I silico-analyse av en Drosophila parasitoid giftpeptid avslører prevalensen av kation-polar-kation-klip-motivet i Knottin-proteiner, del 1

Abstrakt:

Som generalist-parasitoidveps er Leptopilina heteroatom svært vellykket på mange arter av fruktfluer av slekten Drosophila. Parasitoidene produserer spesialiserte multi-strategi ekstracellulære vesikkel (EV)-lignende strukturer i deres gift. Proteomisk analyse identifiserte flere immunitetsassosierte proteiner, inkludert knottinpeptidet, LhKNOT, som inneholder den strukturelt konserverte inhibitor cysteinknute (ICK) folden, som er tilstede i proteiner fra forskjellige taxa. Vår strukturelle og forankringsanalyse av LhKNOTs 36-restkjerne-knutefold viste at i tillegg til selve knute-motivet, har den også en Cation–Polar–Cation (CPC) klips.

Inhibitor cystein er et naturlig stoff som brukes for å forhindre oksidativ skade og fremme cellevekst. For immunitet gjenspeiles rollen til cystein hovedsakelig i å forbedre kroppens immunitet og forhindre betennelse og infeksjon.

De siste årene har flere og flere studier vist at cystein kan spille en viktig rolle i immunsystemet. Det kan fremme spredningen av immunceller, øke kroppens motstand mot patogener og redusere risikoen for infeksjon. I tillegg kan cystein også redusere produksjonen av frie radikaler og forbedre den generelle helsen til immunsystemet, og dermed styrke kroppens immunitet.

Selv om effekten av cystein på immuniteten er svært betydelig, bør den brukes med forsiktighet ved bruk av hemmer cystein. Fordi hemmeren cystein vanligvis brukes til å behandle visse sykdommer, som hjerte- og karsykdommer, leddgikt osv., vil den, hvis den misbrukes, påvirke immuniteten og føre til at kroppens immunsystem svekkes, og dermed øke risikoen for infeksjon.

Avslutningsvis er det et uløselig forhold mellom hemmeren cystein og immunitet. Selv om hemmere av cystein kan fremme helsen til kroppen, må de også brukes under veiledning av en lege, og det bør tas hensyn til å opprettholde en rimelig dose for å opprettholde helsen til kroppen. Det kan sees at vi trenger å forbedre immuniteten. Cistanche kan forbedre immuniteten betydelig, fordi kjøttaske inneholder en rekke biologisk aktive ingredienser, som polysakkarider, to sopp, Huang Li osv. Disse ingrediensene kan stimulere ulike immunsystemer. cellelignende celler, øker deres immunaktivitet.

Klikk helsemessige fordeler av cistanche

CPC-klippmotivet antas å lette antimikrobiell aktivitet i heparinbindende proteiner. Overraskende nok har et flertall av ICK-er som er testet også CPC-klippmotivet, inkludert 75 bona fide plante- og leddyrknottinproteiner som deler høy sekvens og/eller strukturell likhet med LhKNOT. I likhet med LhKNOT og disse andre 75 knottin-proteinene, inneholder til og med Drosophila Drosomycin antifungal peptid, et kanonisk målgen for fluens TollNF-kappa B-immunvei, dette CPC-klippmotivet. Sammen antyder resultatene våre en mulig defensiv funksjon for parasittoiden LhKNOT.

Utbredelsen av CPC-klippmotivet, som er iboende til cysteinknuten i knottinproteinene som er undersøkt her, antyder at den resulterende 3D-topologien er viktig for deres biokjemiske funksjoner. CPC-klippet er sannsynligvis et svært bevart strukturelt motiv som finnes i mange forskjellige proteiner med rapportert heparinbindingskapasitet, inkludert amyloidproteiner. Knottiner er mål for terapeutisk medikamentutvikling, og innsikt i deres struktur-funksjonsforhold vil fremme ny legemiddeldesign.

Nøkkelord:

Vert-parasitt; Drosophila; Leptopilina; cysteinknute; knottin fold; Kation–Polar–Cation-klipp; antimikrobielt peptid; heparin-bindende motiv; miniproteiner.

1. Introduksjon

I vert-parasitt-interaksjoner må parasitten gi offensivt trykk samtidig som den holdes i live for å opprettholde levedyktig avkom [1,2]. Slike motstridende mål har ført til utviklingen av virulensfaktorer med forskjellige molekylære strategier samtidig som de opprettholder høy vertsspesifisitet. Parasittiske Hymenoptera utgjør mer enn en million arter, er allestedsnærværende på planeten og parasitterer en rekke leddyr, hovedsakelig insekter [3].

Veps som angriper insektverter har utviklet et utvalg av atferdsmessige og biokjemiske strategier for suksess og forblir under konstant ko-evolusjonært press med vertene deres [4–7].

Leptopilina/Drosophila-systemet er en fremvoksende modell for å forstå det molekylære grunnlaget for anti-veps responser og veps virulensstrategier [8]. For å undertrykke vertsimmunitet introduserer Leptopilina-hunnene giftfaktorer i larvevertene sine under egglegging [4,9,10]. De veldefinerte medfødte immunmekanismene i Drosophila [11–13] gir en verdifull kontekst for å studere effekten av disse vepsgiftfaktorene.

Infeksjon av spesialisten L. boulardi aktiverer de humorale og cellulære immunarmene kontrollert av fluens bevarte Toll-NF-κB signalvei. Ekspresjonen av antimikrobielle peptidgener (AMP) som drosomycin aktiveres etter L. boulardi-infeksjon [14]. Toll-NF-KB-signalering kontrollerer også blodcelledeling og utvikling [15,16], trinn som kontrollerer innkapsling og død av vepseegg [17,18].

I motsetning til dette undertrykker infeksjon av generalisten L. heteroatom begge immunbanene [9,14], og nesten alle larveblodceller blir ødelagt av faktorer i vepsegiften [19,20].

I denne studien analyserer vi den teoretiske strukturen til et L. heteroatom-peptid, kalt LhKNOT, identifisert i organelllignende sekresjoner i L. heteroatom-giften, men ikke i L. boulardi-giften [21]. Disse immundempende organellene inkluderer mer enn 350 proteiner og har en proteomisk profil av eukaryote mikrovesikler og en mengde immunitetsrelaterte proteiner [21–23].

LhKNOT tar i bruk motivet "Inhibitor Cysteine ​​Knot" (knottin) [24]. Knottin-motivet er bredt bevart i en rekke taxaer, fra planter [25,26] til snegler [27]. Disse små peptidene (<60 residues) are functionally diverse. Knottins are used offensively, in spider toxins [28] and cone snail venom [27], as well as defensively, e.g., in wound healing activities of cacti [26], and antimicrobial host defense in plants [25,26,29] and invertebrates [30].

Det brede spekteret av knottinaktivitet tilskrives den generelle strukturen til folden, som utelukkende er avhengig av et bevart motiv av seks cysteinrester som utnytter disse cysteinenes unike evne til å danne disulfidbroer. Knottin-motivet oppstår når cysteinrester observeres i et C1-C2-C3-C4-C5-C6-mønster (hvor "-" representerer flere svært varierende rester).

Disulfidbroer dannes deretter på en lignende konservert måte (C1-C4, C2-C5 og C3-C6), noe som resulterer i C1-C4 og C{{ 8}}C5 danner en makrosyklus, mens C3-C6 forekommer i denne makrosyklusen, noe som resulterer i en "knyttet" topologi. Siden denne knutede topologien i stor grad avhenger av bevaring av de seks cysteinrestene, tillater knottin-motivet betydelig variasjon i den generelle sekvensen [30]. Kombinasjonen av deres lille størrelse, høye toleranse for sekvensvarians og observert strukturell stabilitet har gjort knottins til et populært stillas for legemiddeldesign [30], potensielt til og med for kreftbehandlinger [31].

Ulike linjer med eksperimentelle bevis demonstrerer eller foreslår antimikrobielle evner for forskjellige knottins [25,26,29,30,32,33] eller gatede ionekanalinteraksjoner [28,34], selv om de molekylære mekanismene som disse funksjonene utføres ikke er. godt forstått. Videre er det ikke kjent om disse antimikrobielle funksjonene deler en felles virkningsmekanisme.

Gitt oppdagelsen fra immundempende partikler fra flueparasitter, var våre mål å (a) identifisere LhKNOT-relaterte sekvenser fra forskjellige organismer, inkludert L. heteroatom, L. boulardi og Ganaspis parasitoider, som angriper Drosophila og (b) identifiserer evt. nye strukturelle motiv(er) som er tilstede i de kjente eller nye LhKNOT-homologene med håp om at prediksjonen om et slikt bevart motiv kan foreslå mulige funksjoner for LhKNOT og veilede fremtidig eksperimentell forskning.

Vi viser at en teoretisk modell av LhKNOT har kjennetegnene til knutefolden med tre antiparallelle beta-ark, begrenset av disulfidbroer. LhKNOT-modellen inneholder et CPC-klipp som er i stand til å samhandle med heparin, et negativt ladet glykosaminoglykan (GAG) av betydelig medisinsk verdi. LhKNOT har også potensial for å interagere med andre GAG-er, slik som keratansulfat (en GAG som er høyt sulfatert, lik heparin) og hyaluronsyre (den eneste GAG-representanten som ikke krever sulfatering) [35].

Videre har strukturelle homologer av LhKNOT (dvs. bona fide knottin-motivproteiner) også CPC-klippmotivet som kan dokkes med heparin. Overraskende, i likhet med LhKNOT og disse andre bona fide knottin-proteinene, deler til og med Drosophila Drosomycin antifungale peptid dette CPC-klippmotivet i sin struktur. Dette motivet ble også identifisert i 41 av 46 ytterligere LhKNOT-homologer fra L. heteroatom, L. boulardi og Ganaspis spp. veps vellykket på D. melanogaster.

Disse i silico-baserte observasjoner antyder at CPC-klippmotivet, som er iboende i mange knottins, kan gi det strukturelle grunnlaget for å modifisere immun- eller virulensfunksjoner. Vi spekulerer på en mulig antimikrobiell eller virulensrelatert funksjon for vepsen LhKNOT. Overfloden av knottin-folden og dens samsvar med CPC-klippmotivet i de fleste av de nylig identifiserte knottin-peptidene fra tre Drosophila-parasitoider antyder en viktig ennå ikke-bestemt rolle for dem i parasittfysiologi og/eller i vert-parasitten interaksjoner.

2. Resultater
2.1. LhKNOT-sekvensen viser likhet med insekt- og planteantimikrobielle peptider

Et BLASTp-søk i nr- og TSA-databasene ved bruk av LhKNOT-sekvensen i full lengde (60 aminosyrer) viste et begrenset antall signifikante treff, først og fremst annotert som "antimikrobielle peptider", fra planter og insekter. Noen få soppsekvenser ble også identifisert. Alle resultater viste mindre enn 60 prosent aminosyreidentitet til LhKNOT. Topptreffet for LhKNOT i nr-databasen var et antimikrobielt peptid fra vanlig bille, Callosobruchus maculates, mens topptreffet i TSA-databasen var et antimikrobielt peptid fra hvetekrølmidden Aceria Coachella.

Konserveringen var mest fremtredende i regionen til det eneste sekvensmotivet assosiert med LhKNOT, den cysteinknyttede 'antifungal peptide'-signaturen (pfam11410-domene, E=2.8 × 10−3). Etter å ha kjørt PSI-BLAST for påvisning av eksterne homologer, ble ytterligere sekvenser avslørt. PSI-BLAST viste lignende resultater med vanlig isplante, Mesembryanthemum crystallinum; rødmidd, Dinothrombium tinctorium; parasitoid veps, Trichogramma pretiosum; klikkbille, Ignelater lysende; parasittveps, Trichogramma brassicae; vanlig pollenbille, Brassicogethes aeneus; askeborer, Agrilus planipennis; og sagflue, Neodiprion lecontei.

Ved å bruke den Hidden Markov Models-drevne HMMER-nettserveren som en alternativ metode for å oppdage eksterne homologer, identifiserte vi fem sopptreff fra Akanthomyces lecanii, Cordyceps javanica, Cordyceps confragosa, Rosellinia necatrix og Beauveria bassiana.

Et søk i PDB for lignende sekvenser hentet bare to signifikante resultater, ett for et knottin-type antifungalt peptid Alo-3 fra insektet Acrocinus longimanus og det andre fra det disulfid-begrensede sårhelende peptidet pB1 fra Pereskia bleo. Detaljene til alle nære og eksterne homologer identifisert ved hjelp av de forskjellige sekvenslikhetstilnærmingene er oppsummert i tilleggstabell S1.

En justering av LhKNOT til de kjente strukturene til typiske knottins så vel som identifiserte homologer viste bevaringen av de seks cysteinene som danner de tre disulfidbroene i LhKNOT (Figur 1A). På N-terminalen inneholder LhKNOT et langt, spiralformet segment som er spådd å fungere som en signalsekvens; internt inneholder den tre beta-ark, som forventet av den sekundære strukturen til knottin-peptider (figur 1B).

I tillegg, en vurdering av sekvenslikhet av LhKNOT målrettet mot de tilgjengelige L. heteroatom- og L. boulardi-transkriptene og fra en annen Drosophila-parasitoid, Ganaspis spp. (se Metoder), avslørte en overflod av beslektede sekvenser. For L. heterotoma (Lh14) identifiserte vi 16 ekstra Lh14 knottinproteiner (tilleggstabell S2).
For L. boulardi identifiserte vi 22 knottinproteiner (tilleggstabell S3). Seks LhKNOT-homologer ble på samme måte identifisert fra Ganaspis hookeri (G1) og to LhKNOT-homologer ble funnet i proteinprediksjonene laget fra G. brasiliensis (VA)-genomet (tilleggstabell S4). Figur 2 viser konserveringen av disse parasitoid knottin-sekvensene med LhKNOT. Dermed ser det ut til at i det minste de få Drosophila-parasitoidene som ble samplet i denne studien, koder for flere knottin-proteiner. Ytterligere slike knottinpeptider kan kodes av disse vepsene, og systematiske proteomiske/bioinformatiske tilnærminger er nødvendige for å få en omfattende liste. Funksjonene til disse antatte knottene i parasittfysiologi forblir ukjente.

Figur 1. (A) Multippel sekvensjustering av LhKNOT (øverst) og homologer i knottinfamilien (topp-til-bunn): Mesembryanthemum crystallinum (plante; antimikrobiell; NCBI ID: AAC19399), Aceria tosichella (midd; antimikrobiell; NCBI ID :MDE48292.1), Callosobruchus maculatus (bille; ukjent; NCBI ID:VEN35376.1), Dinothrombium tinctorium (midd; ukjent; NCBI ID:RWS16713.1), Trichogramma pretiosum (Alo{{10}} som; parasittveps; antimikrobiell; NCBI ID: XP_014233229.1), Ignelater luminosus (bille; ukjent; NCBI ID: KAF2884324.1), Trichogramma brassicae (snylteveps; ukjent; NCBI ID: CAB{{27 }}{{30}}31014.1), Brassicogethes aeneus (bille; ukjent; NCBI ID: CAH0563829.1), Agrilus planipennis (askeborer; antimikrobiell; NCBI ID : XP_018321119.1), Neodiprion lecontei (sagflue; ukjent; NCBI ID: XP_015517007.2), Akanthomyces lecanii (sopp; antifungal; Uniprot ID: A0A168C5L6), Cordyceps javanica (sopp; antifungal ; Uniprot ID: A0A545VVU1), Cordyceps confragosa (sopp; ukjent; Uniprot ID: A0A179IJT7), Rosellinia necatrix (sopp; ukjent; Uniprot ID: A0A1S8A723), Beauveria bassiana (sopp; ukjent; Uniprot ID: A0A0A2VUF6), Acrocinus longimanus (Alo-3; bille; antifungal; PDB ID: 1Q3J), og Pereskia bleo (pB1; ID: kaktus; 5XBD). Identiske rester er uthevet i rødt, mens kjemisk like rester er uthevet med gult. Svarte piler angir de konserverte cysteinrestene som er ansvarlige for den knottende strukturelle folden, og disulfidbroforbindelsen til de tre disulfidbroene er merket med neongrønne tall.

X og XX angir det variable antallet rester ved henholdsvis N- og C-terminalen. Sekundære strukturelementer av den modellerte LhKNOT er vist øverst. og T representerer henholdsvis -streng og -sving. (B) Sekundær strukturprediksjon for LhKNOT, som viser et langt spiralformet segment (rosa sylinder; signalpeptid) etterfulgt av tre beta-tråder (gule piler). Denne sekundære strukturen følger den kanoniske Knottin-signaturen [36]. (C) En prototype av knottin-strukturfolden fra KNOTTIN-databasen [36] (tillatelse til å reprodusere dette bildet gitt av Dr. Jean-Christophe Gelly, INSERM, oktober 2019). De to disulfidbroene (grønne) danner en makrosyklus, mens en tredje (blå) trekker gjennom midten og gir proteinet dens sammenknyttede topologi. (D) Den forutsagte tertiære strukturen til LhKNOT, som viser den knutede topologien og det konserverte cysteinmotivet, cysteinrester danner disulfidbroer i det konserverte mønsteret sett gjennom hele knottinfamilien (C1 -C4- og C2 -C5-formen makrosyklusen, C3 -C6 trekker gjennom midten).

Figur 2. (A) Multippelsekvensjustering av LhKNOT (øverst) og homologer i Lh14. (B) Multippel sekvensjustering av LhKNOT (øverst) og homologer i L. boulardi. X-en merket i den grønne boksen tilsvarer følgende innsettinger i to Lb17-sekvenser: Lb: GISX01151661.1 X=SQAPPPTPEPFHPPGTPP; Lb: GISX01151653.1 X=SQLTSPRSTFPPTGSTIPSIITT. (C) Multippel sekvensjustering av LhKNOT (øverst) og homologer i Ganaspis spp. Identiske rester er uthevet i rødt, mens kjemisk like rester er uthevet med gult.

Svarte piler angir de konserverte cysteinrestene som er ansvarlige for den knottende strukturelle folden, og disulfidbroforbindelsen til de tre disulfidbroene er merket med neongrønne tall. Sekundære strukturelementer av den modellerte LhKNOT er vist øverst. og T representerer henholdsvis -streng og -sving. Grå stjerner legges til på toppen av blokker med sekvenser, restene ovenfor representerer rester modellert med alternative konformasjoner.

2.2. Den tredimensjonale strukturen til LhKNOT

Den typiske strukturelle folden til et knottinpeptid er definert av seks cysteiner involvert i tre disulfidbindinger for å danne et cysteinknyttet tretrådet antiparallell beta-ark [25]. Et viktig kjennetegn ved denne folden er tilkoblingen til cysteinrestene for å danne disulfidbroene og disulfidbroen til cysteinene 3 og 6 som går gjennom disulfidene 1–4 og 2–5 for å lage en spesiell disulfid gjennom disulfidknute (Figur 1A, C ).

Dette disulfidet, gjennom en disulfidknutefunksjon, skiller knottinfolden fra andre cysteinknuteproteiner. Bortsett fra de konserverte cysteinene, kan resten av aminosyresekvensen være ganske variabel, og derfor er bare et begrenset antall knottins identifisert av sekvenslikhetstilnærminger for LhKNOT (se forrige avsnitt og tilleggstabell S1).

Folde-gjenkjenningsalgoritmer og malbaserte modelleringstilnærminger, derimot, hentet flere forskjellige knottins som egnede kandidater for modellering av LhKNOT. Blant de ulike LhKNOT-modellene som ble generert, var den beste modellen en multimalbasert modell av LhKNOT laget ved hjelp av programmet HHpred [37] med strukturelle begrensninger avledet fra de tre øverste malene, Alo-3 (PDB: 1Q3J) [ 30], omega-agatoksin-IVA (PDB: 1IVA) [28], og PAFP-S (PDB: 1DKC) [25]. Kunnskapsbaserte energiprofiler beregnet ved bruk av ProSA-web [38] for denne valgte modellen viste lave energier og en z-score på -4,53, som er sammenlignbar med løste strukturer.

Verify3D [39] vurderte denne multimalbaserte modellen med en bestått poengsum (100.00 prosent av restene i modellen har en gjennomsnittlig 3D-1 D-poengsum større enn eller lik 0,2). VoroMQA [40]-skåren på 0,325 er sannsynligvis en refleksjon av den lille størrelsen på peptidet, og poengsummene til malene var i samme område (tilleggsfigur S1).

Denne multi-malbaserte modellen karakteriserer knutefolden med tre antiparallelle beta-tråder, begrenset av disulfidbroer og den forventede tilkoblingen til disulfidbroer (Figur 1D). KNOTER3D, et verktøy i KNOTTIN-databasen [36] bekreftet at denne modellen har en bona fide knutefold og bekreftet det tidligere identifiserte disulfidbindingsmønsteret i figur 1D.

2.3. LhKNOT viser tilstedeværelsen av et CPC-klipp som er i stand til å samhandle med heparin og andre GAG-er

For å søke etter potensielle LhKNOT-funksjoner, ble struktur-funksjonskorrelasjoner av nære strukturelle homologer av LhKNOT undersøkt. Et knottinprotein fra kaktusen Pereskia bleo (PDB: 5XBD) [26] har et heparinbindende motiv kjent som CPC-klippet. Dette strukturelle motivet danner et geometrisk begrenset klipp av to kationiske og en polare rester som samhandler med heparin ved at saltbroer og hydrogenbindinger klemmer det på plass innenfor den positivt ladede overflaten til klippet [41].

En strukturell superposisjon av kaktusknotten og LhKNOT viste at de to strukturene er svært like, med en total forskjell på mindre enn 2Å. Dokkinganalyse av LhKNOT med heparin, ved bruk av ClusPros spesifikke parametere for heparin som en ligand, avslørte at for LhKNOT forekommer de polare interaksjonene som passer til CPC-klippmotivet i restene R1-S3-R14 (Figur 3A) .

Målte avstander (både mellom alfa-karboner og massesentre for deltakende restsidekjeder) skilte seg fra de til CPC-klippet med mindre enn 1Å, noe som tyder på tilstedeværelsen av et antatt CPC-klipp i LhKNOT (Figur 3B). Overflateelektrostatikken til den modellerte LhKNOT viste også tilstedeværelsen av den forventede kationiske bindingslommen dannet av CPC-klippet [41,42] (Figur 3C).

For å vurdere CPC-klippets evne til å samhandle med andre GAG-er, ble ytterligere dokkingsanalyse utført med LhKNOT og keratansulfat (PDB ID: 1KES) og med LhKNOT og hyaluronsyre (PDB ID: 1HYA). I begge tilfeller er den positivt ladede bindingsoverflaten skapt av CPC-klippet bundet til de negativt ladede molekylene. Ligplotter generert av PDBSum bekreftet en assosiasjon av GAG-ene med de CPC-dannende restene (tilleggsfigurer S2 og S3).

2.4. Andre strukturelle homologer av LhKNOT inneholder også CPC Clip-motivet

Tilstedeværelsen av CPC-klippet i både LhKNOT og dets strukturelle homolog fra Pereskia bleo (pB1) antydet muligheten for en bredere konservering av CPC-klippet i knottin-familien. En analyse av 21 nære strukturelle homologer av LhKNOT med eksperimentelt løste PDB-er i KNOTTIN-databasen viste at peptidene i alle tilfeller har CPC-klippmotivet. For de fleste peptider (f.eks. T. tridentatus) avviket motivparametrene mindre enn 1Å fra kjernen knottinfolden, mens for andre (f.eks. de offensive knottinene) var avviket opp til en margin på 3Å (tilleggstabell S5). På samme måte viste modellerte knottin-proteiner fra de identifiserte homologene at nesten alle av dem hadde CPC-klippet.

Seksten ekstra sekvenser fra L. heteroatom, 22 sekvenser fra L. boulardi og 8 sekvenser fra Ganaspis spp., uten kjente 3D-strukturer, ble modellert og analysert for tilstedeværelsen av CPC-klippmotivet. Mens 13 av de 16 antatte L. heteroatom-knottene og 20 av 22 antatte L. boulardi-knottene avslørte et CPC-klipp-motiv, inneholdt alle Ganaspis-sekvensene CPC-klippet (tilleggstabell S5). Interessant nok tilhører de syv homologene som ikke viste et CPC-klippmotiv til (a) den vanlige pollenbillesekvensen (B. aeneus (CAH0563829.1), (b) soppsekvensen R. necatrix (A0A1S8A723), og (c) tre L. heterotoma knottins 4,5,6 og L. boulardi knottins 3 og 20 (tilleggstabell S5).

En undersøkelse av knottins i KNOTTIN-databasen, ikke relatert til LhKNOT, men representativ for ulike taxa (kjeglesnegl, hesteskokrabbe, insekt, plante, skorpion og edderkopp), viste CPC-klippmotivet. I alle tilfeller er den elektrostatiske overflateprofilen til CPC-klipsmotivet positivt ladet, sannsynligvis for å lette interaksjoner med det negativt ladede heparinet (figur 4). Imidlertid, i likhet med bille-, sopp- og vepseknottene beskrevet ovenfor, ble CPC-klippet ikke identifisert i knottins fra plantens cyklotid og svamper (tilleggstabell S5).

Figur 4. Heparin-dokkingsresultater og overflateelektrostatikk av (A) antifungalt peptid fra Phytolacca americana (PFAP-s; plante; PDB: 1DKC), (B) kalsiumkanalselektivt omega-agatoksin fra Agelenopsis aperta (Omega-agatoksin IV-A) ; edderkopp; PDB: 1IVA), (C) soppdrepende peptid av Acrocinus longimanus (Alo-3; bille; PDB: 1Q3J), (D) sårhelende peptid fra Pereskia bleo (pB1; kaktus; PDB: 5XBD) , (E) LhKNOT, (F) soppdrepende peptid "Drosomycin" fra Drosophila spp. (Drosomycin; flue; PDB: 1MYN), (G) Conotoxin GS (Conotoxin GS; kjeglesnegler; PDB:1AG7), (H) antimikrobielt peptid Tachystatin A isolert fra hesteskokrabber (Tachystatin A; hesteskokrabber; PDB:1CIX) (I) Klorotoksin, et lite skorpiontoksin fra Leiurus quinquestriatus (Chlorotoxin; skorpion; PDB:1CHL) som viser det kationiske CPC-klippmotivet. Figurer orientert for å vise CPC-klippstrukturen best mulig. De elektrostatiske overflatepotensialene er fargegradert fra −4 kT/e (rød) til pluss 4 kT/e (blå).

2.5. I Silico mutasjonsanalyse av LhKNOT CPC-klipp avslører et sekundært CPC-klipp

Modeller av tre i silico LhKNOT-mutanter (R1A, S3A, R14A) ble undersøkt for å sammenligne bindingsinteraksjoner av villtype- og mutantproteiner. Når det gjelder R14A-mutanten, ble heparin overraskende vist å være assosiert med et sekundært CPC-klipp som involverer R1-, S3- og R30-restene i stedet for R1-, S3- og R14-motivet i villtypen (tilleggsfigur S4). Doble eller trippelmutanter (R14A-R1A; R14A-S3A-R1A) viste imidlertid ikke en interaksjon med noen av de primære eller sekundære CPC-klippmotivrestene (tilleggsfigur S4C, D).

In silico-mutantene med R1A-mutasjonen (som avbryter både de primære og sekundære CPC-klippmotivene), viste imidlertid heparin assosierende med R29 og R30, da de gir den eneste gjenværende kationiske overflaten (tilleggsfigur S4C, D). Interessant nok foretrekker liganden å assosiere med CPC-klippmotivet, både når det gjelder primære og sekundære klips, over denne ekstra kationiske overflaten når motivet er tilgjengelig, noe som antyder at den spesifikke interaksjonen til CPC-klippet kan tillate en mer stabil assosiasjon over en ikke-spesifikk elektrostatisk interaksjon.

For more information:1950477648nn@gmail.com