Undersøkelse av ifosfamid-toksisitet induserer vanlig oppstrømsregulator i lever og nyre

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Hyoung-Yun Han, et al

Abstrakt:

Ifosfamid er et alkyleringsmiddel, en syntetisk analog av cyklofosfamid, som brukes til å behandle ulike faste kreftformer. I denne studien ble toksisiteten til ifosfamid evaluert ved bruk av enkelt- og flerdose intraperitoneal administrering til rotter under retningslinjer for god laboratoriepraksis, og et ekstra mikroarray-eksperiment ble fulgt for å støtte toksikologiske funn. En enkeltdose av ifosfamid (50 mg/kg) induserte ingen patologiske endringer. I mellomtiden ble alvorlig nyretoksisitet observert i gruppene som ble administrert etter 7 og 28 dager, med signifikante økninger i urea-nitrogen- og kreatininnivåer i blodet. I giftlisteanalysen ble kolesterolsyntese-relaterte gener hovedsakelig påvirket i leveren og nyresvikt-relaterte gener ble påvirket inyreetter administrering av ifosfamid. Dessuten ble interferon regulatorisk faktor 7 valgt som den viktigste oppstrømsregulatoren som endret seg i bådeleverognyre, og ble funnet å interagere med andre målgener, slik som ubiquitin-spesifikk peptidase 18, radikal S-adenosylmetionin-domene inneholdende 2, og interferon-stimulert gen 15, som ble ytterligere bekreftet ved sanntids RT-PCR-analyse. Som konklusjon, bekreftet nyre-biased ifosfamid organtoksisitet og identifiserte identisk endrede gener i bådeleverognyre. Ytterligere omfattende toksikogenomiske studier er nødvendig for å avsløre det nøyaktige forholdet mellom ifosfamid-induserte gener og organtoksisitet.

Nøkkelord:ifosfamid; levertoksisitet; nefrotoksisitet; intraperitoneal toksisitet

Cistanche er bra for lever og nyre

1. Introduksjon

Ifosfamid er et alkyleringsmiddel, en syntetisk analog av cyklofosfamid, som brukes til å behandle ulike faste kreftformer, inkludert sarkomer og lymfomer. Ifosfamid er et cellesyklus ikke-spesifikt kreftmedisin som forstyrrer DNA-replikasjon og RNA-produksjon [1]. Selv om ifosfamid tolereres relativt godt sammenlignet med andre giftige alkyleringsmidler, er det kjent å være assosiert med en rekke livstruende bivirkninger som begrenser dets kliniske bruk [2]. De viktigste bivirkningene av ifosfamid inkluderer alvorlig nyreskade som følge av reaktive giftige arter fra ifosfamid, inkludert akuttnyre skade, interstitiell nefritt, hemorragisk blærebetennelse og Fanconis syndrom [3]. I klinikker ble alvorlig multippel organtoksisitet rapportert hos pasienter som opplevde tidlig nyretoksisitet og gjentatt høydose ifosfamid-indusert ett organsvikt som førte til påfølgende organsvikt [4,5].

Den giftige metabolitten av ifosfamid, akrolein og kloracetaldehyd, er en hovedansvarlig faktor for organtoksisitet for ifosfamid. Tidligere studier har hovedsakelig fokusert på faktorene som påvirker omdannelsen av ifosfamid til toksiske metabolitter, spesielt cytokrom P450 (CYP) [6]. Relativt rikelig med CYP3A4 og CYP3A5 i nyrene fører til toksiske endringer i ifosfamid og induserer nefrotoksisitet [7]. Akrolein er et svært reaktivt aldehyd som kan aktivere intracellulære reaktive oksidative gener og skade celleorganellen. Kloroacetaldehyd rapporterte undertrykkelse av kompleks I-aktivering i mitokondriell respirasjonskjede som kan føre til intracellulær glutation (GSH) utarming og celledød [8].

En toksikologisk studie med flere organer er mer nyttig for å forstå de systemiske effektene av legemidler enn å målrette spesifikke organer for toksisitetsstudier. Leveren og nyrene er hovedorganer som deltar i legemiddelmetabolismen og utskillelsen, og disse hovedorganene er disponert for uønskede legemiddelreaksjoner; organtoksisitet følger ofte. Dessuten kan integrerende toksikologisk evaluering presentere forskjellige patologiske funn som kan hjelpe til å forstå og forutsi legemiddelindusert toksisitet i systemet.

Mange studier har brukt genekspresjonsprofiler for å forutsi potensielle negative effekter av kjemikalier. Imidlertid fokuserte de fleste tidligere studier på å evaluere enkeltmålorgantoksisitet, med bare begrensede patologiske symptomer [9]. Dessuten, kombinert med mikroarray-basert genprofilering, vil det gi en omfattende forståelse av toksisitet på systemnivå som kan forhindre potensiell legemiddelrelatert toksisitet [10]. I denne forbindelse har integrerende multiorgantoksikologiske tilnærminger med genekspresjonsprofilering blitt brukt i toksisitetsprediksjonsmodellstudier for å overvinne toksisitetsdata avledet fra toksisitetsevaluering av enkeltorganer, som er utilstrekkelig til å forstå de toksiske mekanismene til legemidler i systemet [11].

I denne studien beskriver vi toksisiteten til ifosfamid inyreogleveretter akutt og gjentatt eksponering hos Sprague-Dawley (SD) rotter. Støttende genekspresjonsprofileringsanalyser ble utført for å avsløre det vanlige målgenet som ble endret av ifosfamid i både lever ognyre, noe som tyder på et innblikk i integrerende ifosfamid-toksisitet.

2. Resultater

2.1. Enkeltdose toksisitetsstudie

Ingen toksisitet ble observert i gruppene 12,5, 25 og 50 mg/kg ifosfamid – ikke død, toksiske symptomer, endringer i kroppsvekt eller histopatologiske funn.

I mellomtiden, i hematologistudien, sank de relative tellingene av retikulocytter (RET) og absolutte tellinger av nøytrofiler (NEUA) og lymfocytter (LYMA) på en doseavhengig måte.

2.2. En ukes toksisitetsstudie med gjentatt dose

Den totale kroppsvekten gikk ned etter 1 ukes administrering av ifosfamid, og gjennomsnittsverdiene for kroppsvektstap i 100 mg/kg-gruppen var høyere enn de i 75 mg/kg-gruppen (tabell 1). I mellomtiden ble den relative organvekten gradvis økt i ifosfamid-behandlede grupper (tabell 2).

En uke med påfølgende ifosfamid IP-administrasjon undertrykte hematologiindeksen, inkludert RBC, HGB, HCT, MCV og PLT, på en doseavhengig måte (tabell 3). Dessuten økte BUN og CREA 1,2 ganger i kontrollgruppen sammenlignet med ifosfamidgruppen (tabell 4).Nyreskadeble ytterligere støttet av en histopatologisk studie.

Ingen histopatologiske tegn ble observert i leveren til mus i 75 og 100 mg/kg ifosfamidgruppene (figur 1A). I mellomtiden harnyrerfra 75 og 100 mg/kg ifosfamid-gruppene ble funnet å ha en minimal til liten grad av patologisk endring, inkludert tubulær degenerasjon/dilatasjon (1 moderat i 100 mg/kg-gruppen), enkeltcellet nekrose, urotelhyperplasi og fokal blødning /overbelastning (tabell 5). I tillegg ble det observert en tydelig økning i KIM-1-uttrykk i nyretubuliområdet inyreav 100 mg/kg-gruppen (figur IB).

2.3. Fire ukers toksisitetsstudie med gjentatt dose

Mortalitet ble observert i gruppene på 50 (5/10) og 70 (10/10) mg/kg behandlet etter henholdsvis 21 og 10 dager med påfølgende administrering. Dessuten er den reduserte kroppsvekten med økt relativ organvekt,lever, ognyre, i alle ifosfamid-behandlede grupper, støtter 4-ukers toksisitet ved gjentatt dose.

Hematologiske og serum biokjemiske analyser ble utført på de overlevende forsøkspersonene. Flere blodparametere, inkludert RET, RBC, MONA, EOSA og LUCA, ble signifikant redusert etter 4 ukers administrering av ifosfamid.

Sammenlignet med kontrollgruppen viste biokjemiske analyser statistiske forskjeller etter 4 ukers administrering av ifosfamid. For eksempel ble nivåene av AST og CK betydelig økt, og A/G-forholdet, GLU og GGT ble redusert (p < 0.01)="" i="" gruppen="" som="" ble="" behandlet="" med="" 50="" mg/kg,="" sammenlignet="" med="" kontrollen="">

2.4. Ifosfamid-indusert genekspresjonsanalyse

De ifosfamid-induserte DEG-ene ble identifisert i leveren ognyrevev (tabell 6). For leveren inkluderte de differensielt uttrykte genene 2672 gener ved 100 mg/kg kroppsvekt/dag, 1283 gener ble oppregulert og 1389 gener ble nedregulert. I nyrene ble 401 gener differensielt uttrykt ved 100 mg/kg kroppsvekt/dag - 149 gener ble oppregulert, og 252 gener ble nedregulert. Både i leveren og nyrene var antallet nedregulerte gener større enn antallet oppregulerte gener. Dette kan tyde på at ifosfamidbehandling ser ut til å hemme genuttrykk.

De biologiske funksjonsanalyseresultatene er oppført i tabell 7. Den 1-uke administreringen av ifosfamid ble funnet å endre gener relatert til organutvikling, hovedsakelig i leveren. Inyre, ble det bekreftet at genene relatert til immuncellelokalisering for det meste var påvirket.

I den kanoniske veianalysen av DEG-er var endringer i kolesterolsyntese og antigenpresentasjonsveirelaterte gener tydelige ileverognyrehenholdsvis vev (figur 2). Dessuten var LXE/RXR og akuttfaseresponssignalering den vanlige toppregulerte kanoniske veien ileverognyre, som var implisert i henholdsvis lipidhomeostase og inflammatorisk cytokinsignalering.

I levertokslisteanalysen ble kolesterolsyntese-relaterte gener for det meste påvirket, etterfulgt av de positive akuttfaseresponsproteinene og panelet for akutt nyresvikt (tabell 8). Videre avslørte nyrelisteresultatene at de nyresviktrelaterte genene generelt ble påvirket av ifosfamid, inkludert reversible glomerulonefritt biomarkører og panel for akutt nyresvikt.

Basert på IPA-kunnskapsbasen regulerer en felles oppstrømsregulator genuttrykk i lever og nyre etter ifosfamidbehandling (Figur 3). IRF7 var hovedregulatoren som endret seg i både lever og nyre og ble funnet å samhandle med andre målgener som USP18, RSAD2 og ISG15. Videre bekreftet sanntids RT-PCR-analyse uttrykket av IRF7, USP18, RSAD2 og ISG15. Selv om omfanget av endringene i hvert gen var forskjellig mellom lever og nyre, ble ekspresjonen undertrykt i både lever- og nyrevev etter 1 ukes administrering av ifosfamid. RSAD2 og USP18 har stort sett endret gener ved ifosfamidbehandling i henholdsvis lever og nyre.

3. Diskusjon

I denne studien ble omfattende ifosfamid-toksisitet i flere organer utforsket med forskjellige doser og eksponeringsvilkår gjennom IP-ruten hos rotter under GLP-standarden. I klinikker kan ifosfamid utøve en bimodal antitumorvirkning med cytotoksiske og immunmodulerende effekter kombinert med adoptiv immunterapi [12]. Ifosfamid er kjent for å elimineres hovedsakelig via nyrene og omtrent 80 prosent av dosen er i uendret form, nefrotoksisitet er en vanlig kjent bivirkning av ifosfamid, og metabolitter som kloracetaldehyd og akrolein er ansvarlige for den kliniske bruken [13, 14].

I denne studien var en 1-ukers gjentatt toksisitetsstudie egnet for å utforske ifosfamid-avledet organtoksisitet. En uke med ifosfamid-administrasjon undertrykte blodindeksen på en doseavhengig måte, noe som kan reflektere typisk ifosfamid-avledet myelosuppresjon. Sammen med nefrotoksisitet har flere rapporter indikert at myelosuppresjon er en av de viktigste dosebegrensende ifosfamidtoksisitetene, og leukopeni er generelt mer alvorlig enn trombocytopeni [15,16]. Ifosfamid nefrotoksisitet kan føre til Fanconi syndrom, der det er en svekkelse av proksimal tubulifunksjon som resulterer i irreversibel skade, og den toksiske metabolitten akrolein provoserer urotoksisitet med hemorragisk cystitt [17]. Dette er i samsvar med resultatene fra denne studien. I den histopatologiske studien ble nyrene og leveren undersøkt for å utforske ifosfamid-avledede patologiske endringer. Både i gruppene som ble administrert med 75 og 100 mg/kg ifosfamid, ble store områder med tubulær degenerasjon og utvidelse påvist med urotelhyperplasi i nyrebekkenområdet. Videre støttet uttrykket av KIM-1, et nyreproksimalt tubulusskademolekyl, tilstedeværelsen av ifosfamid-relatert nefrotoksisitet. I mellomtiden ble bare minimal periportal vakuolering observert i leveren. Dessuten, selv om ASAT- og ALAT-verdiene sank på en doseavhengig måte, var endringene innenfor referanseområdet [18]. Dypere årsaker til reduserte leverenzymnivåer må studeres videre. Det er generelt akseptert at ifosfamid er et alkyleringsmiddel som sjelden er assosiert med levertoksisitet, og bare noen få tilfeller har blitt rapportert å indusere leverskade, spesielt når det kombineres med andre kjemoterapeutiske legemidler som doksorubicin [19].

Nylig har bemerkelsesverdige fremskritt innen genuttrykksdata i toksikologi med høykapasitetsteknologier ført til generering av tilstrekkelig store datasett i toksisitetsstudier, og mange forsøk har blitt gjort på å anvende genprofilen til prediksjon av kjemisk toksisitet [10,20]. I denne studien ble mikroarray-analyse utført for å analysere transkriptomresponsen indusert av ifosfamid-administrering, og DEG-er med en foldendring større enn eller lik 1,5 ble valgt som målgenet og den biologiske funksjonen, kanonisk vei og Tox-listeanalyse ble brukt å forstå funksjonen til ifosfamid-induserte gener. En ekstra oppstrøms regulatoranalyse ble utført for å evaluere muligheten for multiorgantoksisitet i lever og nyre.

I denne studien ble DEG endret 1.5- ganger valgt, og de nedregulerte genene var litt mer dominerende enn de oppregulerte genene i både leveren (52 prosent) og nyrene (62 prosent). De biologiske funksjonsanalyseresultatene indikerte at ifosfamid endrer genene, med biologiske funksjoner relatert til vevsutvikling som ofte observeres i både lever og nyre.

En tidligere studie av Snouber et al. [21] rapporterte ifosfamidbehandling ble funnet å nedregulere Nrf-2-mediert stressoksidative responsveier i mikrofluidkulturen [21]. I samsvar med de tidligere studiene ble den NRF2-mediert oksidativt stress-responsveien signifikant modulert av toppnettverk, noe som ble bekreftet av både den nåværende kanoniske banen og tokslisteanalysen. De nåværende endrede Nrf-2-medierte stressoksidative responsveiene kan være nært knyttet til den toksiske ifosfamidmetabolitten. Flere ifosfamid-toksiske metabolitter kan reagere med GSH, en potent antioksidant, for å danne konjugater på forskjellige steder langs veien, og en reduksjon i GSH-nivået resulterer i økt toksisitet, noe som indikerer implikasjonen av oksidativt stress i ifosfamid-organtoksisitet [8,22 ]. I denne forbindelse ble mesna og N-acetylcystein brukt for å lindre ifosfamid organtoksisitet. Mesna fungerer som et regionalt detoksifiserende middel ved å binde seg til ifosfamid-toksisk metabolitt, hovedsakelig mot akrolein, gjennom en Michael-tilsetning for å danne et mindre skadelig stoff [23]. I tillegg er det rapportert at N-acetylcystein har antioksidantaktivitet og forbedrer GSH-utarming under forhold med oksidativt stress [24]. Ytterligere studier er nødvendig for å belyse det nøyaktige forholdet mellom ifosfamid-motgift og vei regulert under nefrotoksiske forhold. Vi kan spekulere i at ifosfamidtoksisitetsforbedring av mesna eller N-acetylcystein kan følges av forbedrede Nrf-2-mediert stressoksidative responsveier.

I denne studien ble de betennelsesrelaterte signalene ofte oppregulert i både lever og nyre, noe som kan gjenkjennes ved akutt fasesignalering i kanonisk veianalyse. Dette resultatet indikerte implikasjonen av inflammatorisk reaksjon i patofysiologien til ifosfamid organtoksisitet i begge vev, noe som ble ytterligere støttet av oppstrøms regulatoranalysen. I oppstrømsregulatoranalysen ble IRF7 og interferon (IFN) signalrelaterte gener, inkludert USP18, RSAD2 og ISG15, valgt som vanlige oppstrømsregulatorer i lever og nyre. IRF7 er en lymfoid-spesifikk faktor, som er konstitutivt uttrykt i immuncellens cytoplasma, og kan også induseres av type I interferon, virusinfeksjon og ytre stimuli i ulike celler [25]. En tidligere studie rapporterte kontroversielle pro- eller anti-onkogene egenskaper til IRF7 i forskjellige tumorceller, og endringene i IRF7-ekspresjon var assosiert med DNA-skade [26–28].

I tillegg til sin viktige regulatoriske rolle i type I IFN for antivirale funksjoner, ble IRF7 rapportert å undertrykke inflammatoriske responser gjennom TLR4-signalveien [29]. Dessuten har Stout-Delgado et al. [30] rapporterte at aldringsindusert oksidativ økning svekker IRF7-aktiviteten, mens reduksjon av stresset med antioksidantmidler forbedret IRF7-aktiviteten. I denne studien undertrykte ifosfamid-administrasjon uttrykket av oppstrømsregulatorer, og uttrykksmønstrene var identiske i både lever og nyre. De nåværende endringene i IRF7-uttrykk kan være relatert til den inflammatoriske reaksjonen og cytotoksiske alkyleringsmiddelegenskapen til ifosfamid, noe som kan antyde IRF7 som et lovende mål for ifosfamid-organtoksisitet.

I denne studien fant vi et gen som var identisk hemmet i både lever og nyre etter administrering av ifosfamid, men tolkningen av dets toksikologiske betydning var kun fokusert på nyrene, noe som begrenser den nåværende oppdagelsen. Videre kan ytterligere bekreftende studier relatert til effekten av den kommersielt tilgjengelige ifosfamid-motgiften på det for tiden endrede genet støtte de nåværende funnene.

Som konklusjon ble det funnet at en gjentatt toksisitetsstudie (1 uke) med administrering av ifosfamid hadde partisk nefrotoksisitet snarere enn levertoksisitet. I tillegg gir de nåværende resultatene bevis for ifosfamid-indusert levertoksisitet og nefrotoksisitetsmekanisme som involverer IRF-7-hemming. Ytterligere toksikogenomiske studier av immunrelaterte organer er nødvendig for å belyse den systemiske toksikologiske mekanismen til ifosfamid, og for å støtte forholdet mellom gen- og organtoksisitet.

4. Materialer og metoder

4.1. Dyrestudie

Åtte uker gamle hannspesifikke patogenfrie Sprague-Dawley (SD) rotter (n=140) ble hentet fra Orient Bio Inc. (Seongnam, Korea). Dyrene ble undersøkt og akklimatisert til laboratoriemiljøforhold i en uke før forsøket. Alle dyrene ble holdt i plastbur under kontrollerte laboratorieforhold (temperatur, 23 ± 3 ◦C; fuktighet, 55 ± 10 prosent; og 12/12-t lys/mørke syklus) med laboratoriemat og vann ad libitum. Dyrestudien ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Korea Institute of Toxicology (Daejeon, Korea), og alle prosedyrer ble utført i samsvar med Testing Guidelines for Safety Evaluation of Drugs fra Korea Food and Drug Administration. Dyrestudien ble delt inn i tre seksjoner: enkeltdose (akutt) og gjentatt dose (1 uke og 4 uker) påfølgende administrasjonstoksisitetsstudie. Førti rotter ble tilfeldig tildelt fire grupper (kontroll, t1, t2 og t3) ved bruk av Path/Tox-systemet (versjon. 4.2.2, Xybion Medical Systems Corporation, Lawrenceville, NJ, USA) i hver toksisitetsstudie.

4.2. Toksisitetseksperiment

Toksisitetsstudien ble delt inn i tre seksjoner: toksisitetsstudier med enkeltdoser (akutt) og to gjentatte doser (påfølgende dose på 1 uke eller 4 uker). For hver toksisitetsstudie ble rottene tilfeldig tildelt til adekvate grupper (kontroll, dose 1, dose 2 og dose 3 for toksisitetsstudier med enkelt- og 4-ukers; kontroll, dose 1 og dose 2 for 1- ukes toksisitetsstudie) ved å bruke Path/Tox-systemet (versjon. 4.2.2, Xybion Medical Systems Corporation, Lawrenceville, NJ, USA). I toksisitetsstudien ble ifosfamid administrert via intraperitoneal (IP) rute, og kontrollgruppen mottok destillert vann (DW). Ifosfamiddosen som ble brukt i toksisitetsstudien var som følger: akutt toksisitetsstudie (12,5, 25 og 50 mg/kg), 1-ukers toksisitetsstudie (75 og 100 mg/kg kroppsvekt/dag), og {{19 }}ukes toksisitetsstudie (25, 50 og 70 mg/kg kroppsvekt/dag). Dyrenes generelle kliniske symptomer, kroppsvekt og dødelighet ble registrert daglig under administrering, og alle dyrene ble avlivet 24 timer etter siste ifosfamid-administrasjon. Blodprøver ble samlet og plassert i mikrosentrifugerør og EDTA-K2-rør for henholdsvis serumbiokjemi og hematologisk analyse. Lever- og nyrevev ble fiksert i formaldehyd og utsatt for histopatologisk analyse. Ytterligere immunhistokjemi, mikroarray-analyse og sanntids RT-PCR ble utført på lever- og nyrevev fra den subakutte toksisitetsstudien (100 mg/kg BW/dag).

4.3. Hematologisk og serum biokjemisk analyse

Standard hematologiske tester ble utført ved bruk av et ADVIA 120 hematologisystem (Bayer, Fernwald, Tyskland). Følgende indikatorer ble brukt: antall hvite blodlegemer (WBC), antall røde blodlegemer (RBC), hematokrit (HCT), hemoglobinkonsentrasjon, gjennomsnittlig korpuskulært volum (MCV), gjennomsnittlig korpuskulært hemoglobin (MCH), antall blodplater (PLT), antall lymfocytter (LYM), monocytter (MON), nøytrofiler (NEU), basofile (BAS), eosinofiler (EOS), og store ufargede celler (LUC), og retikulocytter (RET).

Biokjemianalysen ble utført ved bruk av en automatisk analysator (TBA 120FRNEO; Toshiba Corp., Tokyo, Japan) med sentrifugert serum. De viktigste biokjemiske indikatorene var alaninaminotransferase (ALT), aspartataminotransferase (AST), alkalisk fosfatase (ALP), blodurinnitrogen (BUN), kreatinin (CREA), glukose (GLU), totalkolesterol (TCHO), albumin/globulin-forhold (A/G), triglyserider (TG), total bilirubin (TB), gamma-glutamyltransferase (GGT), fosfolipider (PL), kalsium, klorid, uorganisk natrium, fosfor og kalium.

4.4. Histopatologisk og immunhistokjemiundersøkelse

Parafininnstøpt vev ble snittet i 5-µm tykkelse, farget med hematoksylin og eosin (H&E), og undersøkt mikroskopisk.

Nyrevevet ble utsatt for immunhistokjemi. De avparafiniserte og vaskede seksjonene ble preinkubert med 10 prosent geiteserum for å blokkere uspesifikk farging. Objektglassene ble deretter inkubert over natten med det primære anti-KIM1-antistoffet (1:750; Santa Cruz, CA, USA). Etter fjerning av primære antistoffer ble snittene behandlet med VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Vector Laboratories, Peterborough, Storbritannia), og KIM1-uttrykk ble undersøkt under et lysmikroskop.

4.5. Mikroarray-analyse og protein-protein-interaksjonsanalyse (PPI).

Leveren og nyrene fra 1-ukegruppen (100 mg/kg) ble homogenisert, og det totale RNA ble ekstrahert med et RNase-minisett (Qiagen). cDNA-syntese ble oppnådd ved bruk av et cDNA-syntesesett (Affymetrix, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) og utsatt for mikroarray- og PPI-analyser.

Mikroarray-analyse ble utført med Affymetrix GeneChip Rat {{0}}.0 med GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix Santa Clara, CA, USA), og resultatene ble behandlet ved å bruke GeneSpring GX v13.0 analyseprogramvare (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). De differensielt uttrykte genene (DEG), som endret seg mer enn 1.5- ganger etter administrering av ifosfamid, ble valgt ved hjelp av en enveis variansanalyse (ANOVA) med Tukeys post hoc-test. De biologiske funksjonene og kanoniske banene til de utvalgte DEG-ene ble analysert ved hjelp av programvaren Ingenuity Pathway Analysis (IPA, ver. 9.0; Ingenuity Systems, Redwood City, CA, USA), og en oppstrøms regulatoranalyse ble utført for å identifisere oppstrømsregulatorene som kan være ansvarlig for DEGs avledet fra ifosfamid-toksisitet. Ytterligere protein-protein interaksjon (PPI) nettverksanalyse av DEG-ene ble utført ved bruk av STRING-programvare (versjon 10), og interaksjonen ble bekreftet når middels konfidenspoengsum var over 0,4. Proteininteraksjon er den omtrentlige sannsynligheten for at det eksisterer en spådd kobling mellom to proteiner i Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes-veien.

4.6. Kvantitativ sanntids RT-PCR-studie

Uttrykket av vanlige regulatorgener i mikroarray-studien ble bekreftet ved bruk av kvantitativ sanntids RT-PCR. Genspesifikke primere ble oppnådd fra Bioneer (Daejeon, Korea). Primersekvensene var som følger: interferon regulatorisk faktor 7 (IRF7): fremover, 5-TGCTTGTCTAGCACCAATAG-3 og revers, 5-CACAAGGTCCACTAGAGATG-3; ubiquitin-spesifikk peptidase 18 (USP18): fremover, 5-CTGTAGTTTGTCTCCCAACA-3 og revers 5-GAACTGATTACCTCCCACTG-3; radikalt S-adenosylmetionin-domene som inneholder 2(RSAD2): fremover, 5-ACCAATCATCAGAGGTTGAC-3 og omvendt, 5-CTGCATGATTGTTCTTGGAC-3; interferon-stimulert gen 15 (ISG15): fremover, 5-AAGTCTCCCAAGACCAATTC-3og revers, 5-CTACATTGGCTCTGGATAGG-30.

Totalt RNA ble revers-transkribert til cDNA ved bruk av SuperScript II (Invitrogen, Carls bad, CA, USA) og oligo-dT-primere, i henhold til produsentens instruksjoner. mRNA-ekspresjonsnivåer av oppstrøms reguleringsrelaterte gener ble analysert ved å bruke theStepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) med anSYBR Green master mix (Applied Biosystems), i henhold til produsentens protokoll. 18S ribosomal RNA-primeren ble brukt som en intern kontroll, og resultatene ble uttrykt som fold endring i forhold til den normale kontrollgruppen.

4.7. Statistisk analyse

Dataene ble statistisk analysert ved hjelp av flere sammenligningsmetoder. Når Bartletts test ikke viste noen signifikante avvik fra varianshomogenitet, ble variansanalyse (ANOVA) brukt for å bestemme om noen av gruppegjennomsnittene var forskjellig ved signifikansnivået p < {0}}.05.="" i="" tillegg="" ble="" dunnetts="" test="" brukt="" til="" å="" bestemme="" forskjeller="" i="" data="" mellom="" kontroll-="" og="" behandlingsgruppene="" når="" dataene="" ble="" funnet="" å="" være="" signifikante="" fra="" anova-testen.="" videre,="" når="" signifikante="" avvik="" fra="" varianshomogenitet="" ble="" observert="" fra="" bartletts="" test,="" ble="" en="" ikke-parametrisk="" sammenligningstest,="" kruskal–wallis="" (h)="" test,="" utført="" for="" å="" bestemme="" om="" noen="" av="" gruppegjennomsnittene="" var="" forskjellig="" ved="" p="">< 0,05.="" når="" en="" signifikant="" forskjell="" ble="" observert="" i="" kruskal–wallis="" (h)-testen,="" ble="" dunn's="" rank="" subtest="" utført="" for="" å="" kvantifisere="" de="" spesifikke="" gruppedataparene="" som="" var="" signifikant="" forskjellige="" fra="" gjennomsnittet.="" fishers="" eksakte="" test="" ble="" utført="" for="" å="" sammenligne="" datapar="" (inkludert="" prevalens="" og="" prosentandel).="" sannsynlighetsnivået="" ble="" satt="" til="" 1="" eller="" 5="" prosent.="" statistiske="" analyser="" ble="" utført="" ved="" å="" sammenligne="" dataene="" fra="" de="" forskjellige="" behandlingsgruppene="" med="" de="" fra="" kontrollgruppen="" ved="" bruk="" av="" path/tox="" (versjon.="" 4.2.2,="" xybion="" medical="" systems="" corporation,="" lawrenceville,="" nj,="">

Datatilgjengelighetserklæring:

Data er inneholdt i artikkelen eller tilleggsmaterialet.

Interessekonflikter:

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser.

Referanser

1. Palmerini, E.; Setola, E.; Grignani, G.; D'Ambrosio, L.; Comandone, A.; Righi, A.; Longhi, A.; Cesari, M.; Paioli, A.; Hakim, R.; et al. Høydose ifosfamid hos residiverende og uoperable høygradige osteosarkompasienter: En retrospektiv serie. Cells 2020, 9, 2389. [CrossRef]
2. Klastersky, J. Bivirkninger av ifosfamid. Onkologi 2003, 65, 7–10. [CrossRef]
3. Sprangers, B.; Lapman, S. Voksesmerter av ifosfamid. Clin. Nyre J. 2020, 13, 500–503. [CrossRef]
4. Elias, AD; Ayash, LJ; Wheeler, C.; Schwartz, G.; Tepler, I.; McCauley, M.; Mazanet, R.; Schnipper, L.; Frei, E., 3.; Antman, KH Høydose ifosfamid/karboplatin/etoposid med autolog hematopoietisk stamcellestøtte: Sikkerhet og fremtidige retninger. Semin. Oncol. 1994, 21, 83–85. [PubMed]
5. Mollenkopf, A.; Du Bois, A.; Meerpohl, HG Sekvensielt kurs og prospektiv behandling av ifosfamid-indusert multiorgantoksisitet. Geburtshilfe Frauenheilkd. 1996, 56, 525–528. [CrossRef]
6. Aleksa, K.; Matsell, D.; Krausz, K.; Gelboin, H.; Ito, S.; Koren, G. Cytokrom P450 3A og 2B6 i den utviklende nyren: Implikasjoner for ifosfamid nefrotoksisitet. Pediatr. Nephrol. 2005, 20, 872–885. [CrossRef] [PubMed]
7. Lowenberg, D.; Thorn, CF; Desta, Z.; Flockhart, DA; Altman, RB; Klein, TE PharmGKB sammendrag: Ifosfamidveier, farmakokinetikk og farmakodynamikk. Farmakogenet. Genom. 2014, 24, 133. [CrossRef] [PubMed]
8. MacAllister, SL; Martin-Brisac, N.; Lau, V.; Yang, K.; O'Brien, PJ Acrolein og kloroacetaldehyd: En undersøkelse av celle- og cellefrie biomarkører for toksisitet. Chem. Biol. Samhandle. 2013, 202, 259–266. [CrossRef]
9. Kim, J.; Shin, M. En integrerende modell av multi-organ narkotika-indusert toksisitet prediksjon ved hjelp av gen-ekspresjon data. BMC Bioinform. 2014, 15, S2. [CrossRef]
10. Alexander-Dann, B.; Pruteanu, LL; Oerton, E.; Sharma, N.; Berindan-Neagoe, I.; Módos, D.; Bender, A. Utviklingen innen toksikogenomikk: Forstå og forutsi forbindelsesindusert toksisitet fra genuttrykksdata. Mol. Omics 2018, 14, 218–236. [CrossRef]
11. An, YR; Kim, JY; Kim, YS Konstruksjon av en prediktiv modell for å evaluere multippel organtoksisitet. Mol. Celletoksikol. 2016, 12, 1–6. [CrossRef]
12. Binotto, G.; Trentin, L.; Semenzato, G. Ifosfamid og cyklofosfamid: Effekter på immunovervåking. Onkologi 2003, 65, 17–20. [CrossRef]
13. Schwerdt, G.; Gordjani, N.; Benesic, A.; Freudinger, R.; Wollny, B.; Kirchhoff, A.; Gekle, M. Kloroacetaldehyd- og akroleinindusert død av humane proksimale tubuliceller. Pediatr. Nephrol. 2006, 21, 60–67. [CrossRef]
14. Ensergueix, G.; Pallet, N.; Joly, D.; Levi, C.; Chauvet, S.; Trivin, C.; Augusto, JF; Boudet, R.; Aboudagga, H.; Touchard, G.; et al. Ifosfamid nefrotoksisitet hos voksne pasienter. Clin. Nyre J. 2020, 13, 660–665. [CrossRef]
15. Dechant, KL; Brogden, RN; Pilkington, T.; Faulds, D. Ifosfamide/mesna. En gjennomgang av dens antineoplastiske aktivitet, farmakokinetiske egenskaper og terapeutisk effekt ved kreft. Drugs 1991, 42, 428–467. [CrossRef]
16. Pronk, LC; Schrijvers, D.; Schellens, JHM; De Bruijn, EA; Planting, A.; Locci-Tonelli, D.; Groult, V.; Verweij, J.; Van Oosterom, AT Fase I-studie på docetaxel og ifosfamid hos pasienter med avanserte solide svulster. Br. J. Kreft. 1998, 77, 153–158. [CrossRef] [PubMed]
17. Skinner, R. Kronisk ifosfamid nefrotoksisitet hos barn. Med. Pediatr Oncol. 2003, 41, 190–197. [CrossRef]
18. Sharp, P.; Vilano, JS Laboratoriet rotte; CRC Press: Boca Raton, FL, USA, 2012.
19. Cheung, MC; Jones, RL; Judson, I. Akutt levertoksisitet med ifosfamid ved behandling av sarkom: en saksrapport. J. Med. Case Rep. 2011, 5, 180. [CrossRef]
20. Cui, Y.; Paules, RS Bruk av transkriptomikk for å forstå mekanismer for legemiddelindusert toksisitet. Farmakogenomikk 2010, 11, 573–585. [CrossRef]
21. Snouber, LC; Jacques, S.; Monge, M.; Legallais, C.; Leclerc, E. Transkriptomisk analyse av effekten av ifosfamid på MDCK-celler dyrket i mikrofluidiske biobrikker. Genomics 2012, 100, 27–34. [CrossRef] [PubMed]
22. Dirven, HA; Megens, L.; Oudshoorn, MJ; Dingemanse, MA; van Ommen, B.; Van Bladeren, PJ Glutationkonjugering av det cytostatiske stoffet ifosfamid og rollen til humane glutation S-transferaser. Chem. Res. Toxicol. 1995, 8, 979–986. [CrossRef]
23. Jeelani, R.; Jahanbakhsh, S.; Kohan-Ghadr, HR; Thakur, M.; Khan, S.; Aldhaheri, SR; Yang, Z.; Andreana, P.; Morris, R.; Abu-Soud, HM Mesna (2-merkaptoetan natriumsulfonat) fungerer som en regulator av myeloperoksidase. Free Radic. Biol. Med. 2017, 110, 54–62. [CrossRef]

24. Alnahdi, A.; John, A.; Raza, H. N-acetylcystein demper oksidativt stress og glutationavhengig redoksubalanse forårsaket av behandling med høy glukose/høy palmitinsyre i bukspyttkjertelen Rin-5F-celler. PLoS ONE 2019, 14, e0226696. [CrossRef]

25. Zhang, L.; Pagano, JS IRF-7, en ny interferonregulatorisk faktor assosiert med Epstein-Barr-viruslatens. Mol. Cell Biol. 1997, 17, 5748–5757. [CrossRef]
26. Pagano, JS Virus og lymfomer. N. Engl. J. Med. 2002, 347, 78–79. [CrossRef]
27. Romieu-Mourez, R.; Solis, M.; Nardin, A.; Goubau, D.; Baron-Bodo, V.; Lin, R.; Massie, B.; Salcedo, M.; Hiscott, J. Distinkte roller for IFN-regulatorisk faktor (IRF)-3 og IRF-7 i aktiveringen av antitumoregenskaper til humane makrofager. Cancer Res. 2006, 66, 10576–10585. [CrossRef]
28. Ning, S.; Pagano, JS; Barber, GN IRF7: Aktivering, regulering, modifikasjon og funksjon. Genes Immun. 2011, 12, 399–414. [CrossRef]
29. Chen, PG; Guan, YJ; Zha, GM; Jiao, XQ; Zhu, HS; Zhang, CY; Wang, YY; Li, HP Swine IRF3/IRF7 demper inflammatoriske responser gjennom en TLR4-signalvei. Oncotarget 2017, 8, 61958. [CrossRef]
30. Stout-Delgado, HW; Yang, X.; Walker, WE; Tesar, BM; Goldstein, DR Aldring svekker IFN-regulatorisk faktor 7-oppregulering i plasmacytoide dendrittiske celler under TLR9-aktivering. J. Immunol. Res. 2008, 181, 6747–6756. [CrossRef]