilleggsfigur 2B). For å undersøke effekten av ISAC-er i humane in vitro-kulturer, ble en ISAC generert med rituximab (figur 1D), et klinisk validert anti-CD20 monoklonalt antistoff brukt til behandling av B-celle-maligniteter, ved konjugering til T785 i en flertrinnsreaksjon med kompatible heterobifunksjonelle tverrbindere 22. T785-ISAC-konjugeringseffektivitet ble målt ved LC-MS etter deglykosylering med PNGase F, noe som resulterte i et gjennomsnittlig medikament-til-antistoff-forhold (DAR) på 1,71 (figur 1E). Vi bekreftet at ISAC beholdt sammenlignbar binding til CD20 etter flowcytometrieksperimenter med CD20- som uttrykker Toledo tumorcellelinje, en godt karakterisert cellelinje avledet fra en pasient med diffust storcellet lymfom (Figur 1F) 23. T 785-ISAC-binding til humane Fc-reseptorer (FCGR3A, FCGR2A, FCGR2B, FCGR1) ble vurdert av Biacore og var sammenlignbar med rituximab (tilleggstabell 1). ISAC-er aktiverer humane myeloide APC-er.Det immunstimulerende potensialet til rituximab T{{77 }}ISAC ble vurdert etter samdyrking av nyisolerte humane myeloide APCer med CFSE-merket CD20 pluss Toledo tumorceller i 18 timer. Myeloide APC-er dyrket med rituximab T785-ISAC gjennomgikk raske morfologiske endringer i samsvar med morfologien til DC-er, mens DC-morfologi ikke var observert i kokulturer inkubert med rituximab, T785 eller en ekvimolar blanding av rituximab og T785 (Figur 1G). APC-er stimulert med rituximab T785-ISAC forble levedyktige og dendritiske i morfologien i opptil åtte dager, mens APC-er stimulert med blandingen stort sett ikke var levedyktige på dag åtte (figur 1H). Flerfarget flowcytometrianalyseetter 18 timer indikerte at APC-er stimulert med rituximab T785-ISAC nedregulerte CD14 og CD16 og samtidig oppregulerte CD123, en celleoverflatemarkør vist åvære oppregulert på aktiverte myeloide DC-er 24. Motsatt vil APC-er stimulert med rituximab,T785 eller blandingen modulerte ikke uttrykket av disse markørene (figur 1I, tilleggsfigur 4A, portstrategi beskrevet i tilleggsfigurene 3BC).

Humane APC-er stimulert med rituximab T785-ISAC oppregulerte også costimulerende molekyl-CD86 på en doseavhengig måte, med lignende trender observert med CD40- og HLA-DR-oppregulering i samsvar med fenotypen til aktiverte APC-er (Figur 1I) & Supplerende figur 4B). Doseavhengige endringer i overflatemarkøruttrykk var konsistente enten de ble vurdert som median fluorescensintensitet (MFI, figur 1) eller som prosenten av den totale populasjonen av celler som er positiv for den respektive markøren (tilleggsfigur 5). Påfølgende analyse av cellefrie supernatanter viste at rituximab T785-ISAC-stimulerte APC-er utskilte større mengder TNF og IL-1 (figur 2J og tilleggsfigur 4C). Det immunstimulerende potensialet til T785-ISAC-er var ikke begrenset til rituximab, da en T785-ISAC generert med trastuzumab også fremkalte forbedret myeloidaktivering (tilleggsfigur 4D). Kapasiteten til ISAC-stimulerte APC-er til å fremkalle antigenpresentasjon og krysspriming av CD8 pluss T-celler ble vurdert ved å bruke ovalbumin (OVA) modellantigensystemet 25,26. Milt-CD11c pluss DC-er isolert fra villtypemus ble dyrket over natten med immunkomplekser dannet med OVA og enten anti-OVA-antistoffet eller ISAC. OVA-lastede DC-er ble kvantifisert og inkubert med OT-I CD8 pluss T-celler som bar TCR-spesifisitet for OVA-peptidet, SIINFEKL, kompleksbundet med MHC-I. Anti-OVA ISAC-mediert forsterket krysspresentasjon, målt ved mengden MHC-I, bundet SIINFEKL-peptid og forsterket krysspriming målt ved CD8 pluss T-celleproliferasjon (Supplerende figurer 6A og 6B). ISAC-er fremkaller amplifisert TLR og Fc R-assosiert intracellulær signalering i humane myeloide APC-er. Aktivering av Fc R-er og TLR-er induserer en kompleks fosfo-signaleringskaskade, og størrelsen og karakteristikkene til disse responsene er forskjellige mellom forskjellige immuncelleundergrupper 27. Vi undersøkte nedstrøms intracellulære signalveier involvert i forskjellige celletyper i PBMC-tumor-kokulturer stimulert med rituximab T785-ISAC sammenlignet med ekvimolare blandingskontroller ved bruk av massecytometri (CyTOF) 28. Leukocytt-undergrupper (dvs. monocytter, CD4 pluss T-celler) ble identifisert via SPADE-klynger ved bruk av linjemarkører med målceller som omfatter både CD20 pluss Toledo tumorceller og friske B-celler 29. Fosforyleringshendelser assosiert med TLR (pIRF7) og Fc R (pERK1/2) signalering ble økt 15 minutter etter stimulering med T785-ISAC i monocytter og cDC-er, sammenlignet med den individuelle komponentblandingen 30,31. Intracellulær signalering var i stor grad begrenset til celler av myeloid opprinnelse (monocytter og cDC-er) samt pDC-er, somalle uttrykker de nødvendige Fc Rs og TLR7 og/eller TLR8. I monocytter og cDC-er resulterte stimuleringen indusert av ISAC også i betydelig høyere fosforylering av MAPKAPK2, p38, CREB og ribosomalt protein S6 (RPS6), et krav for å starte nedstrøms proteinsyntese (figur 2A–C og tilleggsfigur 7A). CD141 pluss cDCs og CD1c pluss cDCs viste sammenlignbare nivåer av pIRF7 på tvers av begge CDC-undergruppene, mens nivåene av RPS6 og pERK1/2 viste høyere trender i CD141 pluss cDCs, som utmerker seg i CD8 pluss T-celle-priming og antigenkrysspresentasjon, sammenlignet med CD1c pluss cDC-er (tilleggsfigur 7B).

Kinetikken til T785-ISAC-stimulering var i samsvar med forventet signaldynamikk: ERK1/2-fosforylering nådde en topp etter 5 minutter, mens dens nedstrømspartner RPS6 ikke nådde toppfosforylering før 15-minutttidspunktet (tillegg Figur 7C). Denne kinetikken støtter forventet dynamikk når signalering forplanter seg over tid, og antyder at det er en vedvarende og forsterket signalrespons på ISAC-stimulering av APC-er. Gitt den forsterkede responsen observert etter ISAC-stimulering assosiert med Fc R- og TLR-signalveier, brukte vi deretter algoritmene for betinget tetthet omsamplet estimat av gjensidig informasjon (DREMI) og betinget tetthet omskalert visualisering (DREVI) for å kvantifisere styrken til parvise relasjoner innen Fc R- og TLR-signalveiene 32. Disse algoritmene genererer DREVI-plott for visualisering, der arealet under kurven (AUC) er en indikator på den totale signalintensiteten, bøyningspunktet (IP) er et mål på aktiveringsterskelen, og DREMI-score kvantifiserer den parvise avhengigheten til de to aktuelle fosfoproteinene. Denne analysen identifiserte økte DREMI-score som indikerer forbedret parvis avhengighet mellom proteiner assosiert med Fc R- og TLR-signalveier etter T785-ISAC-stimulering sammenlignet med de ekvimolære blandingskontrollene (figur 2D). En sterk gjensidig avhengighet mellom pERK1/2 og pIRF7 ble unikt observert etter stimulering med T785-ISAC, men ikke blanding, som indikert av en økt DREMI-score, forsterket signalintensitet og redusert aktiveringsterskel som kreves for IRF7-fosforylering (Figur 2D ). Denne analysen indikerte også en redusert aktiveringsterskel som kreves for å initiere proteintranslasjon (RPS6-fosforylering) etter ISAC-stimulering som kvantifisert ved økte DREMI-score og reduserte IP-er for de parvise kombinasjonene av pERK1/2-pRPS6 og pIRF7-pRPS6 . Videre ble nivået av RPS6-fosforylering amplifisert som et resultat av ERK1/2- eller IRF7-fosforylering som bestemt ved økte parvise AUC-er (figur 2D). Disse kombinerte resultatene bekrefter ikke bare signaleringen av ISAC gjennom de forventede Fc R- og TLR-banene, men støtter videre synergi mellom de to banene, noe som resulterer i reduserte aktiveringsterskler og forsterkede signalintensiteter.

Figur 3: ISAC-er krever Fc-effektorfunksjon og TLR-agonist for å mediere myeloid aktivering. Nyisolerte humane myeloide APC-er ble dyrket i 18 timer i nærvær av CD20 pluss Toledo-tumorceller i et effektor-til-mål-forhold på 3:1 og (a) 80 nM av rituximab-ISAC med eller uten 1 μM R406, (b) rituximab-ISAC på den angitte antistoffisotypen, (c) rituximab-ISAC eller deglykosylert rituximab-ISAC (ISAC-deglykosylert). (ac) Celler ble analysert ved flowcytometri og data er rapportert som median fluorescensintensitet. (d) HEK-Blue-TLR7- eller TLR8-reporterceller ble dyrket i 18 timer i nærvær av T785 eller TLRnull før vurderingen av NF-KB-indusert SEAP-aktivitet. Data vist erfra 1 eksperiment og representativ for minst 3 eksperimenter. (e) Nyisolerte humane myeloide APC-er ble dyrket i 18 timer i nærvær av CD20 pluss Toledo-tumorceller og de indikerte rituximab-ISAC-ene og analysert ved flowcytometri (data vist som medianfluorescensintensitet). (ae) Dataene som vises er representative for 1-4 ekstra eksperimenter og større enn eller lik 3 givere for hvert eksperiment (gjennomsnitt og SEM). Statistisk signifikans er definert som *P<0.05,><0.01,><0.001,><>

ISAC-er krever Fc-effektorfunksjon for å mediere aktivering av myeloide APC-er. Bidraget fra Fc-aktivitet til ISAC-funksjonen ble undersøkt etter ablasjon av nedstrøms Fc R-signalering med R406, en liten molekyl-kinasehemmer av Syk som forhindrer signaloverføring nedstrøms for den aktiverende Fc Rs 33,34 . Tilsetningen av R406 opphevet T785-ISAC-mediert myeloid aktivering som bevist av mangelen på oppregulering av det costimulerende molekylet CD86, men endret ikke den cellulære responsen på TLR7/8-aktivering av T785 (Figur 3A) & Supplerende figur 8). Syk-hemming med R406 opphevet også signalering ble observert i monocytter etter T785-ISAC-stimulering, medbetydelig reduserte nivåer av fosforylert MAPKAPK-2, ERK1/2 og IRF7 målt (tilleggsfigur 7D).Gitt disse dataene ble rituximab T785-ISAC-er formulert med sammenlignbare DAR-er på hver av de fire naturlig forekommende isotypene for å definere i hvilken grad T785-ISAC-aktivitet varierer med kjente Fc R-bindingsaffiniteter 35,36. Aglykosylerte og fukosylerte rituximab ISAC-er ble også undersøkt, ettersom glykosylering fjerner Fc R-binding mens fukosylering øker bindingsaffiniteten for FCGR3A 37. Den immunstimulerende kapasiteten til rituximab T785-ISAC korrelerte med Fc R-affiniteten til antistoffet (figuren er antistoffet). 3B). Omvendt fremkalte fukosylerte IgG1 (IgG1-AF), villtype IgG1 og IgG3 T785-ISAC-er myeloide aktivering, med IgG1-AF T785-ISAC som induserte den høyeste nivåer av CD86-oppregulering (figur 3B). Deglykosylering av villtype rituximab T785-ISAC med PNGase F, som reduserer Fc-Fc R-bindingsaffiniteten, resulterte i redusert ISAC-immunstimulerende aktivitet in vitro, noe som støtter viktigheten av en funksjonelt aktiv Fc-region (figur 3C).

ISAC-er krever TLR-agonisme for å mediere myeloid aktivering. Bidraget til TLR-aktivitet på ISAC-funksjonen ble undersøkt etter ablasjonen av TLR-agonisme ved å fjerne 2-aminopyridinen fra T785 som antas å danne en saltbro med kritiske aspartatrester i bindingen lommer av TLR7 og TLR8 38 (TLRnull, figur 3D). TLRnull-forbindelsen ble konjugert til rituximab (TLRnull ISAC) og vurdert for myeloid aktiveringspotensial i nærvær av CD20 pluss tumorceller in vitro. TLRnull ISAC induserte ikke oppregulering av costimulatorisk molekyl CD86 eller modulerte uttrykket av CD14 eller CD123, noe som indikerer at TLR-agonisme er nødvendig for aktiveringsfenotypen observert med T785-ISACer (Figur 3E). Videre induserte ikke TLRnull ISAC fosforylering av IRF-7 i monocytter, i samsvar med dens manglende evne til å engasjere TLR7/8 (tilleggsfigur 7E). Systemisk administrert trastuzumab T785-ISAC eliminerer svulster i fravær av B-, T- eller NK-celleaktivitet i humane xenograft-tumormodeller Evnen til ISAC-er til å indusere myeloid- og neutrofil-mediert ødeleggelse av solide tumorer i fravær av B-, T- og NK-celleaktivitet ble vurdert ved bruk av humane xenograft-modeller 39,40. Trastuzumab, et klinisk validert HER2-målrettingsantistoff, ble valgt ut for undersøkelsen for å avgjøre om trastuzumab T785-ISAC kunne overvinne tumorresistens mot trastuzumab i HER2 pluss solide svulster-modeller (figur 4 og tilleggsfigur 9) ) 41,42. Først ble systemisk administrering av trastuzumab T785-ISAC sammenlignet med intratumoral levering av en blanding av trastuzumab og T785. Trastuzumab T785-ISAC provoserte tumorregresjon og clearance, mens levering av en ekvimolar blanding av komponenter ga minimal terapeutisk fordel sammenlignet med trastuzumab alene (figur 4A). Påfølgende studier som sammenlignet tumormålrettede ISACer med deres passende isotypekontroller bekreftet at antitumoraktivitet krevde tumormålretting (figur 4B og tilleggsfigur 10). Det er viktig at systemisk administrering av trastuzumab T785- ISAC og dens isotypekontroll ble godt tolerert, med minimal innvirkning på kroppsvekten (tilleggsfigur 11).For å bestemme om virkningsmekanismen som bidrar til ISAC-effekten in vivo er lik den som er beskrevet in vitro, ble Fc-inkompetente (trastuzumab N297A-ISAC) og trastuzumab TLRnull-ISACer testet i samme brysttumor xenograft-modell iparallelt med en villtype trastuzumab T785-ISAC.Mens trastuzumab T785-ISAC førte til tumorregresjon og -clearance, klarte ikke både Fc-inkompetente og TLRnull ISACs å fremkalle antitumoraktivitet (figur 4C).Sammen indikerer disse dataene et krav for tumormålretting og både Fc R- og TLR-engasjement for ISAC-antitumoraktivitet.

Det differensielle bidraget til nøytrofiler versus andre myeloide celler i å formidle antitumoreffekter ble vurdert ved cellespesifikke uttømminger.Nøytrofiler ble utarmet ved bruk av et Ly6G-antistoff, mens uttømming av både nøytrofiler og umodne APC-er (monocytter)ble oppnådd med et anti-Gr1-antistoff.Fagocytiske celler ble tømt ved bruk av klodronatbelastede liposomer.Vi fant at fagocytiske celler, antagelig makrofager, bidro betydelig til å formidle antitumoraktivitet etter ISAC-behandling (Figur 4D).Imidlertid hadde nøytrofildeplesjon med anti-Ly6G ingen innvirkning på ISAC-effekten.Gr1-uttømming påvirket ikke umiddelbart ISAC-mediert effekt, men reduserte varigheten av tumorkontroll (figur 4D).For å undersøke evnen til T785-ISAC-er til å kontrollere tumorvekst i modeller med lavereHER2-uttrykk, modellerte vi neste effekt i den trastuzumab-resistente, HER2-mediumuttrykkende tumormodellen, JIMT-1.JIMT-1 kreftcellelinjen anslås å ha omtrent 6,5 x 105 kopier av overflate HER2 og uttrykker et redusert nivå avHER2 sammenlignet med HCC1954 tumorcellelinjen ved flowcytometri 43.Menstrastuzumab T785-ISAC reduserte tumorveksten signifikant sammenlignet med isotypen ISAC eller trastuzumab-kontroller, ingen tumorregresjon eller -clearance ble observert (Figur 4E).Vi antok at pertuzumab, som binder en HER2-epitop som er forskjellig fra trastuzumabs bindingssted, ville øke Fc-clustering, og deretter øke ADCP og effektiviteten til ISAC i JIMT-1-modellen.Kombinasjonen av trastuzumab T785-ISAC med pertuzumab førte til betydelig forbedret effekt og signifikant tumorregresjon (figur 4F).Uten immunstimulering av trastuzumab T785-ISAC ga kombinasjonen av pertuzumab og trastuzumab ingen fordel.

Vi undersøkte deretter de molekylære og cellulære hendelsene utløst av trastuzumab T785-ISAC som til slutt resulterer i antitumoreffekt.Tidlige endringer i genuttrykk i svulsterble målt med NanoString musepan-kreft immunprofileringspanel, og avslørte en betydelig oppregulering av 13,7 prosent av genene innen 24 timer etter behandling, inkludert gener assosiert med TLR7-signalering og aktivering (IRF-7, NF-kB-assosierte gener)sammenlignet med 0-0,1 prosent etter trastuzumab- eller isotype T785-ISAC-behandling (Figur 4G) 44.Analyse av genekspresjonsveier vurdert av nSolver Advanced Analysis Pathway Score avslørte betydelig oppregulering av viktige immunrelaterte gensignaturer (makrofagefunksjoner, DC-funksjoner, antigenbehandling og presentasjon) som vari samsvar med in vitro og in vivo funnene om at Fc-Fc R-interaksjoner er kritiske for ISAC-mediert aktivitet (figur 4H og tilleggsfigur 12).Gensignaturskår assosiert med kjemokiner og cytokiner var svært forhøyet etter trastuzumab T785-ISAC-behandling, i samsvar med proteinkvantifisering utført for måling av cytokin- og kjemokinsekresjon innen svulsten 24 timer etter administrering (Figur 4H)og tilleggsfigur 13).Disse funnene, i samsvar med in vitro og in vivo effektdata, indikerer at en robust TLR- og Fc R-mediert respons induseres av ISAC.

Flowcytometri og IHC ble brukt for å vurdere om økt T785-ISAC-mediert aktivering og kjemokinekspresjon til slutt førte til rekruttering av immuneffektorceller.Myeloide immuninfiltrater ble profilert ved flowcytometri 24 timer og 7 dager etter administrering av en enkelt dose trastuzumab T785-ISAC eller trastuzumab og sammenlignet med ubehandlede kontroller.Analyse av svulster 24 timer etter behandling avslørteinfiltrasjon av CD11b pluss Ly6C pluss monocytter og CD11b pluss Ly6G pluss granulocytter i svulstene behandlet med trastuzumab eller trastuzumab T785-ISAC sammenlignet med de ubehandlede kontrollene (Figur 4I).Syv dager etter behandling var CD11b pluss CD11c pluss F4/80 pluss positive myeloide APC signifikant økt i den trastuzumab T785-ISAC-behandlede gruppen sammenlignet medtrastuzumab eller ubehandlede kontroller (Figur 4I) 45,46.Denne økningen i myeloide APC kan væretilskrives den betydelige økningen i produksjonen av myeloid-relaterte kjemokiner etter trastuzumab T785-ISAC-behandling.Selv om det ikke var en signifikant økning i frekvensen av myeloid APC ved 24-timetidspunktet, ble celler av denne fenotypen aktivert etter trastuzumab T785-ISAC-behandling, målt ved oppregulering av CD40 på celleoverflaten sammenlignet med samme populasjon fra trastuzumab eller ubehandlede kontroller (figur 4I).Dette funnet, sammen med NanoString-dataene, demonstrerer ytterligere trastuzumab T785-ISACs evne til å engasjere og aktivere myeloide celler i tumormikromiljøet.Gitt CD11b-positiviteten til de myeloide APC-ene observert en uke etter behandling, kan det tidlige infiltratet av monocytter være forløpere til den myeloide APC-populasjonen som modnes i ISAC-behandlede svulster, men ikke i trastuzumab-behandlede svulster.Det gjenstår imidlertid å fastslå hvordan de pro-inflammatoriske proksimale hendelsene målt 24 timer etter ISAC-stimulering av NanoString og MSD til slutt påvirket distale hendelser som modning av myeloide celler i det transformerende tumormikromiljøet på det senere 6-tidspunktet på dagen , og til slutt påvirket tumorregresjon og -clearance.
Til slutt ble IHC utført for å vurdere tilstedeværelsen og plasseringen av viktige immuncellepopulasjoner i svulsten etter behandling med trastuzumab T785-ISAC sammenlignet med kontrollene.I samsvar med dag 7 flowcytometri, F4/80 uttrykker celler isvulsten og peritumoralregionen ble forhøyet på dag 9 etter en enkelt behandling med trastuzumab T785-ISAC (Figur 4J).Videre resulterte målrettet ISAC-behandling i en dramatisk økning i CD11c pluss-celler i den peritumorale regionen som ikke ble sett etter rHER2-antistoffbehandling eller behandling med isotype eller isotype-ISAC (Figur 4J).Økningen i CD11c pluss-celler ved både flowcytometri og IHC ble også påvist i NanoString-data, der mRNA-ekspresjon av ITGAX var signifikant forhøyet på dag 6 og 9 etter administrering av trastuzumab T785-ISAC (tilleggsfigur 14).

Figur 5: T785-ISAC-er fremkaller robuste antitumoreffekter i MMC-syngenisk tumormodell. (ah) FVB/N-TgN (MMTV-Erbb2) mus ble implantert med MMC tumorcellelinjen. (a) Hunnmus ble randomisert når tumorvolumet nådde omtrent 500 mm3. Mus ble deretter behandlet via intraperitoneal injeksjon med 5 mg/kg q5d x 2 mus anti-rotte HER2 antistoff, mus anti-rotte HER2 T785-ISAC eller isotype T785-ISAC (TA99) (n) =4-7 mus per arm). (b, c) Hannmus ble randomisert når tumorvolumet nådde ca. 500 mm3 og ble forhåndsbehandlet med start en dag før den første behandlingsdatoen med klodronatladede eller kontrollliposomer for fagocyttutarming (6 sykluser, gjennom dag 15) eller anti -CD8 depleting antibody (rIgG2b control) for CD8 T cell depletion (8 cycles, through Day 21). Animals were treated with 5 mg/kg rHER2 T785-ISAC q5d x 2 (n=6 mice per group) intraperitoneally. For phagocyte depletion, statistics reflect a comparison of T785-ISAC treatment with clodronate or control liposomes, while for CD8 T cell depletion, statistics reflect a comparison of T785-ISAC with T785-ISAC + CD8 Depletion or T785-ISAC + rat isotype IgG2b. (d) Anti-rHER2 T785-ISAC treated mice that experienced complete tumor regression for >60 dager etter deres siste behandling ble utfordret med MMC-svulstcellelinjen. Tumornaive mus fungerte som implantasjonskontroller (n=5 mus per gruppe). (ad) Data er representative for minst 2 eksperimenter. Mus ble humant avlivet en gang svulsternådde 2,000 mm3. Data er vist for de gruppene der ingen svulster hadde nådd2,000 mm3. (ei) Kohorter av mus ble randomisert når MMC-svulster tumorvolumer nådde ca. 500 mm3 og behandlet med 5 mg/kg ISAC eller kontrollantistoffer dosert på dag 0 og dag 5. Tumorer ble behandlet for cytokinmåling med MSD , flowcytometrianalyse, NanoString mRNA kvantifisering, eller formalinfiksert og parafininnstøpt forimmunhistokjemi på de viste tidspunktene. (e) Vulkanplott viser log2 ganger endring av genuttrykk i behandlede kontra isotypekontrolltumorer målt med NanoString etter 24 timer (n=5 mus per gruppe). Endringer med en justert p-verdi på < 0.05="" vises="" i="" rødt.="" (f)="" gensignaturskåre="" kvantifisert="" av="" nsolver="" advanced="" analysis="" pathway="" score="" for="" svulster="" analysert="" 24="" timer="" etter="" behandling="" (n="5" mus="" per="" gruppe).="" (g,="" h)="" flowcytometrianalyse="" av="" tumorcellesammensetning="" og="" aktiveringstilstand="" 24="" timer="" og="" 6="" dager="" etter="" oppstart="" av="" behandling="" (n="4" mus="" per="" gruppe).="" data="" er="" representative="" for="" minst="" 2="" eksperimenter.="">Representative bilder samt kvantifisering av F4/80, CD11c og CD8 IHC av svulster høstet 6 dager etter hver indikerte behandling. Målestokkene er 50 μm. (ai) Data rapporteres som gjennomsnitt og SEM; *P<0.05,><0.01,><0.001,><>

Tumormålrettede T785-ISAC-er fremkaller tumorregresjon i den syngene MMC-tumormodellen
For å vurdere kapasiteten til ISAC-er til å formidle anti-tumor-effektivitet i nærvær av B-, T- og NK-celler, brukte vi en syngenisk rotte HER2 (rHER2)-uttrykkende musebrystkarsinom (MMC) cellelinje som ble avledet fra et spontant bryst. karsinom i rHER2--uttrykkende FVB-mus.For å minimere immunogenisitet på tvers av arter assosiert med rHER2-ekspresjon i MMC, transgene mus som endogent uttrykker rotte Her2 under kontrollav MMTV-promotoren ble brukt som vert (tilleggsfigur 15) 47. Ved å utnytte tilstedeværelsen av et fullstendig intakt immunsystem, hadde vi som mål å vurdere ISACs evne til å bekjempe svulster med en stor svulstbelastning på 500 mm3, ettersom større svulster generelt er vanskeligere å behandle i prekliniske modeller 48. Systemisk administrering av alle behandlingene, inkludert rHER2 T785-ISAC, ble godt tolerert, med minimal innvirkning på kroppsvekten (tilleggsfigur 16A). Bare rHER2 T785-ISAC var imidlertid i stand til å kurere mus som hadde store, etablerte svulster (figur 5A). Som det ble sett i xenograft-modellen, viste celledeplesjonsstudier at betydelig antitumoraktivitet gikk tapt når fagocytiske celler ble utarmet med klodronatbelastede liposomer (figur 5B). Mens ISAC ikke forventes å virke direkte på T-celler, mistet mus forhåndsbehandlet med et CD8-utarmende antistoff evnen til å fjerne svulster etter to administreringer av rHER2 T785-ISAC (Figur 5C). Dette antyder tumormålrettede ISAC-er kan virke indirekte gjennom T-celler, etter presentasjonen av tumorassosierte antigener. I samsvar med tilstedeværelsen av immunologisk minne, muskurert av MMC-svulster etter rHER2 T785-ISAC-behandling ble beskyttet mot gjenutsatt tumor (figur 5D).

For ytterligere å undersøke mekanismen som ligger til grunn for ISAC-effektiviteten i den syngene modellen, undersøkte vi deretter de cellulære, transkripsjonelle og cytokinendringene i tumormikromiljøet etter ISAC-dosering. To kohorter av mus med store MMC-svulster ble behandlet med rHER2 T785-ISAC eller kontroller. Tumorer fra den første kohorten ble høstet 24 timer etter dosering (dag 1) når alle svulstene var av samme størrelse (tilleggsfigur 16B). Den andre gruppen ble gitt en ny dose 5 dager etter den første, og deretter høstet 24 timer senere (dag 6), da svulster i alle behandlingsgruppene hadde vokst målbart bortsett fra de behandlet med T785-ISAC (tilleggsfigur 16B) ). Tumorer ble analysert ved IHC, mRNA-ekspresjon og cytokinsekresjon i proteinlysater. Som ytterligere støtte for observasjonene våre i xenograft-modellene om at tumormålretting er nødvendig for ISAC-aktivitet, viste mRNA-analyse av svulster 24 timer etter rHER2 T785-ISAC-behandling dramatisk oppregulering av 34,1 prosent av genene i NanoString-mus pan-cancer immune profileringspanel sammenlignet med isotypebehandlede svulster. Anti-rHER2-antistoffet alene hadde bare en liten innvirkning på genuttrykk (3,5 prosent av genene som ble analysert), mens den ikke-målrettede isotypen T785-ISAC ikke påvirket genuttrykk (Figur 5E). Som sett i HCC1954 xenograft-modellen, ble gener assosiert med TLR7-mediert signalering og aktivering betydelig oppregulert av den tumormålrettede rHER2 T785-ISAC, noe som indikerer en robust TLR-mediert respons (Figur 5E). Genekspresjonsveianalyse avslørte igjen betydelig oppregulering av viktige immunrelaterte gensignaturer, inkludert signaturer for genekspresjonsveianalyse, avslørte betydelig oppregulering av sentrale immunrelaterte gensignaturer etter rHER2 T785-ISAC-behandling, inkludert de assosiert med kjemokiner og cytokiner (figur 5F). Proteinkvantifisering ble utført på de samme svulstene som ble analysert av NanoString, og i samsvar med gensignaturfunnene ble signifikant økte nivåer av pro-inflammatoriske cytokiner og kjemokiner målt 24 timer etter rHER2 T785-ISAC-behandling (tilleggsfigur 17) ). Gensignaturskåre var også betydelig forhøyet for antigenprosessering og -presentasjon, dendritisk cellefunksjon og makrofagfunksjon, og støttet ytterligere en Fc-Fc R-mediert og fagocytosedrevet respons 24 timer etter rHER2 T785-ISACbehandling (Figur 5F og Supplerende Figur 18). I tillegg til betydelig forhøyede gensignaturskårer knyttet til en robust TLR- og Fc R-mediert respons, ble gensignaturskåren for T-cellefunksjoner også betydelig økt innen 24 timer etter rHER2 T785-ISAC-behandling, noe som ytterligere støttet finne at T-celler er nødvendige for ISAC-mediert effekt (figur 5F og tilleggsfigur 18).

For å karakterisere immuncellene som kan bidra til den tidlige økningen i proinflammatorisk cytokin- og kjemokinproduksjon, ble svulster analysert med flowcytometri 24 timer etter den første dosen av rHER2 T785-ISAC eller kontrollene, og 6 dager etter initiering av behandling, 24 timer etter en andre dose. Analyse av svulster på dag 1 avslørte infiltrasjon av CD11b pluss Ly6C pluss monocytter i svulstene behandlet med rHER2 T785-ISAC, og CD11b pluss Ly6G pluss granulocytter i svulstene behandlet med rHER2 mAb eller rHER2 T785-ISAC , men ikke isotype ISAC eller isotype antistoffkontroller (figur 5G). Nivåene av monocytter ble ytterligere økt i rHER2 T785-ISAC-behandlede svulster etter 6 dager. I likhet med det vi observerte i HCC1954 xenograft-modellen, var myeloide APC-er (CD11b pluss CD11c pluss F4/80 pluss ) signifikant forhøyet på dag 6 etter rHER2 T785-ISAC-behandling sammenlignet med kontrollene (figur 5G og tilleggsfigur 19 ). Videre ble myeloide APC-er funnet å være aktivert spesifikt i den rHER2 T785- ISAC-behandlede gruppen på begge tidspunktene, målt ved oppregulering av CD40 på celleoverflaten (figur 5H). Det er viktig at en økning i tumoral myeloid APC ikke ble målt etter fagocyttutarming ved bruk av klodronatladede liposomer (tilleggsfigur 20). Til slutt ble IHC utført for å vurdere tilstedeværelsen og plasseringen av viktige immuncellepopulasjoner i MMC-modellen etter behandling med rHER2 T785-ISAC. Som det ble sett i HCC1954 xenograft-modellen, resulterte behandling med rHER2 T785-ISAC i en dramatisk økning i CD11c pluss og F4/80 pluss celler i den peritumorale regionen som ikke ble sett etter rHER2 antistoffbehandling eller behandling med isotype eller isotype T785-ISAC (Figur 5I). I samsvar med det tidlige uttrykket av T-cellekjemokinene og den økte gensignaturskåren for T-cellefunksjon, ble signifikant infiltrasjon av CD8 pluss-celler sett av IHC i svulstene til rHER2 T785-ISAC-behandlede mus på dag 6, mens CD8-farging i mus behandlet med anti-rHER2-antistoff eller isotypekontroller forble lav (figur 5I). Økt CD8 pluss IHC-farging, sammen med amplifisert genekspresjon av T-cellefunksjonsassosierte gener og CD8-avhengig tumorclearance, støtter potensialet til T785-ISAC for å gjøre en kald svulst varm.CL{ {58}}ISAC-er fremkaller tumorregresjon i HER2-medium-uttrykkende xenograft-tumormodellFor å demonstrere at ISAC-er er en robust plattform på tvers av flere immunstimulerende nyttelaster, utviklet vi en ISAC med en velkjent TLR7-agonist, CL264 med en DAR sammenlignbar med trastuzumab T785-ISAC (figur 6A og tilleggsfigur 21). Kapasiteten til trastuzumab ISAC produsert med CL264 eller T785 til å mediere intratumoral myeloid aktivering ble vurdert i HCC1954 xenograft-modellen 24 timer etter en enkelt administrering av trastuzumab, trastuzumab CL264-ISAC eller trastuzumab T{{73}ISAC . Forbedret myeloid aktivering ble observert med trastuzumab CL264-ISAC som bevist ved økt CD40-ekspresjon på tumorinfiltrerende CD11b pluss CD11c pluss F4/80 pluss myeloid APC sammenlignet med trastuzumab eller trastuzumab T785-ISAC (Figur 6B ).For å avgjøre om den forbedrede myeloidaktiveringskapasiteten til CL264-ISAC ble oversatt til høyere antitumoraktivitet in vivo, ble trastuzumab CL264-ISAC sammenlignet medT785-ISAC i HER2High HCC1954 og HER2Med JIMT-1 tumormodellene. Mens beggetrastuzumab ISAC-er medierte fullstendig tumorregresjon i HCC1954 HER2High-modellen, CL264-ISAC viste økt antitumoraktivitet i JIMT-1 HER2Med-modellen, noe som tyder på at ISAC-styrken og evnen til å målrette svulster med lavere antigentetthet kan kobles sammen (Figur 6C–D).

Begge ISAC-ene ble godt tolerert, men vi observerte forbigående kroppsvekttap på 5-10 prosent hos dyr behandlet med enten trastuzumab CL264-ISAC eller rituximab CL264-ISAC, med kroppsvekt som ble gjenopprettet til eller over baseline ved den tredje dosen (tilleggsfigur 16A). Systemisk cytokinsekresjon ble målt etter behandling med T785-ISAC eller CL264-ISAC. Lave nivåer av TNF ble målt i serumet til dyr fire timer etter administrering av T785-ISAC, mens både målrettet og isotype CL264-ISAC fremkalte høyere nivåer av TNF-sekresjon systemisk (tilleggsfigur 11) . Det er usannsynlig at disse effektene mellom T785 og CL264 ISAC-er skyldtes en direkte innvirkning av ISAC på tumorcellevekst, da ISAC ikke hemmet kreftcelleproliferasjon in vitro (tilleggsfigur 9).

CL264-ISAC-er fremkaller tumorclearance og immunologisk hukommelse i syngene tumormodeller Gitt den økte styrken og effekten observert med CL264-ISAC i humane tumorxenograftmodeller med variert HER2-antigentetthet, karakteriserte vi deretter aktiviteten til CL 264-ISAC-er i syngene svulstermodeller. I likhet med T785-ISAC i MMC-modellen, førte CL264-ISAC til tumorregresjon og fjerning på en T-celleavhengig måte, noe som førte til varig immunologisk hukommelse (tilleggsfigur 22A). For å vurdere ISAC-effektivitet i en syngen tumormodell med redusert antigenekspresjon, utviklet vi en CT26-cellelinje som stabilt uttrykker rotte HER2 (CT26-rHER2). Viktigere er at omtrent 8,5 prosent av CT26-cellene ikke uttrykker rHER2 etter tumorimplantasjon (Figur 6E). Villtype Balb/c-mus behandlet med rHER2 CL264-ISAC viste betydelig antitumorimmunitet ved at 75 prosent (6 av 8) av musene fjernet svulstene og forble tumorfrie så lenge eksperimentet varte, mens ingen av musene behandlet med anti-rHER2-antistoffet hadde fullstendig regresjon (figur 6F). Forbigående vekttap på ca. 10 prosent kroppsvekt etter rHER2 CL264-ISAC-behandling ble observert, med kroppsvekt som ble restituert åtte dager etter oppstart av studien (tilleggsfigur 22B). Vi vurderte om rHER2 CL264-ISAC medierte immunologisk hukommelse mot en svulst som mangler ekspresjon av det målrettede antigenet, rHER2, ved å utfordre mus som tidligere var kurert for CT26-rHER2-svulster med den parentale CT26-cellelinjen som manglet rHER2 uttrykk. Mus som tidligere var kurert for CT26-rHER2-svulster med rHER2 ISAC, ble fullstendig beskyttet mot utfordring med den parentale CT26-cellelinjen (figur 6I). Uttømming av CD4- og CD8-T-celler før svulstforsøket viste at T-celler er nødvendige for beskyttelse. Til slutt testet vi om det immunologiske minnet utviklet i mus som tidligere ble kurert med ISAC var spesifikt for tumorassosierte antigener fra den primære svulsten som ble behandlet. Under den gjenopptatte CT26-svulsten ble mus samtidig utfordret med en annen svulst, 4T1, implantert i den kontralaterale flanken. Dataene viser at utviklingen av immunologisk hukommelse varspesifikke for CT26 tumorassosierte antigener forskjellig fra rHER2, da tumorvekst av 4T1-svulster ikke ble påvirket (figur 6G).