In vitro og silico-innsikt i tyrosinase-hemmere
Mar 28, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
Hee Jin Jung a,b,c, Sang Gyun Noh a,b,c, Yujin Park a, Dongwan Kang a, Pusoon Chun d, Hae Young Chung a,b,c,⇑,Hyung Ryong Moon a
Abstrakt
Tyrosinase er et nøkkelenzym som er ansvarlig for melaninbiosyntese og er effektivt for å beskytte hudskader forårsaket av ultrafiolett stråling. Som en del av det pågående arbeidet med å oppdage potente tyrosinasehemmere, har vi systematisk utformet og syntetisert tretten (E)-benzyliden-1-indanonderivater (BID1–13) og bestemt deres hemmende aktivitet mot tyrosinase. Blant forbindelsene som ble evaluert, var BID3 den mest potente hemmeren av sopptyrosinase (IC50=0.034 mM, mykofenolataktivitet; IC50=1.39 mM,difenolaktivitet). Kinetiske studier viste at BID3 demonstrerte en blandet type tyrosinaseinhibering med en Ki-verdi på 2,4 mM ved bruk av L-DOPA som et substrat. Molekylære dokkingsimuleringer i silico viste at BID3 kan binde seg til de katalytiske og allosteriske stedene til tyrosinase for å hemme enzymaktivitet, noe som bekreftet in vitro eksperimentelle studier mellom BID3 og tyrosinase. Videre ble melanininnholdet redusert og cellulær tyrosinaseaktivitet ble hemmet etter BID3-behandling. Disse observasjonene avslørte at BID3 er en potent tyrosinasehemmer og potensielt kan brukes som et blekemiddel for behandling av pigmenteringsrelaterte lidelser.
1. Introduksjon
Melanin syntetiseres av melanocytter i vasallaget av epidermis refererer generelt til familien av pigmenter som vanligvis er kjent for å beskytte pattedyrs hud mot skade forårsaket av skadelig UV-stråling ved å fjerne frie radikaler eller spre innkommende UV-lys [1]. Imidlertid kan rikelig generering av melanin forårsake synlig hyperpigmentering av epidermis, noe som kan være tydelig som melasma, fregner, aldersflekker eller senile lentiginer [2].
Tyrosinase (EC 1.14.18.1), et kobberholdig metalloenzym, er et nøkkelenzym involvert i melanogene prosesser. Tyrosinase katalyserer de to hastighetsbegrensende trinnene i melanogenese; hydroksylering av tyrosin (kresolase- eller mykofenolataktivitet) for å produsere 3,4-dihydroksyfenylalanin (L-DOPA) og den påfølgende oksidasjon av L-DOPA (katekolase- eller difenolaktivitet) til det tilsvarende DOPA-kinonet. Når L-tyrosin er substratet, er produktet av tyrosinase-katalysert reaksjon DOPA-kinon, som deretter omdannes til melanin [3]. Disse trinnene er avgjørende for å beskytte huden mot UV-skader. Mushroom Agaricus er vant til sin kommersielt tilgjengelige og høye homologi med mammaliantyrosinase enzym som gjør den godt egnet som modell for studier av melanogenese [4]. Hos mennesker hjelper melanin med å forsvare huden mot skaden forårsaket av UV [5]. Imidlertid kan det overskytende nivået av melanin forårsake ulike dermatologiske lidelser, inkludert hyperpigmenteringer, melasma, fregner og aldersflekker [6]. Derfor er newtyrosinase-hemmere som viser medikamentlignende og hudblekende egenskaper nødvendig for å hemme overdreven hudpigmentering.
1-Indanon, med et benzoyl-cyklopentanon-skjelett, regnes som de stive søskenbarnene til chalkoner, som inkluderer det umettede ketonsystemet av chalkoner som danner en syklisk 5-leddet ring, som er en naturlig forekommende komponent som finnes i en rekke spiselige plantekilder [7 ]. Flere studier har vist at forbindelser som har en 1-indanongruppe har farmakologisk betydning, ettersom de viser ulike gunstige biologiske aktiviteter, inkludert anti-inflammatorisk [8–10], antikreft [11,12], antioksidant [13], anti-Parkinson. sykdom [14], anti-Alzheimer sykdom [15–17], antimikrobielle [18], anti-immunundertrykkende [19], og anti-tyrosinase [20] egenskaper.
Chalcones (1,3-diaryl-2-proper-1-oner) er aromatiske ketoner som består av to aromatiske ringer knyttet til et tre-karbon a,b-umettet karbonylsystem som en sentral kjerne [21, 22]. Disse er naturlig forekommende komponenter som finnes i ulike spiselige naturlige planter og betraktes som forløperforbindelser for en syntetisk rute av flavonoider og isoflavonoider som pyrazoliner, pyrimidin, flavanol, flavoner, flavanoner, isoflavoner, auroner, antocyanidin, dihydroflavanol5 og dihydrokylsyre [23–2alkon5]. Det a,b umettede karbonylsystemet er avgjørende for typen biologisk aktivitet, siden disse systemene er distribuert i mange naturlige produkter som chalcones så vel som indanon, hvor molekylene er relativt mer plane, og overføringen av de elektroniske effektene av arylsubstituentene er rettet. til karbonylgruppen [7]. Tidligere rapporterte mange forskere at chalcones ble fremhevet som en ny klasse av tyrosinasehemmere i flere publikasjoner [26–29]. Nylig designet og syntetiserte Kim og medarbeidere [30,31] serier av chalcone-derivater og evaluerte dem for deres in vitro anti- tyrosinase og anti-melanogene aktiviteter mot murine melanocytter.
I følge våre tidligere rapporterte data viste derivater med an(E)-b-fenyl-a,b-umettet karbonylstillas potenttyrosinaseinhibering [32–34]. (E)-Benzyliden-1-indanoner kan være et attraktivt anti-melanogene middel siden forbindelsene har det (E)-b-fenyl-a,b-umettede karbonylstillaset i sin kjemiske struktur. Spesielt Radhakrishnan et al. (2015) [20]designet og syntetiserte en serie benzyliden-1-indanonderivater som hadde en (Z)-konfigurasjon og evaluerte dem for anti-tyrosinaseaktivitet. Selv om disse (Z)-benzyliden-1-indanonderivatene har blitt undersøkt, har anti-tyrosinase og anti-melanogene aktiviteter til (E)-benzyliden-1-indanonderivater ennå ikke blitt undersøkt.
Derfor designet og syntetiserte vi tretten forbindelser (BID1–13) av 1-indanonskjelettet som bærer en (E)-form benzyliden. Blant disse syntetiske forbindelsene viste en 2,4-dihydroksygruppe på B-ringen til 1-indanon den største tyrosinaseinhiberingen (omtrent 400- ganger mer effektiv enn kojinsyre, positiv kontroll). Videre evaluerer vi BID3 tyrosinaseinhiberende aktivitet, så vel som å karakterisere dens regulatoriske rolle i melaninsyntese ved bruk av B16F10 melanomceller. I utvidede eksperimenter evaluerte vi det anti-melanogene potensialet til BID3 og søkte å identifisere enzymkinetikk og molekylære dockingstudier. I påfølgende eksperimenter ble BID3 cellulært tyrosinasepotensial og melaninproduksjon i a-MSH og IBMX-induserte B16F10melanomceller også utforsket.
ANTIOKSIDASJON OG HUDBEHANDLING: CISTANCHE EXTARCT
2. Materialer og metoder
2.1. Reagenser
Sopptyrosinase (EC 1.14.18.1), alfa-melanocytt-stimulerende hormon (a-MSH), 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX), L-tyrosin, L-3,{{ 11}}dihydroksyfenylalanin (L-DOPA), dimetylsulfoksid (DMSO), kojinsyre, ftalsyre og transkanelsyre ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), føtalt bovint serum (FBS), streptomycin og amfotericin ble kjøpt fra WELGENE Inc. (Gyeongsan-si, Sør-Korea). Alle andre reagenser ble kjøpt fra Sigma-Aldrich.
2.2. Kjemi
2.2.1. Generelle metoder
Alle reagenser ble oppnådd kommersielt og brukt uten ytterligere rensing. Tynnsjiktskromatografi (TLC) og kolonnekromatografi ble utført på henholdsvis Merck forhåndsbelagte 60F245-plater og MP Silica 40–63, 60 Å. Massespektroskopidata med høy oppløsning (HR) ble oppnådd på et Agilent AccurateMass quadruple-time of flight (Q-TOF) væskekromatografi (LC) massespektrometer (Agilent, Santa Clara, CA, USA) i ESI positiv modus. Kjernemagnetisk resonans (NMR) spektre ble registrert på et Varian Unity INOVA 400 spektrometer eller et Varian UnityAS500 spektrometer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) for 1H NMR (400 og 500 MHz) og for 13C NMR (hv. 100 MHz), . DMSO d6, CD3OD og CDCl3 ble brukt som NMR-løsningsmidler for NMR-prøver. Koblingskonstant (J) og kjemiske skiftverdier ble målt i henholdsvis hertz (Hz) og deler per million (ppm). Forkortelsene som brukes i analysen av 1H NMR-data er som følger: s (singlett), bs (bred singlett), d (dublett), dd (dublett av dubletter), t (triplett), TD (triplett av dubletter), q ( kvartett), andm (flere).
2.2.2. Prosedyre for syntese av BID1–13
En løsning av benzaldehyd (1,1–1,2 ekv.) og 1-indanon (100 mg, 0,76 mmol) i 1 M i HCl-eddiksyre (0,4 ml) ble omrørt ved romtemperatur i 4–48 timer. Etter tilsetning av vann ble bunnfallene filtrert og vasket med vann og heksan: etylacetat (1:1), heksan: diklormetan (4:1–1:1), eller en blanding av diklormetan og metanol, avhengig av egenskapene til de gjenværende benzaldehydene for å gi (E)-benzyliden-1-indanoner (BID1–13) i utbytter på 32,8–99,1 prosent. Strukturell karakterisering (1H og 13C NMR og massedata for alle BID-er) av syntetiserte forbindelser er gitt i tilleggsinformasjon.
2.2.2.1. (E)-2-(4-Hydroksybenzyliden)-2,3-dihydro-1H-inden-1-on(BID1).
Gult fast stoff; utbytte 93,4 prosent; reaksjonstid, 6 timer; molekylformel, C16H12O2; smp. 224,7-225,9°C; 1H NMR (400 MHz, DMSO d6) d 10,10 (s, 1H, OH), 7,72 (d, 1H, J=7.6 Hz, 7- H), 7,64–7,58 (m, 4H, 4-H, 5-H, 20-H, 60-H), 7,43 (s, 1H, vinylisk H), 7,39 (t,1H, J=7,2 Hz, 6-H), 6,87 (d, 2H, J=8,0 Hz, 30-H, {{46 }}H), 3,99 (s, 2H, CH2); 13C NMR (100 MHz, DMSO d6) d 193,9, 160,1, 150,4, 138,3, 135,1, 134,0, 133,6, 132,2, 128,2, 127,2, 126,7, 126,7, 126,7 pluss (C124,7, 126,7, 126,7, 126,7, 126,7, 126,7, 126,7, 126,7, 126,7, 127,2, 126,7, 126,7, 134,0, 133,6, 132,2; H) pluss beregnet 237,0910, observert 237,0911.
2.2.2.2. (E)-2-(3,4-dihydroksybenzyliden)-2,3-dihydro-1H-inden-1-on (BID2).
Gult fast stoff; avkastning, {{0}},6 prosent ; reaksjonstid, 5 timer; molekylformel, C16H12O3; smp. 251,2-252,4°C; 1H NMR (400 MHz, DMSO d6) d 9,65 (s, 1H, OH), 9,24 (s, 1H, OH), 7,72 (d, 1H, J=7 ,6 Hz, 7-H), 7,66–7,61 (m, 2H, {{30}}H, 5-H), 7,42 (t, 1H,J {{35 }}.2 Hz, 6-H), 7.35 (s, 1H, vinylisk H), 7.19 (s, 1H, 20-H), 7.08 (d,1H , J=8,0 Hz, 60-H), 6,83 (d, 1H, J=8,0 Hz, 50-H), 3,98 (s, 2H,CH2 ); 13C NMR (100 MHz, DMSO d6) d 193.8, 150.4, 148.7, 146.3, 138.3, 135.1, 134.5, 132.0, 128.2, 127.3, 127.1, 127.1, 127.1, 127.1, 127.1, 127.1, 127.1, 127.1, 127,0 HRMS (ESI pluss) m/z C16H13O3 (M pluss H) pluss beregnet 253,0859, observert 253,0857.
2.2.2.3. (E)-2-(2,4-dihydroksybenzyliden)-2,3-dihydro-1H-inden-1-on (BID3).
Gult fast stoff; avkastning, 5{{20}},9 prosent ; reaksjonstid, 10 timer; molekylformel, C16H12O3; smp. 198,5-199,9°C (dek.); 1H NMR (500 MHz, CD3OD) d 8,17 (s, 1H, vinyl H), 7,82 (d, 1H, J=8,0 Hz,60-H), 7,67–7,63 (m, 3H , 4-H, 5-H, 7-H), 7,45 (t, 1H, J=7,0 Hz, 6-H), 6,45 (d , 1H, J=8,5 Hz, 50-H), 6,39 (s, 1H, 30-H), 4,01 (s, 2H,CH2); 13C NMR (100 MHz, DMSO d6) d 193,9, 161,6, 160,4, 150,3, 138,6, 134,8, 131,7, 130,3, 128,7, 128,1, 127,2, 312,9, 3,12,3, 127,2, 3,12, 3, 127,2, 127,3, 127,3, 127,3, 127,3, 127,3 HRMS (ESI pluss) m/z C16H13O3 (M pluss H) pluss beregnet 253,0859, observert 253,0858.
2.2.2.4. (E)-2-(4-Hydroksy-3-metoksybenzyliden)-2,3-dihydro-1Hinden-1-on (BID4).
Gult fast stoff; utbytte, 52.0 prosent ; reaksjonstid, 4 timer; molekylformel, C17H14O3; smp. 186,9-187,4°C; 1H NMR(400 MHz, DMSO d6) d 9,71 (s, 1H, OH), 7,73 (d, 1H, J=7,6 Hz, 7- H), 7,67–7,62 (m, 2H, 4-H, 5-H), 7,45 (d, 1H, J=2.{{50}} Hz , 20-H), 7,43(t, 1H, J=7,2 Hz, 6-H), 7,31 (s, 1H, vinylisk H), 7,24 (dd, 1H, J=8,0,2,0 Hz, 60-H), 6,87 (d, 1H, J=8,0 Hz, 50-H), 4,05 (s, 2H, CH2 3,84 (s, 3H, OCH3); 13C NMR (100 MHz, DMSO d6) d 193,9, 150,5, 149,7, 148,5, 138,3, 135,2, 134,4, 132,3, 128,2, 127,3, 127,1, 127,3, 127,1, 12, 5, 127, 1, 12, 127, 3, 127, 1, 12. HRMS (ESI pluss) m/z C17H15O3(M pluss H) pluss beregnet 267,1016, observert 267,1016.
2.3. Biologisk evaluering
2.3.1. Sopptyrosinaseinhiberende analyse
Tyrosinaseinhiberende aktivitetsanalyse ble utført ved bruk av sopptyrosinase som beskrevet tidligere, med mindre modifikasjoner [35,36]. Kort fortalt ble 10 mL av en spesifisert konsentrasjon av hver forbindelse (0,0005–50 mM) og 20 mL sopptyrosinase (1000 enheter/mL) i en 50 mM fosfatbuffer (pH 6,5) tilsatt til en 170 mL reaksjon blanding i en 96-brønnmikroplate (Corning, USA). Forholdet mellom 1 mM L-tyrosin eller L-DOPA-løsning, 50 mM kaliumfosfatbuffer (pH 6,5) og destillert vann var 10:10:9. Reaksjonsblandingene ble inkubert ved 37°C i 30 minutter. Etter det ble mengden av dopakrom produsert i hver brønn målt ved spektrofotometrisk analyse ved 492 nm (OD492) ved bruk av en mikroplateleser. Tyrosinaseinhiberingsraten (prosent) ble beregnet som (1 absprøve/abskontroll) 100 prosent. Graden av prøveinhibering ble uttrykt som konsentrasjonen som kreves for 50 prosent hemming (IC50).
2.3.2. Enzymkinetisk analyse med tyrosinase
For å bestemme de kinetiske mekanismene for hemming ble to komplementære kinetikkmetoder brukt: Lineweaver-Burk og Dixonplots [37-39]. Ved å bruke Lineweaver-Burk-plott (doble gjensidige plott), ble hemmingstypen til BID3 bestemt ved å bruke forskjellige konsentrasjoner av L-DOPA (0.125, 0.25, 0.5 og 1 mM), som substrater, i fravær og nærvær av forskjellige konsentrasjoner av BID3 (1, 2 og 4 lM). En Dixon-plott (enkelt resiproke plott) fortyrosinaseinhibering ble oppnådd i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av L-DOPA (0.125, 0.25, 0.5 og 1 mM ). Konsentrasjonene av BID3 var 1, 2 og 4 mM. De enzymatiske prosedyrene bestod av de tidligere beskrevne tyrosinaseanalysemetodene. Inhiberingskonstanten (Ki) ble bestemt fra tolkningen av Dixon-plott.
2.3.3. Tyrosinase molekylære dokkingsimuleringer
For å bestemme strukturen til enzym-hemmerkomplekset og for å sikre nøyaktighet, repeterbarhet og pålitelighet til dokkingsresultatene, brukte vi AutoDock4.2-programvare. For dikkestudier ble krystallstrukturene til sopptyrosinaseproteinmålet hentet fra proteinsekvensjusteringen (Protein Data Bank (PDB ID: 2Y9X) (http://www.rcsb.org/adb) [40]. Automatiserte dokkingsimuleringer ble utført mellom tyrosinase og kojinsyre, ftalsyre, kanelsyre eller BID3. For dokkingsprosedyren: omdannet 2D til 3D-strukturer, beregnede ladninger og tilsatte hydrogenatomer ved hjelp av ChemOffice-programmet (http://www.cam bridgesoft.com) [41 LigandScout 4.1.5 ble brukt for å forutsi mulige interaksjoner mellom ligander og tyrosinase og identifisering av farmakoforer.
2.3.4. Cellekultur og cellelevedyktighetsanalyse
Murine melanom B16F10-celler ble kjøpt fra Korean Cell Line Bank (KCLB, Seoul, Korea) og dyrket i DMEM supplert med 10 prosent FBS og 1 prosent streptomycin, og deretter inkubert ved 37 C, fuktet med 5 prosent atmosfærisk CO2. Cellelevedyktighetsanalyser ble utført som tidligere beskrevet [42]. Kort fortalt ble celler sådd med en tetthet på 1 104 celler/brønn i en 96-brønnplate i 24 timer. Påfølgende dag ble cellene eksponert for forskjellige konsentrasjoner av BID3 og inkubert i henholdsvis 24 eller 48 timer. Deretter ble 10 ml EZ-Cytox-løsning tilsatt til hver brønn og cellene ble inkubert i 2–4 timer. Absorbansen ble bestemt ved bruk av ELISA ved en bølgelengde på 450 nm. Hver analyse ble utført i triplikat.
2.3.5. Melanininnholdsanalyse
Melanininnholdet ble bestemt som beskrevet tidligere [43]. B16F10 melanomceller (2 105 celler/brønn) ble sådd i 6-brønnkulturplater. For å bestemme den hemmende effekten av BID3 på melanogenese, ble ferskt medium erstattet med medium som inneholdt BID3 (1, 5 og 10 lM) eller kojinsyre (10 mM) som en positiv kontroll i 1 time, og deretter stimulert med a-MSH (5 lM) ) og IBMX (200 mM) i 48 timer. Etter å ha blitt vasket to ganger med PBS, ble cellene løsnet ved inkubering i trypsin/EDTA, og pellets ble oppløst i 100 ml 1 N NaOH, og deretter inkubert ved 60 C for én håndblandet for å oppløse melaninet. Melanininnholdet ble bestemt ved å måle absorbansen ved 405 nm ved å bruke ELISA-leseren (TECAN, Sunrise, Østerrike). Melanininnholdet ble beregnet ved å bruke følgende ligning: (prøve/kontroll) - 100 prosent. Alle bestemmelser ble utført i tre eksemplarer.
2.3.6. Cellulær tyrosinaseaktivitet
Cellulær tyrosinaseaktivitet ble vurdert som beskrevet tidligere, med små modifikasjoner [44,45]. Kort fortalt ble 2 105/celler belagt i 6-brønnskåler og inkubert over natten. Cellene ble eksponert for forskjellige konsentrasjoner av BID3 (1, 5 og 10 mM) orkojinsyre (10 mM) i 1 time, og deretter stimulert med a-MSH (5 mM) og IBMX (200 mM) i 48 timer. Etter å ha blitt skylt to ganger med PBS, ble cellene lysert med 100 mL lyseringsløsning inneholdende 50 mM fosfatbuffer (pH 6,5), 0,1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) og 1 prosent Triton X-100 og frosset ved 80 C i 30 minutter. Lysater ble tint og sentrifugert ved 12,000 rpm i 30 minutter ved 4 C. Deretter ble supernatanten (80 ml) kombinert med 2 mg/ml L-DOPA (20 ml) i en 96-brønnplate . Etter inkubering ved 37 C i 30 minutter ble den optiske tettheten ved 492 nm målt ved hjelp av en ELISA-leser (TECAN, Salzburg, Østerrike). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved å bruke et BCA-proteinanalysereagens ved bruk av BCA som standard (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).
Cistanche ekstrakt fordel: hemmer tyrosinase.
2.3.7. Statistisk analyse
Alle data presenteres som gjennomsnitt ± standardfeil for gjennomsnittet (SEM). Dataene ble analysert ved enveis variansanalyse (ANOVA) for å bestemme forskjeller mellom behandlinger, etterfulgt av Bonferroni posthoc-testen. En verdi på p < 0.05="" ble="" ansett="" som="" statistisk="">
3. Resultater og diskusjon
3.1. Kjemi
(E)-benzyliden-1-indanonderivatene (BID1–13) ble syntetisert i henhold til det generelle skjema 1. I denne foreliggende studien ble tretten (E)-2-benzyliden-1-indanonderivater syntetisert og deres tyrosinaseinhiberende egenskaper ble undersøkt. Target (E)-2-benzyliden-1-indanonderivater ble syntetisert ved å bruke sure (1 M HCl i eddiksyre) forhold. Disse reaksjonene genererte målet (E)-2-benzyliden-1- indanonderivater i yield på 32,8–99,1 prosent . Det ser ut til at bare E-isomerene av 2-benzyliden-1-indanoner ble generert på grunn av A-stammen kjent som den 1,3-allyliske stammen. A-stammen (sterichindrance) mellom fenylringen og karbonylgruppen i Z-isomeren er tilsynelatende større enn den mellom fenylringen og metylengruppen i E-isomeren. Strukturene til syntetiske forbindelser ble verifisert ved 1H og 13C NMR og massespektrometri som beskrevet i den eksperimentelle delen (fig. S1–S38). Spesielt er det kjemiske skiftet av olefinisk proton skjermet i E-isomeren til 2- benzyliden på grunn av den anisotrope effekten av karbonylgruppen og vises nedfelt (over 7 ppm) sammenlignet med Z-isomeren (<7 ppm)="" [46].="" the="" chemical="" shifts="" of="" olefinic="" protons="" in="" the="" benzylidene-1-indanones="" appeared="" in="" the="" range="" of="" 7.31–8.17="" ppm.="" therefore,="" the="" benzylidene-1-indanone="" derivatives="" were="" determined="" to="" be="" (e)-stereoisomers.="" we="" found="" that="" the="" presence="" of="" hydroxyl="" or="" methoxyl="" group="" at="" the="" 2-position="" of="" the="" phenyl="" ring="" moves="" the="" chemical="" shift="" of="" the="" olefinic="" proton="" to="" 0.5–0.8="" ppm="">
Skjema 1. Syntese av (E)-2-benzyliden-1-indanoner.
3.2. Tyrosinaseinhiberende egenskaper til forbindelser
Det tyrosinaseinhiberende potensialet til (E)-benzyliden-1-indanon-derivatene ble undersøkt ved bruk av sopptyrosinase. Mykofenolatet (L-tyrosin) og difenolene (L-DOPA) ble brukt som substrater for disse eksperimentene [35]. Enzymreaksjoner ble utført med tyrosinase, substrat og testinhibitorer. Alle testede forbindelser viste en konsentrasjonsavhengig hemming. IC50-verdiene til (E)-benzyliden-1-indanonderivatene er vist i tabell 1.
I både L-tyrosin- og L-DOPA-substrater viste BID3 sterk hemmende aktivitet med IC50-verdier på 0.{{10}}34 ± 0.{{ 27}}224 mM og 1,39 ± 0.0 henholdsvis 0004 mM sammenlignet med den positive kontrollen kojinsyre, som hadde IC50-verdier på henholdsvis 13,77 ± 0,20 mM og 33,14 ± 0,93 mM (Fig. 1A). Videre viste BID6 kraftig aktivitet mot L-tyrosin og L-DOPA med IC50-verdier på henholdsvis 5,00 ± 0,91 mM og 53,11 ± 2,79 mM. BID1 viste signifikant hemming mot tyrosinase via L-tyrosin- og L-DOPA-veier, med IC50-verdier på henholdsvis 39,74 ± 3,71 mM og 130,0 ± 5,39 mM. BID4 og BID11 viste moderatetyrosinaseinhiberende aktivitet. Andre derivater var inaktive. Likeledes viste BID2 signifikant aktivitet mot L-tyrosin og L-DOPA, med IC50-verdier på 41,27 ± 3,03 mM og 52,93 ± 2,62 mM. I tillegg viste rapporterte hemmere av blandet type, ftalsyre og ikke-inhibitorisk syre effekt ved konsentrasjonen på 200 mm [47].
I samsvar med funnene fra struktur-aktivitetsforhold (SAR)-studier, påvirket derivater som inneholder (E)-benzyliden-1-indanonsubstituenter på fenylringen merkbart den potensielle tyrosinase-hemmingen. BID3, som hemmet tyrosinase med den høyeste potensen, har en 2-hydroksygruppe i nærvær av en 4-hydroksygruppe og sterkt hemmet tyrosinaseaktivitet (BID1 vsBID3). Disse resultatene antydet at 2,4-dihydroksygruppen (resorcinoldelen) i fenylringstrukturen kan være ansvarlig for den økte hemmingen av tyrosinase. Interessant nok, i en tidligere studie på potensielle syntetiske tyrosinasehemmere, viste vi at 2,4-dihydroksysubstitusjonen kraftig hemmet tyrosinaseaktivitet [48,49]. I tillegg indikerte SAR-dataene våre også at introduksjonen av en 3-hydroksygruppe i nærvær av en 4-hydroksygruppe påvirker tyrosinasehemming. Disse fenomenene ble demonstrert ved funnet at en 4-metoksy-3-hydroksyfenylring økte hemmende aktivitet mot tyrosinase, mens introduksjonen av en 3,4-dihydroksygruppe (katekoldel) reduserte tyrosinaseinhiberende aktivitet ( BID2 vs BID6) [35]. Disse resultatene antyder at 3-hydroksy-4-metoksygruppen også er ansvarlig for fortyrosinaseinhiberende aktivitet. Ikke desto mindre, i vår nåværende studie, viste BID9 og BID11, som inneholder 2,4-dimetoksyfenyl- eller 3,5-dimetoksyfenylgrupper, moderat tyrosinaseinhiberende aktivitet. Basert på IC50-verdier via L-tyrosin- og L-DOPA-veien, viste BID3 den mest potente tyrosinaseinhiberende aktiviteten, derfor studerte vi videre mekanismen som ligger til grunn for denne hemmende effekten. Radhakrishnan et al. (2015) [20] rapporterte at hydroksylsubstituerte (Z)-benzyliden-1-indanonforbindelsespotente tyrosinasehemmere. Selv om tidligere studier har vist at hydroksyl-substituert (Z)-benzyliden-1-indanonderivater har anti-tyrosinase-aktivitet, har det så vidt vi vet ikke vært rapporter om tyrosinaseinhibering av (E)-benzyliden-1- indanon-derivater ved bruk av cellebaserte eksperimenter.
Tabell 1. Sopptyrosinaseinhiberende potensial for den substituerte 2,3-dihydro-1H-inden-1-one (1-indanon) chalcone-lignende
derivater (BID1–13).
Fig. 1. Konsentrasjonsavhengig hemming av sopptyrosinaseaktivitet av BID3 og kojinsyre (positiv kontroll) (n=3).
3.3. Enzymkinetisk analyse av tyrosinaseinhibering
Siden BID3 var den mest potente inhibitoren, studerte vi videre mekanismen som lå til grunn for dens hemmende effekt. I et forsøk på å forklare modusen for enzymhemming, ble kinetiske analyser utført ved forskjellige konsentrasjoner av L-DOPA og forskjellige BID3-konsentrasjoner. Dixon- og Lineweaver-Burk-plott ble tegnet ved å bruke dataene oppnådd fra de kinetiske studiene for å bekrefte inhiberingsmønsteret, og inhiberingskonstantene (Ki) ble bestemt ved tolkning av Dixon-plott (fig. 2A og B). Konsentrasjonen av L-DOPA er angitt som følger: 1, 2, 4 mM. Skjæringspunktet ligger på venstre side, noe som indikerer blandet type hemming mot tyrosinase med en Ki-verdi på 2,4 mM (fig. 2B). Ki-verdien representerer konsentrasjonene som kreves for å danne et enzym-inhibitorkompleks, så en inhibitor med en lavere Ki-verdi indikerer større tyrosinaseinhiberingsaktivitet.
Molekylær dokking har bidratt med viktig innsikt i narkotikaoppdagelse over mange år. Imidlertid tar dokkingsprosedyrer sikte på å identifisere de riktige posisjonene til ligander i bindingslommen til et protein og å forutsi affiniteten mellom ligand og protein. Med andre ord, dokking beskriver en prosess der to molekyler passer sammen i et tredimensjonalt rom. For å bestemme om BID3 binder seg til det aktive stedet for tyrosinase, ble molekylærdokkingsanalyse utført for å identifisere mulige bindingsposisjoner til BID3 i krystallstrukturen til sopptyrosinase (PDB ID: 2Y9X) (fig. 3A). Disse resultatene ble beregnet ved hjelp av AutoDock4.2. program. Den mest stabile bindingsposisjonen var den med lavest poengsum [50]. Nylig har Hassani et al. [47] rapporterte at kanelsyre og ftalsyre var blandede tyrosinaseinhibitorer. Dermed ble hjelpemidler, kanelsyre og ftalsyre brukt for å validere dokkingsresultater [51]. De molekylære dokkingsmodellene av BID3 og kojinsyre (velkjent konkurrerende type hemmer) i det katalytiske stedet til tyrosinase er illustrert i fig. 3B [52 ]. Tyrosinase-BID3-hemmerkomplekset presenterte 6,28 kcal/mol bindingsenergi inkludert tohydrogenbindinger med ASN260- og MET280-resten av tyrosinase, og hydrofobe interaksjoner ble observert mellom BID3 og tyrosinase-restene VAL248, PHE264, og VAL283-et ytterligere stabiliserte interaksjonsstedet for kat. sopptyrosinase (tabell 2 og fig. 3E og H). Dessuten er molekylære docking-modeller av BID3, ftalsyre (allosterisk hemmer 1) og kanelsyre (allosterisk inhibitor 2) i de to allosteriske stedene illustrert i fig. 3C og 3D. Ftalsyre og kanelsyre ble tatt som referanseligander på henholdsvis allosteriske steder 1 og 2 [47,51]. Som vist i fig. 3F og I, utviste BID3 og ftalsyre en hydrogenbinding med TRY140-resten av tyrosinase, og tre hydrofobe interaksjonsrester med LEU24, PHE147 og ILE148 av tyrosinase på allosterisk sted 1. De tilsvarende BmicID3-interaksjonene til cinna-syre i det allosteriske sete2 av tyrosinase inkluderte hydrogenbindinger mellom ASP312 og LYS376 av tyrosinase, mens THR308 interagerte hydrofobisk på allosterisk sete 2 (fig. 3G og J). Videre ble det funnet at BID3-tyrosinasebinding utøver bindingsenergi i begge allosteriske seter av tyrosinase (henholdsvis 4,38 og 5,68 kcal/mol), noe som indikerer høy bindingsaffinitet med begge allosteriske seter. Basert på enzymekinetiske studier, utøvde BID3 en hemming av blandet type, bindingsevnen til BID3 med både det katalytiske stedet og to allosteriske steder bekreftet dets blandede hemming av tyrosinase.
Fig. 2. Lineweaver-Burk (A) og Dixon plott (B) for inhibering av sopptyrosinase ved BID3 ved bruk av L-DOPA som underlag.
3.4. Biologisk aktivitet
For å utnytte anti-tyrosinase-effektene til BID3 i cellekulturmodellen, undersøkte vi dens cytotoksiske effekter på B16F10-celler. Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av BID3 (1–20 mM) i 48 timer og vurdert ved hjelp av EZ-Cytox-analysen. Resultatene indikerte at BID3 ikke hadde noen signifikant cytotoksisk effekt i B16F10 melanomceller opp til 20 mM (fig. 4A og B). Derfor ble påfølgende eksperimenter utført ved bruk av BID3 opp til 20 mM.
Tabell 2 Bindingssteder og dokkingscore for BID3 i sopptyrosinase (PDB ID: 2Y9X) bestemt ved bruk av AutoDock4.2-programmet.
Melanogenese reguleres av en tyrosinase-enzymatisk kaskade. Av denne grunn har flere hudblekende forbindelser blitt utviklet for å redusere tyrosinaseaktiviteten. Kojic acid, en tyrosinaseinhibitor, ble brukt som en positiv kontroll [53]. For å undersøke effektene av BID3 på cAMP-høyde-indusert hyperpigmentering, ble B16F10-celler behandlet med a-MSH og IBMX i nærvær av BID3 (1, 5 og 2{{20}} mM) i 48 timer, og melanininnhold og cellulartyrosinaseaktiviteter ble bestemt (fig. 4C og D). Behandling med a-MSH og IBMX induserte en signifikant økning (P < 0,001#)="" i="" melanininnhold="" (fig.="" 4c)="" og="" cellulær="" tyrosinaseaktivitet="" (fig.="" 4d)="" i="" b16f10-celler="" sammenlignet="" med="" den="" ubehandlede="" kontrollen.="" bid3-behandlingen="" var="" imidlertid="" signifikant="" (p="">< 0,01**;="" p="">< 0,001***)="" og="" konsentrasjonsavhengig="" redusert="" melanininnhold="" og="" cellulær="" tyrosinaseaktivitet="" til="" b16f10-celler="" sammenlignet="" med="" a-msh="" eller="" ibmx-behandlede="" celler,="" noe="" som="" indikerer="" at="" reduksjonen="" i="" cellulær="" melanin="" kan="" skyldes="" hemming="" av="" tyrosinaseaktivitet="" .="" dermed="" viser="" disse="" funnene="" tydelig="" at="" bid3="" utøvde="" anti-melanogene="" effekter="" som="" inhiberer="" tyrosinaseaktivitet="" og="" melaninsyntese="" i="" b16f10-celler="" uten="" å="" indusere="">
Indanone er en av de privilegerte strukturene i medisinsk kjemi og er generelt assosiert med en rekke farmakologisk aktive forbindelser [54]. Indanondelen er tilstede i en rekke fysiologisk aktive naturlige produkter. I lys av dette rapporterte Okpekonet al., [55] at en ny 1-indanonforbindelse er isolert fra Uvaria-røtter. Denne forbindelsen er det første 1-indanonderivatet isolert fra planter. Nagle et al., [56] rapporterte at en ny metylert indan-aldehyd ble isolert fra marinecyanobacterium som en tumorangiogeneseregulator. På samme måte, siden den biologiske betydningen av indanon-kjernen, har forskere de siste årene vært fokusert på å utvikle farmakologisk aktive indanon-analoger som terapeutiske midler. Strukturalmangfoldet til 1-indanoner innebærer en rekke biologiske responser, og disse forbindelsene kan brukes i landbruk og medisin. Ulike indanonbaserte forbindelser er utviklet som anti-Alzheimers sykdom [16,57–59], antikreft [60– 62], antimikrobielle [63,64] og antivirale midler [65,66]. På grunn av det store applikasjonspotensialet var 1-indanoner interessante objekter for videre forskning, og det er ønskelig å designe nye klasser for deres syntese.
cistanche tubolosa: anti-aldring
4. Konklusjon
For å identifisere nye potente tyrosinasehemmere har vi utviklet og syntetisert tretten (E)-benzyliden-1-indanonderivater. Blant disse forbindelsene, (E)-2-(2,4-dihydroksybenzyliden){ {6}},3-dihydro-1H-in-1-on (BID3) hemmet kraftig tyrosinaseaktivitet (IC50=0.034 og 1.39 mM, for L-tyrosin og L-DOPA, henholdsvis), som var bedre enn referanseforbindelsen, kojinsyre(IC50=13,77 mM, henholdsvis 33,14 mM). Struktur-aktivitetsforholdet viste at tilstedeværelsen av dihydroksylgruppen i 2- og 4-posisjonen til (E)-benzyliden-1-indanonskjelettet forbedret aktiviteten mot tyrosinase. Enzymatisk hemming av enzymet, bestemt av Lineweaver-Burk og Dixon plott, indikerte at BID3 er en blandet type hemmer. Molekylære docking-studier viser at binding på det aktive stedet og på allosteriske steder er viktige mekanismer for tyrosinaseinhiberende aktivitet. Basert på disse resultatene, syntes BID3 å være en potent tyrosinasehemmer for behandling av hudsykdommer som hyperpigmentering.
ørken cistanche fordeler: hemmer melanindannelse
