Undersøkelse av mekanismen som Cistanche Deserticola behandler Alzheimers sykdom ved bruk av nettverksfarmakologi og eksperimentell validering

[Abstrakt]

 

Mål: Å utforskePotensiell mekanisme for Cistanche Deserticola på Alzheimers sykdom (AD)gjennomnettverksfarmakologiog dyreforsøk.

Metoder:ForutsiCistanche og Alzheimers sykdomsrelaterte mål ved bruk av nettverksfarmakologi; 40 mannlige 7- måned gamle SAMP8-mus ble tilfeldig delt inn i en modellkontrollgruppe (modell), en lav dose (L-GCs), en middels dose (M-GCS) og en høy dose (H-GC) behandlingsgruppe og 10 mannlige anti-aging SAMR1-mus i samme alder var brukt som SAMR1. Etter 30 d intragastrisk administrering av GC -er, ble Morris Water Maze og Y Maze -eksperimenter brukt for å teste lærings- og hukommelsesevnen til hver gruppe mus. Nissl -farging ble brukt for å observere antall og morfologi av nevroner i det hippocampale CA1 -regionen til musene. Immunhistokjemisk farging og Western blot-eksperimenter ble brukt for å oppdage ekspresjonen av PI3K, P-Akt og P-tau i hippocampus av mus. Resultater: 8 Effektive komponenter inkludert verbascosid ble screenet fra Cistanche Deserticola, og kjernegenene som var involvert i AD-behandling var Akt1, TNF, CASP3, etc. Signalveiene relatert til AD-behandling av Cistanche Deserticola inkluderte PI3K-Akt, TNF-traséer og aldersrasker. Dyreforsøk viste at sammenlignet med modellgruppen, reduserte rømningens latens og totale avstand i Morris Water Maze Navigation Test betydelig (P<0.05), and the number of platform crossings significantly increased (P<0.05) in the spatial exploration test of the GCs group. In the immunohistochemical staining and Western blot experiments, the ratio of PI3K and P-Akt/Akt in the GCs group significantly increased (P<0.05), while the expression of P-Tau/Tau significantly decreased (P<0.05). Conclusion: GCs may improve the learning and cognitive abilities of SAMP8 mice by regulating the PI3K-AkT signaling pathway and regulating the expression of P-Tau protein.

[Nøkkelord]Nettverksfarmakologi;Alzheimers sykdom; Cistanche Deserticola; SAMP8 mus; Apoptose

 

 

 

Cistanche urtilskudd av høy kvalitet

 

1 materialer og metoder

1.1 Materialer

1.1.1 Databaser og analyseplattformer

De viktigste databasene og analyseplattformene som ble brukt i denne studien (tabell 1).

 

Tab 1 Relevante analytiske plattformer og databaser brukt i denne studien

Navn	Nettsted	Versjon
Tradisjonell kinesisk medisin Systems Pharmacology Database (TCMSP)	https://www.tcmsp-e.com/	2.3
Uniprot	https://www.uniprot.org/
Pubchem	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
Venny	https://bioinfo.cis.cornell.edu/tools/vener/
Genecards	https://www.genecards.org/
NCBI -database	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
OMIM	https://omim.org/
Strengdatabase	https://cytoscape.org/	11
Cytoscape -programvare	https://cytoscape.org/	3.8.0 - 3.9.1
Metascape	https://metascape.org/

 

1.1.2 Eksperimentelle dyr

De eksperimentelle dyrene som ble brukt i dette eksperimentet var mannlige SPF-klasse senescens-akselererte musutsatte 8 (SAMP8) mus, som ble hevet fra 2 måneder gammel til 7 måneder gammel og inkludert i eksperimentet. Alle dyrene ble oppdratt i SPF-klasse dyrerommet til Animal Experiment Center ved Baotou Medical College of Inner Mongolia University of Science and Technology [Syxk (Meng) 2018-0001], med en temperatur på (24. {{9} ± ± 1. {11}}) grad og fuktighetskontroll ved 62%° Tilstrekkelig fôr og drikkevann ble levert, og mus var fri til å spise og drikke. Den lys/mørke syklusen var 12 timer/12 timer for å sikre den normale døgnrytmen til mus. Alle dyreoperasjoner og eksperimentelle protokoller involvert i dette eksperimentet ble utført i samsvar med protokollen godkjent av Experimental Animal Ethics Committee of Baotou Medical College (Baoyi Ethics 2018 No. 011).

1.1.3 Hovedreagenser og instrumenter

Høy effektivitet RIPA-lysbuffer (R0010), ECL pluss ultrafølsom selvlysende løsning (PE0010), elektroforesebuffer (T1070), overføringsbuffer (D1060), proteinbelastningsbuffer (P1015), etc. ble alle kjøpt fra Beijing Solebao; Immunohistochemistry Kit (PV -9000) ble kjøpt fra Beijing Zhongshan Jinqiao; BCA -proteindeteksjonssett (23227) ble kjøpt fra Thermo Scientific, USA. Fosfoinositid 3- kinase (PI3K) antistoff, proteinkinase B Proteinkinase B (Akt) antistoff (AF0016), P -Akt -antistoff (AF661) var alle kjøpt fra Wuhan QINKE BIOLOGICATE Senter fra SAB, LTD. Geit anti-kanin sekundært antistoff (SA 00001-2) ble kjøpt fra Proteintech, USA.
Parafin Slicer (Leica, Tyskland), Optisk mikroskop (Leica, Tyskland), åpent felttestkammer (Shanghai Xinruan), Morris Water Maze -80 grad Ult-lavt temperatur, Concolor (Thermo Fisher, USA), elektrohorese-apparatet (BEIJING LIUOSHIHNECHITHITOCN (Thermo Fisher. Shaker (Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.), Protein Gel Imaging Analysis System (Shanghai Tanon Technology) og Microplate Reader (Thermo Fisher, USA).

 

1.2 Metoder

1.2.1 Nettverksfarmakologianalyse

1.2.1.1 Screening av aktive ingredienser og målpunkter for Cistanche Deserticola

Screening av målpunkter for Cistanche Deserticola: Alle kjemiske aktive ingredienser ble søkt i TCMSP-databasen (https://www.tcmsp-e.com) med Cistanche Deserticola som nøkkelordet, og oral biotilstand (OB) større enn eller lik 3 {{0% og mediketten (ob) samlet forbindelser; Swiss Adme -plattformen ble brukt til å supplere de kjemiske ingrediensene som ikke ble funnet i TCMSP -plattformen med en gastrointestinal absorpsjon (GI -absorpsjon) -score av "høy" og medikamentell likhet på minst 2 "ja" som standarden, og sammen med de vanlige aktive ingrediensene i Cistanche ble det oppnådd av litteratursøk, standardnavnene på målet ble oppnådd gjennom litteratur -dataen gjennom litteratursøket gjennom litteratursøket gjennom litteraturen, og sammen med de vanlige aktive ingrediensene i cistanche -
(https://www.uniprot.org) [10].

 

1.2.1.2 Anskaffelse av annonsesykdomsmål

Ved å bruke "Alzheimers sykdom" som søkeord, kan du søke etter sykdomsmål i OMIM, Genecards og NCBI -databaser.

 

1.2.1.3 Venn Diagram Creation and Protein-Protein Interaction Network (PPI) konstruksjon

Skriv inn medikamentmål og sykdomsmål på nettstedet Venny Diagram, lag et Venn -diagram og få skjæringspunktet mellom mål. Importer strengdatabasen for å konstruere et proteininteraksjonsnettverk, sett den biologiske arten til "homo sapiens" og få et proteininteraksjonsnettverksdiagram. Bruk Cytoscape-programvare for å filtrere ut kjernemål basert på grad, nærhet og mellomhetsverdier for målene, og bruk analysen av plug-in for å tegne grafen.

1.2.1.4 GO og KEGG -analyse

Bruk David Online-plattformen og Metascape Online-plattformen for å utføre GO og KEGG-anrikningsanalyse på de ovennevnte relaterte kjernemålene, og skjerm varene med P mindre enn eller lik 0. 05. Bobldiagrammene over GO og KEGG-anrikningsanalyse ble tegnet ved bruk av online tegningsplattformmikroinformasjon.

 

1.2.2 Eksperimentell dyregruppe og modellforberedelse

40 SAMP8-mus ble tilfeldig delt inn i modellgruppen, den lavdose Cistanche Deserticola Group (L-GCS), den middels dose Cistanche Deserticola Group (M-GCS), og den høydose Cistanche Deserticola Group (H-GCS), med 10 mus i hver gruppe; 10 SAMR1 mus av samme kjønn og vekt ble brukt som SAMR1 -kontrollgruppen. L-GCS-gruppen, M-GCS-gruppen og H-GCS-gruppen ble gitt med GCS i en dose på 25 mg/(kg · d), 50 mg/
(kg · d) og 100 mg/(kg · d). SAMR1 -gruppen og modellgruppen fikk samme dose normal saltvann, og alle grupper ble gitt i 30 dager på rad.

 

1.2.3 Atferdseksperiment

1.2.3.1 Morris Water Maze Experiment

Stednavigasjonseksperiment: Den 24. til 30. dagen for GCS -administrasjon ble stedsnavigasjonseksperimentet utført i løpet av de første 1 til 5 dagene. Vannlabyrinten ble delt inn i fire kvadranter, og plattformen ble plassert i den tredje kvadranten, litt høyere enn vannoverflaten med 2 cm. Musen ble plassert i vannet med hodet vendt mot bassengets vegg, og det ble observert om den kunne finne plattformen i løpet av de spesifiserte 60 sekundene og holde seg på plattformen i 2 til 3 sekunder. Treningsfrekvensen for hver mus var fire ganger om dagen, og utgangspunktet for hver gang var en annen kvadrant. Tidsintervallet mellom hver to trening skal ikke være mindre enn 15 minutter. Hvis musen ikke fant plattformen i løpet av 60 sekunder, ble den guidet til å holde seg på plattformen i 3 til 5 sekunder. Under eksperimentet ble rømningsforsinkelsen og banelengden til hver gruppe mus registrert; Etter 6-7 dager ble et romlig utforskningseksperiment brukt: plattformen i den tredje kvadranten ble fjernet, og musene startet leteeksperimentet fra den første kvadranten. Utforskningstiden var 60 sekunder, og antall plattformkryssinger og prosentandelen av tid i målkvadranten til hver gruppe mus ble registrert.

 

1.2.3.2 Y-labyrinteksperiment

Y-labyrinten består av tre armer av samme størrelse og form: den første armen, romanarmen og de andre armene. Før eksperimentet ble inngangen til romanarmen blokkert, slik at musene fritt kunne utforske de resterende to armene i 10 minutter. 1 time etter utforskningen ble inngangen til romanarmen åpnet, og musen ble plassert i begynnelsen av den innledende armen. Tiden musen utforsket romanarmen innen 5 minutter ble registrert, og antall ganger musen med suksess kom inn og forlot romanarmen ble beregnet. Den spontane vekslingshastigheten til musen ble beregnet [vekslingshastighet (%)=antall vellykkede veksling/(totalt antall armoppføringer -2) × 100%] [14].

 

1.2.4 Nissl -farging

Etter 30 dager med medikamentadministrasjon ble musene bedøvd og perfusert med saltvann i hjertet. Etter at blodet ble tappet, ble musene drept og hjernevevet ble tatt. Hjernevevet til musene ble fikset ved nedsenking i 4% paraformaldehyd for 24-48 h, dehydrert med stigende gradientalkohol, transparentisert med xylen og innebygd i parafin. Skivtykkelsen var 5 um. Rutinemessig avkjøp til vann, metylenblå farging, differensiering, etanoldehydrering, xylenoversiktig og harpiksforsegling. Morfologien og antallet nevroner i CA1 -regionen til musens hippocampus ble observert under et mikroskop ved 200 ganger.

1.2.5 Immunhistokjemisk farging

Hjernevevsseksjoner ble rutinemessig avvokset til vann, plassert i natriumcitratantigenreparasjonsløsning og oppvarmet med høytrykksmikrobølgeovn, skylt med PBS-buffer i 5 minutter × 3 ganger, tilsatt endogen peroksidaseblokkering, skylt med PBS i 5 min × 3 ganger, inkubert med primær antibodi, og Incube i PBS i 5 min × 3 ganger. Dagen etter, skylt med PBS -buffer i 5 minutter × 3 ganger, ble det tilsatt reaksjonsforbedringsløsning, vasket igjen med PBS i 5 minutter × 3 ganger, inkubert med sekundært antistoff ved 37 grader i 20 minutter, skyllet med PBS i 5 min og 3 ganger, DAB -fargeløsning ble brukt for fargegrad -grade -grade -grade -grade -grade -grade -grade -grade -grade -grade -grade -grade -grade -grade -grade -grade -grade -grade -grade -grade -grade -grade -grade -grade -grade. transparentisert med xylen.

 

1.2.6 Western blot

En del av musens hippocampal vev ble tilsatt til protein Ripa lysisbuffer, helt malt med en slipestang, homogenisert med ultralyd i et isbad, og etterlatt på is i 30 minutter. Bruk deretter en ultrasentrifuge med lav temperatur til sentrifuge ved 12, 000 R/min i 15 minutter, ta supernatanten og bruk BCA-metoden for å bestemme proteinkonsentrasjonen. Ta 20 ug protein og tilsett det i proteinbelastningsbufferen, denaturer den ved 100 grader i 5 minutter, installer den forhåndskonfigurerte konsentrerte gel- og separasjonsgelen i elektroforesetanken, og utfør 80 V konstant spenningselektroforese i 60 minutter etter belastning, og juster den til 120 V konstant spenningelektrofer for 8 8 min. Bruk deretter 300 mA konstant strøm og overfør membranen i 130 minutter. Blokker med skummet melk ved romtemperatur i 2 timer, fortynn det primære antistoffet ved 1: 1 500 ganger, inkuber det i et kjøleskap ved 4 grader over natten, vask membranen og inkuber det sekundære antistoffet ved romtemperatur i 2 timer. Etter å ha utviklet med et bildeanalysesystem, analyser du den grå verdien til hver gruppe bånd.

 

1.2.7 Statistisk analyse

Alle data ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (x  s), og SPSS 25. 0 og GraphPad Prism9.5 -programvare ble brukt til dataanalyse og grafing. SNK-Q-test ble brukt for parvis sammenligning, og enveis Anona ble brukt til sammenligning med flere prøvesammenlater. P<0.05 indicated statistically significant differences.