Immunmodulerende faktorer i Cistanche Salsa

Ansvarlig: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Shinjiro MARUYAMA," Koji YAMADA, Hirofumi TACHIBANA

Cistanche salsa(C.A.Mever) G.Beck, Orobanchaceae er en parasittisk plante som brukes som en orientalsk medisinsk tonic i Japan. I vår forrige studie fant vi at C, salsa ekstrakt forbedret produksjonen av både IgM og IgG i humane Ivmph node lymfocytter. Videre, C, salsa dialysat (CSD)utarbeidet ved hjelp av en dialysemembran med en a3.500-Da molekylvekt cut-off forbedret IgM produksjon i den menneskelige B-celle linje BALL-1; I tillegg induserte det liten celleproliferasjon. Men derimot induserte CSD veksthemming ledsaget av apoptose i den menneskelige Burkitts lymfomcellelinje Namalwa. Disse resultatene indikerer mulig tilstedeværelse av aktive bestanddeler i CSD som er spesifikke for lymfocytter, Så langt har de kjemiske egenskapene til disse bestanddelene ikke blitt belyst. I denne studien undersøkte vi de kjemiske egenskapene til de aktive bestanddelene i CSD. Begge de ovennevnte aktivitetene i B-cellelinjer ble ikke inaktivert ved autoklavbehandling av CSD. Ved hjelp av gelfiltreringskolonnekromatografi fant vi ut at toppene i de aktive fraksjonene var konsentrert i forskjellige fraksjoner. Våre resultater tyder på at det er minst 2 typer aktive bestanddeler i CSD, og de kan være polysakkarider siden de er vannløselige bestanddeler med høy molekylvekt og termostabil.

Søkeord: Cistanche salsa, høy molekylvekt, IgM, veksthemming.

Introduksjon

Cistanche salsa(C.A. Meyer) G.Beck, Orobanchaceae er en parasittisk plante som brukes som en orientalsk medisinsk tonic i Japan. I Kina er denne planten en viktig tradisjonell medisin som brukes til behandling av nyremangel og neurasthenia. Gjennom in vitro-studier har vi allerede rapportert effekten av C. salsa på immunsystemet. Første. vi demonstrerte at C. salsa ekstrakt forbedret produksjonen av IgM og IgG i humane lymfeknute lymfocytter. For det andre viste vi at C. salsa dialysate (CSD)utarbeidet ved hjelp av en 3500-Da molekylvekt cut-off dialyse mem-brane forbedret IgM produksjon i den menneskelige B-celle linje BALL-1; I tillegg induserte det celleproliferasjon i liten grad.2Furthermore, CSD har en motsatt effekt der det induserer veksthemming ledsaget av apoptose i den menneskelige Burkitts lymfomcellelinje, Namalwa.3)Disse funnene antydet at denne effekten av CSD var relatert til aktivering av B-celler, mens apoptose skyldes mangel på andre signaler som er nødvendig for B-celliasjon, som cytokiner og cellecellekontakt; Imidlertid ble de kjemiske egenskapene til CSD ikke belyst i noen av de tidligere studiene. Derfor undersøkte vi i denne studien de kjemiske egenskapene til de aktive bestanddelene i CSD.

Materialer og metoder

CSD ble utarbeidet ved samme metode i vår forrige studie. CSD ble oppløst i fosfatbufret saltvann (PBS) ved 20 mg/ml. Den tilberedte oppløsningen (0,8 ml) ble passert gjennom et filter (0,22 um)før påføring og deretter elutert med samme oppløsning gjennom kolonner som inneholder TOYOPEARL HW-40F (1,0×96,5 cm; Tosoh Corp, Japan),TOYOPEARL HW-55F(1,0 × 98,0 cm; Tosoh Corp., Japan) og Sephacryl S-400HR (1,0×98,0 cm; GE Healthcare UK Ltd.,. England); og 1 ml (30 dråper) fraksjoner ble deretter samlet inn. For å bestemme det tomme volumet av gelene og den omtrentlige molekylvekten (MW) av de fraksjonerte bestanddelene, blå dextran (BD)(Sigma-Aldrich Japan K.K., Japan); og dextrans av kjent MW hentet fra Leuconostoc spp.(Sigma-Aldrich Japan K.K., Japan), dvs. og cyanokobalamin (VB12, MW:1355.4)(Wako Pure Chemical Industries Ltd., Japan) ble brukt. Det totale sukker- og proteininnholdet i hver brøkdel ble bestemt ved hjelp av henholdsvis phenol-svovelsyremetoden og Lowry-metoden med PIERCETM bicinchoninic acids (BCA) proteinanalysesett (Thermo Fisher Scientific Inc., USA). Glukose og bovint serumalbumin ble brukt som respektive standarder. Videre ble absorbansen ved 320nm (A: 2o) av hver brøkdel målt. Elutiontoppene av blå dextran og cyanokobalamin ble bestemt av deres absorbansverdi ved 260 nm, og toppene av dekstrans av kjent MW ble bestemt ved hjelp av fenol-svovelsyremetoden. CSD ble autoklavert ved 120 °C i 20 minutter for å vurdere termo ustabiliteten. I bioassays ble cellekultur og måling av IgM gjort på samme måte i vår forrige studie.

Cistanche salsa ekstrakt

Resultater og diskusjon

Figur 1 viser gelfiltreringskolonnekromatogrammer av CSD på HW-40F. Fra figur la ble MW av de aktive bestanddelene anslått til å være mer enn 6 kDa basert på dekstranmarkøren D4. Videre ble ikke både CSD-aktivitetene, det vil si å forbedre IgM-produksjonen og indusere veksthemming, inaktivert ved autoklavbehandling (figur 2), selv om noen bestanddeler aggregert og gikk tapt etter at CSD ble passert gjennom 0,22-um-filteret. Elutionmønstrene til CSD og den autoklavede CSD var nesten identiske, men den relative aktiviteten med å forbedre IgM-produksjonen i den autoklavede CSD var lavere enn ikke-behandlet CSD. Noen av årsakene ser ut til at aggregatene holdt de aktive bestanddelene eller noen av de aktive bestanddelene inaktivert. Resultatene av kromatografi på HW-55F viste mulig tilstedeværelse av 2 typer immunmodulerende faktorer: den første, konsentrert i fr. nr. var en aktiv bestanddel med høy molekylvekt (HCS) som kunne forbedre IgM-produksjonen, mens den andre, konsentrert i fr. nr. 50, var en middelmolekylær aktiv bestanddel (MCS) som kunne hemme celleproliferasjon (figur 3). Imidlertid var toppene oppnådd for henholdsvis HCS og MCS (fr.no.32 og 50) ikke så skarpe som dextrans av kjent MW (data ikke vist). Disse observasjonene indikerer muligheten for at det er biprodukter kunstig generert under CSD-forberedelse, polymerer av aktive bestanddeler som lett blir ødelagt og består av flere enheter, eller ulike aktive bestanddeler som har forskjellige originale MWs. Elutionmønstrene på kromatogrammer viser at det ikke er lett å få rene bestanddeler fra HCS og MCS siden det ser ut til å være forskjellige bestanddeler som har litt forskjellige MWs som nevnt ovenfor. Selv om begge er blandinger av aktive bestanddeler, ser det ut til at HCS består av bestanddeler av MW over 70 kDa, mens MCS består av MW som overstiger 6 kDa. HCS ble eluted på HW-55F i en brøkdel som var utenfor separasjonsområdet. På Sephacryl-S400.ble en del av HCS(fr.no.36) unngått i samme brøkdel som D1-markøren, som er av MW 2000 kDa (figur 4). Generelt tas polysakkarider og proteiner i betraktning som vannløselige høye MW-bestanddeler i planteekstrakter. Siden nesten alle funksjonelle proteiner er inaktivert av varmebehandling, ser de ut til å være polysakkarider. Men Park et. al. har rapportert det termostabile cytotoksiske lille proteinet kalt viskotoksin, som er tilberedt fra misteltein (Viscum album L., Viscaceae)extract.4Furthermore, viskotoksiner har vist seg å forbedre immunmodulerende aktivitet av menneskelige naturlige morderceller.5In Figur 3, MCS, som har en lavere MW, viser høyere innhold av protein. Tatt i betraktning disse fakta, mcs kan være protein-bundet polysakkarid8eller kan være et termostable protein som viskotoksiner. Disse resultatene viser at de 2 aktive bestanddelene kan være polysakkarider. Ellers kan MCS være termostabile proteiner.

Referanser

1) Deng, M., Zhao, J.Y., Ju, X.D., Tu, P.F, Jiang, Y., Li, Z.B.: Beskyttende effekt av tubuloside B på TNF alfa-indusert apoptose i nevronceller. Acta Pharmacol. Sin.,25, 1276-1284,2004.

2) Maruyama, S., Yamada, K., Tachibana, H.:Cistanche salsa ekstraktforbedret IgM-produksjon i den menneskelige B-cellelinjen, BALL-1.J. Trad. Med.,24,209-211,2007.

3) Maruyama, S., Yamada, K., Tachibana, H:Cistanche salsaekstrakt indusert apoptose i det menneskelige Burkitts lymfomcellelinje Namalwa. J.Trad. Med.,25,24-27,2008.

4) Parker. JH, Hyun, C.K., Shin H.K: Cytotoksiske effekter av komponentene i varmebehandlet misteltein (Viscum album). Kreft La, 139, 207-213,1999.

5) Tabasco, J., Pont, F, Fournic, J.J, Vercellone, A.: Misteltein viskotoksiner øker naturlig killer cellemediert cytotoksisitet. Eur.J. Biochem.,269,2591-2600, 2002.

6) Fisher, M., Yang, L.X.: Anticancer effekter og mekanismer av poly sakkarid-K (PSK): implikasjoner av kreft immunterapi. Anticancer Res.,22,1737-1754,2002.

cistanche kosttilskudd