Immunstimulerende aktivitet av vann ekstraherbare polysakkarider fra Cistanche Deserticola som en planteadjuvans in vitro

For mer informasjon:ali.ma@wecistanche.com

Ailian Zhang, Xiumei Yang, Quanxiao Li, Yu Yang, Gan Zhao, Bin Wang, Daocheng Wu

1 Xinjiang Key Lab of Biological Resources and Genetic Engineering, College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi, Xinjiang, Kina,

2 Key Lab of Medical Molecular Virology, School of Basic Medical Science, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai, Kina,

3 College of LifeScience and Technology, Xi'an Jiaotong University, Xian, Shanxi, Kina

Abstrakt

En sikker og effektiv vaksineadjuvans er viktig i moderne vaksiner. Ulike kinesereurtepolysakkariderkan aktivere immunsystemet.Cistanche deserticola(CD) er en tradisjonell kinesisk urt og en hjelpekandidat. Her bekreftet vi detvann-ekstraherbare polysakkariderav CD (WPCD) kunne modulere immunresponser in vitro og in vivo. På en doseavhengig måte fremmet WPCD signifikant modningen og funksjonen til murine margavledede dendritiske celler (BM-DCs) gjennom å oppregulere ekspresjonsnivåene av MHC -II, CD86, CD80 og CD40, allogen T-celleproliferasjon, og utbyttene av IL-12 og TNF- via toll-lignende reseptor4 (TLR4), som indikert av in vitro-eksperimenter. I tillegg ble dens immunmodulerende aktivitet også observert hos mus. WPCD forbedret effektivt titrene til IgG, IgG1 og IgG2a og økte markant proliferasjonen av T- og B-celler, produksjonen av IFN- og IL-4 i CD4 pluss T-celler, og ekspresjonsnivået av IFN- i CD8 pluss T-celler bedre enn alun. Videre kunne WPCD markant oppregulere ekspresjonsnivåene til CD40 og CD80 på DC-er i milten og nedregulere Treg-frekvensen. Studien antyder at polysakkarider av Cistanche deserticola er en sikker og effektiv vaksineadjuvans for å fremkalle både humoral immunitet og cellulær immunitet ved å aktivere DC-er via TLR4-signalveien.

Klikk for å Cistanche stamme produkter

Introduksjon

Vaksiner er viktige for å kontrollere eller forebygge sykdommer. Nygenererte og nåværende vaksiner er høyt rensede rekombinanteantigenermed høyere sikkerhet, men rensede antigener kan ikke stimulere en tilfredsstillendeimmun responssammenlignet med svekkede eller inaktiverte patogenpreparater. Ved hjelp av adjuvanser kan vaksiner indusere persistentimmunresponser[1,2]. Nye kraftige hjelpestoffer er mye opptatt av både vaksineutvikling og menneskers helse. Til dags dato har forskjellige hjelpestoffer blitt identifisert og grundig studert. Disse adjuvansene gir vaksiner flere fordeler, inkludert å redusere den nødvendige mengden antigener, minimere antallet immuniseringer som kreves for normal immunrespons, og indusere raskere, bredere og sterkere.immunresponser[3–5]. Selv om mange potente adjuvanser er utviklet, slik som lipopolysakkarid (LPS) og Freunds komplette adjuvans (FCA), er de ikke mye brukt på grunn av deres toksisitet. Derfor er bare noen få adjuvanser, slik som alun, lisensiert for klinisk bruk [6]. Samlet sett bør det utvikles mer effektive og sikrere adjuvanser for å fremme bedre profylaktiske og terapeutiske vaksiner mot smittsomme og ikke-infeksjonssykdommer.

Sikkerhet er en viktig faktor i utviklingen av hjelpestoffer. Kinesiske urteholdige bestanddeler inkluderer næringsstoffer og viktige aktive kompositter, som fenolforbindelser og polysakkarider, som kan fungere som kraftige immunstimulerende midler [7–9]. Blant dem har polysakkarider fra tradisjonelle kinesiske urter blitt mye utforsket på grunn av deres immunstimulerende aktiviteter og lave toksisitet. For eksempel er inulin en immunadjuvans uten toksisiteten til andre adjuvanser som FCA. AdvaxTM delta-inulinadjuvans har også med suksess forbedret immunogenisiteten til vaksiner [10,11]. Astragalus, også kjent som Huangqi på kinesisk og Radix Astragali på latin, er vidt distribuert over hele verden. Polysakkarid er en av de viktigste aktive ingrediensene som er ansvarlig for den immunmodulerende aktiviteten. Eksperimentelle studier har vist at Astragalus polysakkarid hadde sterke immunmodulerende effekter både in vitro og in vivo [12, 13]. Lycium barbarum polysakkarider som vaksineadjuvans viste også gode forbedringer og stimulerende effekter [14, 15]. Disse studiene antydet at kinesiske urtepolysakkarider var ideelle kandidater for utvikling av adjuvans.

Cistanche deserticola YC Ma(CD, "Rou Cong Rong" på kinesisk) er en verdifull tradisjonell kinesisk urt og ofte betraktet som "ørkenens ginseng" på grunn av dens overlegne toniske effekter. Det er distribuert i tørre eller halvtørre regioner i Xinjiang. I Kina har den tørkede kjøttfulle stilken blitt brukt som styrkende mat i hundrevis av år [16, 17]. I mange år har kokt CD blitt brukt som styrkende mat for å behandle overbelastningsindusert svekkelse, noe som tyder på at det er trygt for oral administrering. Denne planten er mye bekymret på grunn av dens brede medisinske funksjoner. Nyere fytokjemiske og farmakologiske studier viste at polysakkarider var de viktigste biologisk aktive komponentene og hadde ulike biologiske effekter, inkludert immunmodulerende aktivitet, antioksidanteffekt og antiinflammatoriske effekter [18–21]. Imidlertid ble den immunforsterkende aktiviteten til vann-ekstraherbare polysakkarider fra C. deserticola i Xinjiang sjelden rapportert.

Det er velkjent at DC-er er viktige antigenpresenterende celler (APC-er) som gir signaler som kreves for å initiere immunresponser og modulere medfødte og adaptive celler. Noen adjuvanser som forbedrer antigenopptaket av DC-er kan øke co-stimulerende eller MHC-molekyler og forbedre immuniteten. Når DCs modning starter, produseres flere co-stimulerende molekyler og cytokiner og DCs viser distinkte fenotyper [22, 23].

I denne studien utnyttet vi først om WPCD kunne fremme aktivering av DCs viaTLR4-signalvei in vivo. Siden DC-er var koblingen mellom medfødte og adaptive immunresponser, antok vi at DC-aktivering stimulert av WPCD ville påvirke resultatet av adaptiv immunitet. Vi undersøkte den spesifikke immunresponsen på ovalbumin (OVA) hos mus behandlet med WPCD, inkludert titere av IgG, IgG1 og IgG2a underklasse, T- og B-proliferasjon, og produksjonen av cytokin. Vi undersøkte om WPCD-behandling ville øke aktiviteten til DC-er og Treg-celler i milten til disse musene. Våre funn beviste den potensielle immunmodulerende aktiviteten til naturlige polysakkarider fra C. deserticola og utvidet anvendelsesomfanget.

Materialer og metoder

Dyr

Åtte til ti uker gamle C57BL/6, BALB/c eller ICR hunnmus ble kjøpt fra FirstHospital ved Xinjiang Medical University (Urumqi, Xinjiang, Kina). Musene ble holdt under patogenfrie forhold i henhold til retningslinjene fra Animal Care and Use Committee (ACUC) ved Xinjiang University for Animal Health and Wellbeing. Dyreforsøksprosedyrene var godkjent av AUCC ved Xinjiang University.

Ekstraksjon av vandige ekstrakter

C. deserticola er en plante i Xinjiang-provinsen i Kina. Det urene polysakkaridet ble oppnådd gjennom vannekstraksjon og etanolutfelling. Kort fortalt ble 100 g tørket C. deserticola malt til pulver og deretter filtrert. Pulveret ble tilbakeløpskokt med petroleumseter ved romtemperatur gjentatte ganger og deretter tilbakeløpskokt med vannfri etanol i 1 time for å fjerne fargede ingredienser og lipider. Rester ble ekstrahert med kokende vann tre ganger og ekstraktene ble slått sammen, sentrifugert ved 4000 rpm i 10 minutter og refluksert ved 60˚C i 4 timer. Fire ganger volumer av 95% etanol ble tilsatt til løsningen for å utfelle urene polysakkarider. De urene polysakkaridene ble gjenoppløst i destillert vann og behandlet med Savage-reagens for å fjerne proteiner. Ekstrakter ble oppløst i PBS og sterilisert gjennom 0,22-μm filteret. Til slutt var det totale sukkerinnholdet i WPCD 59,58 prosent, som indikert av fenol-svovelsyreanalysen [24].

Generering av DC-er

BM-DC ble generert i henhold til den tidligere beskrevne metoden med små modifikasjoner [25]. Benmargs-DC-er fra C57BL/6-mus ble spylt ut med RPMI-1640 komplett medium (Gibco) supplert med 10 prosent føtalt kalveserum (Hyclone). De innsamlede cellene ble resuspendert i RPMI-1640-medium med 50 μM -merkaptoetanol (Sigma, St Louis, MO) og 20 ng/mL murin GM-CSF (Peprotech, Rocky Hill, NY) og inkubert ved 37˚ C i 5 prosent CO2 atmosfære. Halvparten av kulturmediet ble erstattet med et friskt medium som inneholdt GM-CSF hver 1-2 dag. Celler ble samlet på dag 6, behandlet med forskjellige doser WPCD, LPS (100 ng/mL) (Sigma, St Louis, MO) i 24 timer, og deretter vurdert ved hjelp av flowcytometri.

Påvisning av modning av DCs og T-celleaktivering in vitro

In vitro-modningseffekten av WPCD på BM-DC-er ble evaluert basert på fenotypiske analyseresultater av FAC-er. På dag 7 ble BM–DC fra C57BL/6 indusert i nærvær av GM-CSF og deretter behandlet med forskjellige konsentrasjoner av WPCD (0.01, 0.{{11 }}2, 0.05, 0.1 og 0.2 mg/ml) i 12 timer i tre eksemplarer. LPS (100 ng/ml) ble brukt som en positiv kontroll. Etter at BM-DC-er ble vasket i PBS og Fc-blokk (BD Biosciences, CA) ble brukt for å forhindre uspesifikk antistoffbinding, ble celler farget i PBS ved å bruke passende FITC-, PE- eller APC-konjugert CD40, CD11c, CD{ {24}}, CD80 og MHC-II antistoffer (BD) i 20 minutter ved 37˚C. De fargede cellene ble oppdaget av FACs Calibur (BD). Dataanalysen ble utført med FlowJo programvare (Tree Star).

I DCS-modningseksperimentet in vitro ble cellekultursupernatanter også samlet for å analysere IL-12 og TNF- ved å bruke cytokinanalysesett (Boster, Wuhan, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. Absorbansen ved 450 nm ble målt med en ELISA plateleser (Bio-Rad, USA). Cytokinmengder i prøvene ble beregnet med standardkurver for rekombinante cytokiner i henhold til den lineære regresjonsmetoden.

For å teste deres allogene stimulerende aktivitet, ble eksperimentet med blandet lymfocyttreaksjon (MLR) utført i henhold til den forrige metoden [26] av MTT (Sigma, St Louis, MO) assay. Kort fortalt ble BM-DC-er fra C57BL/6-mus brukt som stimulatorceller gjenvunnet på dag 7 i RPMI-1640-medium pluss GM-CSF og behandlet med forskjellige konsentrasjoner av WPCD i 12 timer ved 37˚C. Celler ble vasket og resuspendert i RPMI-1640-medium før utplating i 24-brønnplaten. Singleplenocytt-suspensjon som responderceller ble isolert fra BALB/c-mus. BM-DC ble blandet med splenocytter i forhold til 1:5 og 1:10. Celler ble dyrket ved 37˚C i en 5 prosent CO2-atmosfære i tre dager i tre eksemplarer. LPS-behandling ble brukt som en positiv kontroll. Kulturer ble deretter tilsatt 20 μL MTT for den siste 4-h dyrkingen. Absorbansene ved målebølgelengden (490 nm) og referansebølgelengden (650 nm) ble målt for T-celleproliferasjonsanalyse. Alle prøver ble målt mot en bakgrunnskontroll.

Behandling med TLR4-hemmer in vitro

BM-DC-er ble forhåndsbehandlet med 5 μM TAK-242 (hemmer av TLR4, Medchemexpress Inc.USA) i 1 time og deretter samdyrket med forskjellige konsentrasjoner av WPCD (100 og 200 ug/mL) i 12 timer i nærvær eller fravær av Golgi Stop i tre eksemplarer. I den positive kontrollen ble LPS tilsatt. Celler og supernatanter ble påvist av FACer for å analysere overflatemarkører CD86og CD40 og ved ELISA for å analysere henholdsvis cytokiner TNF-a og IL-12.

Vaksinasjonsprotokoll

Akutt toksisitetstest. I den orale akutte toksisitetstesten i denne studien ble 40 friske voksne ICR-mus brukt. ICR-mus ble fastet (mat, men ikke vann over natten) før dosering. WPCD ble administrert oralt i doser på henholdsvis 0, 50, 500 eller 5000 mg/kg kroppsvekt til hvert dyr i 7 dager. Saltvannsbehandlede og alunbehandlede mus ble inkludert i kontrollgruppen. Dyrene ble observert daglig i løpet av 14 påfølgende dager. Musene ble individuelt observert for å registrere dødelighet og kliniske tegn. I tillegg ble kroppsvekter og deres mat- og vannforbruk målt gjennom hele forsøket. På dag 14 ble milt- eller thymusindeksen beregnet som (milt- eller thymusvekt/kroppsvekt) × 10.

Påvisning av WPCD immunmodulerende aktivitet in vivo. For å undersøke om WPCD hadde den immunmodulerende aktiviteten, ble ovalbumin (OVA) (Sigma) brukt som modellantigen og ICR hunnmus ble tilfeldig delt inn i 7 grupper (negativ kontrollgruppe (0,9 prosent NaCl og WPCD 400 ug) og den positive kontrollen (Alun 200 ug med OVA)). Musene ble administrert subkutant to ganger med 10 ug OVA alene eller WPCD med OVA i henhold til dosen på 20, 100 eller 400 ug med et 2-ukers intervall. Blodprøver og milt ble tatt etter boostervaksinasjonen for å påvise IgG-titere, IgG-underklassene, splenocyttproliferasjon og cytokin, DCs overflatemarkører og Treg-frekvens

Påvisning av OVA-spesifikke antistoffer

OVA-spesifikke IgG-titere og underklasser ble undersøkt med ELISA i henhold til forrige metode [27]. ELISA-plater (Nunc, Thermo Fisher Scientific) ble belagt over natten og deretter blokkert. Serumprøver ble fortynnet serielt for IgG-titeranalyse eller påvisning av IgG1 og IgG2a (Southern Biotech, Inc.). Platene ble deretter inkubert med PBST inneholdende HRP-konjugert anti-muse IgG, IgG1 og IgG2a i 1 time ved 37˚C. Den kolorimetriske reaksjonen ble utviklet med tetrametylbenzidin (TMB) og deretter ble absorbansene ved 450 nm/655 nm målt og uttrykt som enheter for optisk tetthet (OD).

Påvisning av splenocyttproliferasjon og cytokin

Splenocyttproliferasjon ble bestemt ved MTT-analysen. På dag 21 etter den første vaksinasjonen ble en enkelt splenocyttsuspensjon oppnådd. Celler ble dyrket i RPMI-1640-medium i 96-brønnplater i henhold til konsentrasjonen av 1×106 celler/brønn i tre eksemplarer. Kulturene ble stimulert med OVA (sluttkonsentrasjon 10 ug/ml), ConA (sluttkonsentrasjon 5 ug/mL) (Sigma, St Louis, MO) og LPS (sluttkonsentrasjon 100 ng/ml) i 48 timer ved 37˚C . Celler ble dyrket i 48 timer og 20 μL (5 mg/ml) MTT (Sigma, St Louis, MO) ble tilsatt til hver brønn og inkubert i ytterligere 4 timer. Etter tilsetning av 50 μL DMSO i hver brønn for å stoppe fargeutviklingen (Sigma), ble platene lest ved 570 nm av en mikrotiterplateleser (Bio-Rad, CA, USA). Splenocyttproliferasjon ble uttrykt som stimuleringsindeks (SI), som var OD570 nm-forholdet mellom en stimulert brønn og en ustimulert brønn.

Utbyttet av IL-4 og IFN- i T-celler ble målt ved intracellulær cytokinfarging i henhold til en publisert protokoll med mindre modifikasjoner [27, 28]. Enkelt splenocyttsuspensjon ble fremstilt på dag 21 etter den første vaksinasjonen. Etter lysering av røde blodlegemer ble splenocytten (2×106 celler/ml) inkubert med OVA (10 ug/mL) for 4- timers stimulering og Golgi stop (BD) ble tilsatt for 12 timers inkubering, PMA som en positiv kontroll. Celler ble samlet, vasket med PBS, farget med CD4-FITC/CD8-FITC og fiksert og permeabilisert med Cyto fix/Cytoperm-sett (BD) i henhold til produsentens instruksjoner. Intracellulær cytokinfarging ble utført med passende konsentrasjon av IL-4-PE eller IFN- -APC-antistoffer ved 4˚C i 20 minutter. Fargede celler ble oppdaget av FAC-er. Dataanalyse ble utført i FlowJo.

Vurdering av DCs-modning og Treg-celler i milten

For analyse av DC-modning fra splenocytter i mus ble celleoverflatefarging utført med CD11c-PE, CD40-FITC og CD80-APC-antistoffer. På dag 3 etter den første vaksinasjonen ble enkelt splenocyttsuspensjon (1×106 celler/ml) oppnådd og cellene ble utsatt for dobbel farging. De fluorescerende intensitetene ble målt av FACs Calibur og de målte dataene ble analysert av FlowJo.

For å observere om WPCD kunne nedregulere frekvensen til CD4 pluss CD25 pluss Foxp3 pluss Treg-celler. Enkelt splenocyttsuspensjon ble fremstilt på dag 7 etter den andre vaksinasjonen. Splenocytten (2×106 celler/ml) ble utsatt for celleoverflatefarging med CD4-APC-antistoff, etterfulgt av nukleær cytokinfarging med passende CD25-FITC- og Foxp3-PE-antistoffer med det museregulerende T-cellefargingssettet (eBios ciences) i henhold til produsentens instruksjoner. Frekvensen av CD4 pluss CD25 pluss Foxp3 pluss Treg-celler ble testet på FAC-er. Dataanalyse ble utført i FlowJo.

Statistisk analyse

Enveis variansanalyse (ANOVA) tester (Tukey's Multiple-Comparison Test) ble utført for å analysere forskjellene mellom flere eksperimentelle grupper. Alle verdier er uttrykt som gjennomsnitt ±SD. P< 0.05="" is="" believed="" to="" be="" statistically="" significant.="" the="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" prism="" 5.0="">

Resultater

WPCD fremmet modningen og funksjonen til BM-DC-er in vitro

Adaptiv immunitet bestemmes av aktiveringen av DC-er, inkludert typene co-stimulerende molekyler og cytokiner [29, 30]. Til å begynne med undersøkte vi om WPCD kunne fremme uttrykket av co-stimulerende molekyler. I henhold til forskjellige doser av WPCD ble BM-DC fra C57BL/6 administrert. Ekspresjonsnivåene til CD11c, CD86, CD80, CD40 og MHC-II i celler ble analysert (fig 1). Cellene gatet med SSC og FSC viste at behandlingen med forskjellige doser WPCD ikke endret morfologien til BM-DC (data ikke vist). Ekspresjonsnivåene av CD86, CD80 og CD40 ble signifikant oppregulert på en doseavhengig måte sammenlignet med den ubehandlede gruppen og nådde platået under dosen på 20 ug/ml WPCD, men forskjellen var ikke signifikant sammenlignet med LPS-gruppen (Fig 1A–1C). Ekspresjonsnivået til MHC-II ble betydelig økt til sin maksimale verdi under dosen 50 ug/ml (fig 1D). Analyseresultatene av cellulære overflatemarkører viste at DC-er behandlet med LPS eller WPCD viste signifikant økte ekspresjonsnivåer av CD86, CD80, CD40 og MHC-II og fremmet fenotypisk modning.

Noen adjuvanser kan øke co-stimulerende molekyler på DC eller direkte indusere sekresjon av cytokiner. IL-12 og TNF- er de viktigste cytokinene for å aktivere Th1-immunresponsen. Vi analyserte utbyttene av cytokin i BM – DCs ved WPCD-behandling. Etter at BM-DC-er ble behandlet med forskjellig innhold av WPCD i 12 timer, ble supernatanten samlet for å oppdage innholdet av IL-12 og TNF- med et ELISA-sett. WPCD kan doseavhengig øke produksjonen av IL-12 (fig 2A) og TNF- (fig 2B). Resultatene viste at WPCD kunne indusere funksjonell modning av DC-er

I en immunrespons er det nødvendig å funksjonelt aktivere DC-er. Deretter ble det høyere nivået av allogen T-celleproliferasjon indusert av fullt modne DC-er. Derfor ble den funksjonelle responsen til DC-er på WPCD undersøkt av MLR. Den allostimulerende evnen til WPCD-induserte DC-er, lik LPS, ble forbedret dramatisk på en doseavhengig måte ved det angitte forholdet (fig 2C og 2D). Resultatene indikerte at WPCD forbedret antigenpresentasjon og optimaliserte T-cellerespons ved MLR in vitro.

WPCD fremmet modning av DC-er via TLR4-vei

Det kan utledes fra resultatene ovenfor at BM-DC-er aktivert av WPCD indikerte lignende DC-overflatemolekyluttrykk til LPS (en TLR4-ligand). Vi antok dermed at BM-DC-er aktiveres av WPCD via TLR4-banen. Etter at BM-DC-er ble forbehandlet med TAK-242 (TLR4-hemmer) og samdyrket med WPCD og LPS i 12 timer, ble uttrykket av CD40, CD86, TNF-a eller IL{{12 }} ble oppdaget av FAC eller ELISA. Som vist i figur 3A og 3B, resulterte TAK-242-behandlingen i de betydelig nedregulerte uttrykkene av CD40 og CD86 indusert av LPS eller WPCD, og ​​cytokinproduksjon av IL-12 eller TNF-a ble også betydelig redusert (fig 3C og 3D). Resultatene indikerte at WPCD kunne aktivere DC-modning gjennom TLR4-banen.

WPCD forbedret humoral og cellulær immunitet

For sammenligningsformål evaluerte vi effekten av WPCD på fremkalling av humoral immunrespons hos OVA-immuniserte mus. Før vaksinasjon og på dag 14, 21, 35 og 49 etter den første vaksinasjonen, ble blod samlet for å påvise IgG-titer og IgG-underklasserserum ved hjelp av ELISA. IgG-antistoffresponsen mot OVA økte med økningen i dosen av WPCD-administrasjon (100 og 400 ug) på en doseavhengig måte (fig 4). Den optimale konsentrasjonen var 100 ug/ml WPCD og økte IgG-responsene to ganger sammenlignet med OVA alene på dag 21, 35 og 49 (fig 4A). Betydelige økninger i OVA-spesifikke IgG1- og IgG2a-antistoffnivåer under 20 og 100 ug WPCD-administrasjon ble oppnådd sammenlignet med OVA-gruppen i serum på dag 35 (fig 4B). I mellomtiden fremmet Alun bare ekspresjonsnivåene av OVA-spesifikke IgG- og IgG1-antistoffer i de immuniserte musene. WPCD alene utløste ikke OVA-spesifikke antistoffer. Resultatene ovenfor indikerte åpenbart at WPCD genererte høyere antistofftitere og mer balanserte Th1/Th2-responser enn alun.

Splenocyttproliferasjon er en annen indikator på cellulær immunitet. ConA stimulerer T-celler og LPS stimulerer B-celleproliferasjon. På dag 21 etter den første vaksinasjonen ble enkelt splenocyttsuspensjon oppnådd og stimulert med henholdsvis OVA (10 ug/mL), OVA323-339 (10 ug/mL) peptid, ConA (5 ug/mL) og LPS (5 ug/ml) i 48 timer. Deretter ble proliferasjonen av T-celler målt ved MTT-metoden. WPCD kunne betydelig fremme OVA-antigen, Con A-mitogen og LPS mitogen-stimulert splenocyttproliferasjon hos musene immunisert med OVA og WPCD (fig 5) og den optimale konsentrasjonen av WPCD var 100 ug/ml. Disse dataene indikerte at WPCD som vaksineadjuvans i OVA-immuniserte mus kunne indusere aktivering av T-celler og B-celler mer effektivt enn alun.

Alle testede WCPD-adjuvanser formulert med OVA-vaksiner genererte like sterk humoral og cellulær immunitet (fig 4 og 5). På grunnlag av disse dataene, for ytterligere å evaluere WPCD-påvirkninger på OVA-spesifikk T-hjelper (Th) cellerespons, analyserte vi videre cytokinuttrykk i CD8 pluss og CD4 pluss T-celler ved flytcytometri (fig 6). På dag 21 etter den første vaksinasjonen ble en enkelt splenocytt av mus isolert og deretter dyrket sammen med OVA (10 ug/ml). IL-4-utbyttet i CD4 pluss T-celler i gruppen administrert med 100 ug OVA/WPCD var signifikant høyere enn det i OVA/Alun-gruppen og OVA-gruppen og lik den i PMA (fig 6A). Videre ble IFN-utbyttet i CD8 pluss og CD4 pluss T-celler også betydelig forbedret i musene administrert med OVA/WPCD (20, 100 og 400 ug) (fig 6B og 6C). Sammenlignet med alunadjuvans, viste WPCD en bedre evne til å indusere IL-4- og IFN-sekresjoner fra T-celler.

WPCD stimulerte modning av DC-er og reduserer Treg-frekvensen in vivo

DCS er anerkjent som de mest potente APC-ene som er involvert i å initiere primære immunresponser. På dag 3 etter den første vaksinasjonen undersøkte vi derfor også effekten av WPCD på CD40 og CD80 på DC-er i milten hos mus (fig 7A og 7B). Musene i 100-ug OVA/WPCD-gruppen produserte signifikant høyere nivåer av CD40 og CD80 på DC-er enn de i OVA/Alun-gruppen. Disse dataene viste at WPCD kunne aktivere DC-er og indusere DC-modning hos mus. Treg-celler kan balansere toleransen og immunresponsen. For ytterligere å undersøke hvordan WPCD modulerte immunresponsen, ble Treg-celler i milten hos mus farget med et museregulatorisk T-cellefargingssett. På dag 21 etter den første vaksinasjonen ble en redusert frekvens av CD25 pluss Foxp3 pluss Treg-celler observert i de totale CD4 pluss T-cellene (fig 7C). Sammenlignet med OVA- og OVA/Alun-gruppene, viste WPCD-gruppen en betydelig redusert Treg-frekvens.

Sikkerhetsevaluering av WPCD i mus

For å estimere den orale akutte toksisiteten, utførte vi den akutte toksisitetstesten. Musene som ble administrert oralt med 5000 mg/kg kroppsvekt viste ingen unormal oppførsel eller bivirkninger, og ingen dødelighet ble funnet i toksisitetsevalueringstesten. Ingen signifikant forskjell i kroppsvektøkning, tymusindeks og miltindeks ble registrert blant ulike grupper av musene som ble administrert med forskjellige doser WPCD og hadde ingen signifikant forskjell (tabell 1). Ingen dødelighet ble observert etter 14 dager. Derfor var LD50-verdien til WPCD mer enn 5000 mg per kg kroppsvekt.

For å teste om WPCD hadde negative effekter på veksten til musene, før og etter subkutan vaksinasjon, ble kroppsvekten henholdsvis bestemt for hver mus (tabell 2). I den påfølgende observasjonen av musene ble det ikke observert bivirkninger eller unormal oppførsel. Dessuten viste kroppsvekten til musene administrert med WPCD og musene administrert med saltoppløsning eller OVA/Alun ingen signifikant forskjell. Disse observasjonsresultatene viste at administrering av WPCD var trygg.

Diskusjon

Adjuvanser er nøkkelkomponenter i vaksiner [31]. På grunn av fremskrittene innen genomikk og proteomikk, identifiseres flere og flere rekombinanter og syntetiske vaksinemolekyler. Derfor kreves det flere hjelpestoffer og formuleringer. Noen potente adjuvanser er generelt relatert til økt toksisitet, for eksempel FCA. Derfor er det nødvendig å finne en sikker formulering som inneholder forskjellige synergistiske komponenter som til slutt driver den ønskede immunresponsen. Polysakkarider fra kinesiske urter er ikke-toksiske og viser ingen signifikante bivirkninger [32,28]. En sikker adjuvans er nødvendig for en viss vaksine.

Cistanche deserticola er en viktig styrkende urt og finnes mye i tørre land og varme ørkener nordvest i Kina. Cistanche deserticola er mye bekymret på grunn av dens bioaktiviteter inkludert immunmodulerende, antioksidative, antibakterielle og antitumoreffekter [20,21]. Det er gjort noen fremskritt i den strukturelle karakteriseringen og immunologiske aktiviteten til Cistanche deserticola, som er en god kandidat for å utvikle adjuvanser. Vi evaluerte eksperimentelt adjuvanseffektene og mekanismen til WPCD in vitro og in vivo. Subkutan administrering av WPCD fremmet signifikant humorale og cellulære immunresponser ved å øke serumantistoffer og lymfocyttproliferasjon, øke ekspresjonen av cytokiner, oppregulere DC-modningen og nedregulere frekvensen av CD4 pluss CD25 pluss Foxp3 pluss Treg-celler.

DCS er nøkkel-APCer for priming av naive T-celler. Aktiveringen av DC-er er viktig for adjuvanser. DCS, spesielt murine margavledede DC-er, brukes ofte til å evaluere adjuvanser og vaksiner. Flowcytometri kan skille cellene som har blitt aktivert etter å ha fanget et antigen fra omkringliggende celler. I FCM-analyse er graden av aggregering av stimulerte celler en indirekte indikator for å evaluere sikkerheten til immunmodulatorer [3]. Dermed kan WPCD adjuvansaktivitetsdata i DCs in vitro gi verdifull informasjon for dyremodeller. Basert på BM-DC-modellen ble ekspresjonsnivåene av MHC-II, CD86, CD80 og CD40, cytokinproduksjon og allogen T-celleproliferasjon påvist i det optimale WPCD-konsentrasjonsområdet. Ekspresjonsnivåene av MHC-II, CD86, CD80 og CD40 ble oppregulert i BM-DC og utbyttet av TNF-a og IL-12 ble økt på en doseavhengig måte. Den allogene T-celleproliferasjonen ble observert. Morfologien til BM-DC ble ikke endret. Ved å indusere BM-DC-aktivering og sekresjon av inflammatoriske cytokiner in vitro, kan WPCD-adjuvans øke mengden antigen og mengden APC betydelig og stimulere T-celler til å utskille IFN-, som bidrar til å øke immunmodulerende aktivitet.

Ulike kinesiske urteaktige polysakkarider er i stand til å aktivere immunsystemet og har utmerkede adjuvansevner gjennom å stimulere DCs-modning ved TLR4-banen [33,28]. Dermed antar vi at TLR4 deltar i signalveien til WPCD-indusert DC-modning. Som forventet resulterte TLR4-hemmerbehandlinger i en signifikant reduksjon i TNF-a og IL-12. Videre hindret hemmingen av TLR4-banen også uttrykket av CD 40 og CD80 på DC-er, noe som indikerer at modningen av DC-er var avhengig av TLR4. Derfor er det åpenbart at TLR4 deltar i den WPCD-induserte DCs-modningen.

Den optimale dosen av adjuvanser og vaksineformulering er empirisk bestemt i mange eksperimenter. For å utforske dose-responsforholdet mellom WPCD-adjuvans og OVA-antigener i mus, valgte vi forskjellige WPCD-doser basert på tidligere rapporterte data fra BM-DCs in vitro for å administrere ICR-mus subkutant to ganger. Vi fant at WPCD økte utbyttet av OVA-spesifikke antistoffer signifikant og induserte en balansert Th1/Th2-immunrespons med en økning av IgG1- og IgG2a-nivåer. Spesielt var IgG2a-nivået høyere enn det som ble behandlet med alun i den optimale dosen. Derfor resulterte WPCD i høyere nivåer av spesifikke antistoffer og høyere effekt med de lavere injeksjonene.

Nye vaksiner krever induksjon av sterke cellulære responser, som involverer antistoffer, T-hjelpeceller (Th) og cytotoksiske T-lymfocytter (CTL). Den terapeutiske vaksinen har som mål å indusere sterkere T-celleresponser. Den ideelle adjuvansen øker styrken til vaksinen og fremmer cellemediert immunitet uten å forårsake toksiske effekter [34]. Blant observasjonene i immuniserte musemodeller førte WPCD til en økning i OVA-spesifikk og ikke-spesifikk splenocyttproliferasjon sammenlignet med alun. Noen adjuvanser oppregulerer cytokiner og immunsystemet. For eksempel kan saponiner stimulere cellemediert immunrespons mot et antigen som normalt bare induserer antistoffer. Vi valgte IL-4 og IFN- som indikatorer for indirekte å evaluere nivåene av immunitet hos mus. WPCD kan indusere mer IL-4- og IFN-sekresjoner enn alun. Derfor ble sterke hjelper-T-celle-responser og cytokinsekresjoner observert som et resultat av WPCD-vaksinasjon, noe som tyder på at WPCD mer effektivt kan stimulere lymfocytter til å utskille Th1--type cytokin og Th2--cytokin enn Alun.

Adjuvanser som påvirker antigenpresentasjonen kan påvirke komplekse immunprosesser. Treg-celler kan modulere Th1- og Th2-responser [35]. En passende dose WPCD kan fremme modningen av DC-er i mus ved å øke ekspresjonsnivåene av CD80 og CD40 og forsterke evnen til OVA-antigenpresentasjon i den tidlige immunresponsen. De eksperimentelle resultatene av DCS-aktiveringen og Treg-frekvensen viste at WPCD induserte modning av DC-er og reduserte Treg-frekvensen i milten hos mus. Disse resultatene viste at WPCD forbedret effektiviteten til OVA-vaksiner ved å øke målrettede antigenpresenterende celler og fremme T-cellespesifikk aktivering.

Ved utvikling av adjuvanser er det vanskelig å selektivt indusere den passende immunresponsen mot den tilsvarende infeksjonen. Egnet adjuvans bør ha lave bivirkninger og toksisitet for mennesker eller dyr. Derfor bør WPCD-sikkerhet vurderes, inkludert umiddelbare og langsiktige bivirkninger. I denne studien undersøkte vi den akutte toksisiteten til WPCD og den negative effekten av WPCD på vekstytelsen til mus i 110 dager. Resultatene av akutt toksisitet av WPCD viste at kroppsvekt, tymusindeks eller miltindeks ikke hadde noen signifikant forskjell. LD50-verdien til WPCD var mer enn 5000 mg per kg kroppsvekt. Gjennom den eksperimentelle etterfølgende observasjonen av musene ble det ikke funnet noen bivirkning eller unormal oppførsel hos mus. Disse resultatene indikerte at WPCD var trygt.

Som konklusjon, i denne studien, viste WPCD, et råpolysakkarid ekstrahert fra C. deserticola fra Xinjiang, noen egenskaper til adjuvanser. For eksempel forbedret WPCD både Th1- og Th2-responser ved å aktivere DC-er, øke antistoffresponser, forbedre cytokinproduksjonen. Dessuten undersøkte vi mekanismen for WPCD-effektivitet ved å analysere DCs modning og funksjon via TLR4-banen in vitro. Hos musene som kun ble behandlet med WPCD, ble det ikke observert noen åpenbar bivirkning. Derfor hadde WPCD den høyere immunstimulerende aktiviteten i cellulære og humorale immunresponser. Adjuvanser er en blanding av flere forbindelser. En blanding av flere råekstrakter kan ha større fordelaktige effekter enn et enkelt planteekstrakt. Det er nødvendig å systematisk utforske WPCD-ekstrakter, teste deres effektivitet og sikkerhet, og belyse mekanismene for deres effekter.

Støttende informasjon

S1 fil. ANKOMST Sjekkliste. (DOCX)

Anerkjennelser

Med spesiell takk til Bing Wang og Daocheng Wu for å gi gode ideer i eksperimentene.

Forfatterbidrag

Konseptualisering: Ailian Zhang, Bin Wang, Daocheng Wu.

Datakurering: Xiumei Yang, Yu Yang. Formell analyse: Ailian Zhang, Quanxiao Li.

Finansieringsanskaffelse: Ailian Zhang. Prosjektadministrasjon: Ailian Zhang.

Ressurser: Ailian Zhang, Gan Zhao.Writing – originalutkast: Ailian Zhang.

Skriving – anmeldelse og redigering: Ailian Zhang, Daocheng Wu.