Jerntilskudd forsinker aldring og forlenger cellulær levetid gjennom potensering av mitokondriell funksjon Ⅱ

3.2. Jerntilskudd øker motstanden mot oksidativt stress

Klikk her for å få mer informasjon om hvordan Cistanche reduserer oksidativt stress i kroppen din

Cellulær aldring er assosiert medøkt oksidativt stresssom skader de biologiske systemene og demper aldersrelaterte sykdommer [34]. Siden jerntilskudd forsinket aldring, undersøkte vi effekten påoksidativt stress. Vi brukte enoksidativt stressinduktorforbindelse, hydrogenperoksid (H2O2), for å teste den oksidative motstanden til celler. Celler ble først dyrket i nærvær av jern til det stasjonære fasestadiet (72 timer) i SD-medium. Etter det ble celler vasket og inkubert med forskjellige konsentrasjoner av H2O2 i YPD-mediet og vokste i 24 timer.OksiderendeStressresistens ble analysert ved å sammenligne celleveksten til de H2O2-behandlede cellene med den ikke-behandlede kontrollen. Vi fant at celler supplert med jern var motstandsdyktige mot oksidativt stress sammenlignet med kontrollen (figurer2a og S3). For å bekrefte at jerntilskudd gir motstand mot oksidativt stress, ble BPS tilsatt jern og cellevekst med H2O2 ble analysert. Tilsetningen av BPS reduserte den oksidative stressmotstanden til jernsupplerte celler (figur2b). Disse resultatene korrelerer med jerntilskuddets rolle i å forsinke aldring og forlenge den cellulære levetiden.

3.3. Jerntilskudd styrker mitokondrielle funksjoner

Mitokondrier er det viktigste cellulære knutepunktet for jernutnyttelse og metabolisme [35–38]. En nedgang i mitokondriefunksjoner er assosiert med aldring [39–43]. Jern fungerer som en kofaktor for flere mitokondrielle proteiner, inkludert jern-svovelklynger og hemholdige proteiner [44–46]. Disse jernholdige proteinene er involvert i mitokondriell trikarboksylsyre (TCA) syklus og elektrontransportkjede (ETC) (figur 3a). Vi undersøkte om økningen i cellulær levetid ved jerntilskudd krevde mitokondrielle funksjoner. For å teste dette analyserte vi uttrykket av mitokondrielle TCA-syklusgener. Vi fant at jerntilskudd signifikant induserer ekspresjonen av flere TCA-syklusgener (figur 3b og S4a). TCA-syklusmetabolitter -ketoglutarat og oksalacetat kan produsere glutamat og aspartat ved kataplerotiske reaksjoner i mitokondrier (Figur 3a). Disse aminosyrene brukes i biosyntesen av proteiner, lipider og nukleotider [47–49]. Interessant nok ble uttrykket av biosyntetiske gener for glutamat (GDH1 og GDH3) og aspartat (AAT1 og AAT2) redusert i jernsupplerte celler (figur 3c). Denne uttrykksprofilen antyder at jerntilskudd fremmer bevaring i stedet for forbruket av TCA-syklus-mellomprodukter. I samsvar med denne ideen ble genuttrykk av de mitokondrielle anaplerotiske pathway-genene (PYC1, PYC2 og GDH2) betydelig økt i jernsupplerte celler (figur 3c). PYC1 og PYC2 koder for pyruvatkarboksylase som omdanner pyruvat til oksaloacetat. GDH2 koder for glutamatdehydrogenase som syntetiserer -ketoglutarat fra glutamat. Sammen antyder disse resultatene at jerntilskudd konfigurerer cellene i en metabolsk tilstand som favoriserer anaplerose og forhindrer kataplerose for å øke TCA-syklusmetabolittene.

Figur 3.Jerntilskudd forbedrer mitokondriefunksjonene. (a) En oversikt over mitokondrieTCA (trikarboksylsyre) syklus og ETC (elektrontransportkjede) med de viktigste kataplerotiske oganaplerotiske reaksjoner er illustrert. (b) Den prototrofe gjærstammen ble inkubert med 100µM FeSO4 og dyrket i et SD-medium i 8 timer ved 30◦C. RNA ble ekstrahert fra kulturene og deekspresjon av de indikerte TCA-syklusgenene ble analysert ved kvantitativ RT-PCR. (c) Uttrykkanalyse av kataplerotiske gener (GDH1, GDH3, AAT1,ogAAT2) og anaplerotiske gener (PYC1, PYC2,ogGDH2) ble utført ved kvantitativ RT-PCR. (d) Ekspresjonsanalyse av ETC-gener ble gjort avkvantitativ RT-PCR. Statistisk signifikant (*p < 0.05) was determined by Student's t-test.

TCA-syklusreaksjoner genererer NADH og FADH2 som er oksidert av ETC-komplekser I og II og nødvendige for funksjonaliteten til TCA-syklusen (figur3en). Selv omS. cerevisiaemangler kompleks I, reduserende ekvivalenter overføres til respirasjonskjeden gjennom NADH-dehydrogenaser. Succinatdehydrogenase spiller en sentral rolle og deltar i både TCA-syklusen og ETC-komplekset II (figur3en). Påfallende er uttrykket av succinatdehydrogenase (SDH1ogSDH2) ble sterkt oppregulert blant alle analyserte TCA-syklusgener (figur3b,d). Disse resultatene indikerer at TCA-syklusfluksen fortsetter mot ETC i stedet for å akkumulere et bestemt mellomprodukt. På samme måte ble uttrykket av alle andre gener av ETC-komplekser sterkt oppregulert i jernsupplerte celler (figur3d). ETC er assosiert med generering av reaktive oksygenarter (ROS), som regulerer uttrykket avSOD2gen [50]. Den koder for en mangan-superoksiddismutase (MnSOD) som er den viktigste renseren for mitokondrielt superoksid.SOD2genuttrykk ble oppregulert i jern-supplerte celler (tilleggsfigur S4a) som er i samsvar med uttrykket av ETC-gener. Vi analyserte videre det mitokondrielle membranpotensialet (MMP) som genereres av protonpumpene til ETC-kompleksene I, III og IV. Vi fant at jerntilskudd økte MMP til cellene (tilleggsfigur S4b). Vi undersøkte deretter strukturen til mitokondrier ved hjelp av fluorescensmikroskopi. Vi fant at jerntilskudd forhindrer fragmentering av mitokondrier (tilleggsfigur S4c). Til sammen indikerer disse resultatene at jerntilskudd potenserer mitokondriefunksjonene til cellene.

3.4. Jerntilskudd øker ATP-nivået som kreves for forlengelse av cellulær levetid

Mitokondrielle TCA-syklusreaksjoner produserer reduserende ekvivalenter NADH og FADH2 som overfører elektroner til ETC og genererer adenosintrifosfat (ATP) gjennom oksidativ fosforylering (OXPHOS) (figur3en). Siden uttrykket av TCA-syklusen og ETC-genene ble forbedret ved jerntilskudd, testet vi dens effekt på ATP-syntese. I samsvar med ekspresjonsprofilen til mitokondriell TCA-syklus, var ETC-genekspresjon og ATP-nivåer høye i jernsupplerte celler (figur4en). Vi spurte deretter om ATP er nødvendig for å forlenge levetiden til jernsupplerte celler. Vi hemmet ATP-syntesen og målte CLS av gjær. Antimycin A (AMA) er en hemmer av ATP-syntese som binder seg til kompleks III og blokkerer elektronoverføring i mitokondrie ETC [51]. Vi undersøkte først ATP-nivået og fant at AMA-behandling hemmer ATP-syntese (figur4b). Vi testet videre effekten av AMA på den cellulære levetiden til jernsupplerte celler. Gjærceller ble inkubert med jern og AMA i SD-mediet. Veksten av celler nådde metning etter 24 timer (tilleggsfigur S5). Deretter målte vi overlevelsen og fant at AMA-behandling hemmer den jerntilskuddsmedierte forlengelsen av levetiden (figur4c). Sammen viser disse funnene at jerntilskudd øker ATP-nivået som er nødvendig for å forlenge cellulær levetid. Vi observerte også at levetiden til AMA-behandlede celler var lavere enn kontrollen (figur4c), som ytterligere bekrefter at manglende evne til å syntetisere ATP kompromitterte levetiden.

3.5. Jerntilskudd forhindrer akselerert aldring av AMPK Knockout Mutant

AMPK er hovedregulatoren for cellulær energihomeostase [20,21]. Den høyt konserverte humane analogen av AMPK i gjærS. cerevisiaeer Snf1-proteinet [52]. AMPK aktiverer mitokondriefunksjoner for å produsere ATP under energibegrensede forhold. Nyere rapporter har vist at nedgangen i mitokondriefunksjoner med alderen delvis skjer gjennom svekket aktivitet av AMPK i forskjellige gamle organismer [53,54]. Dermed påvirker fraværet av AMPK-aktivitet mitokondriefunksjoner og kompromitterer en rekke cellulære funksjoner, inkludert metabolisme, motstand mot stress og celleoverlevelse som er de mest kritiske determinantene for aldring og levetid. I samsvar med tidligere studier har vifant ut atsnf1knockout-mutasjon kompromitterte ATP-nivå, motstand mot oksidativt stress og levetid (figur5a–c). 

Figur 5.Jerntilskudd redder den akselererte aldring av AMPK knockout-mutanten. Degjær prototrofisk villtype og AMPK knockout mutant (snf1∆) stammer ble dyrket til stasjonærefase i SD-medium i 72 timer ved 30◦C. (a) ATP-analyse av villtype ogsnf1∆ stammer. (b) Oksiderendestressanalyse av villtype ogsnf1∆ stammer med forskjellige H2O2 konsentrasjoner. (c) Kronologisklevetid (CLS) analyse av villtype ogsnf1∆ stammer. (d) ATP-analyse av villtype ogsnf1∆ stammerinkubert med forskjellige konsentrasjoner av FeSO4. (e) Oksidativ stressanalyse av villtype ogsnf1∆ stammer inkubert med forskjellige konsentrasjoner av FeSO4. (f) CLS-analyse av villtype ogsnf1∆ stammer inkubert med forskjellige konsentrasjoner av FeSO4. Statistisk signifikant (*p < 0.05) was determinedav studentenst-test.

Sidensnf1mutant er defekt i mitokondriefunksjoner, testet vi om jerntilskudd kan redde de akselererte aldringsfenotypene. Derfor supplerte vi jernet tilsnf1mutant og analyserte ATP-nivået, oksidativt stress og levetid. Vi fant at jerntilskudd økte ATP-nivået, motstanden mot oksidativt stress og levetiden (figur5d–f). Til sammen bekreftet disse funnene at jerntilskudd forsinker aldring og forlenger cellulær levetid ved å øke mitokondriefunksjonene.

4. Diskusjon

Næringsstoffer bestemmer den funksjonelle statusen til cellene og mangelen på essensielle næringsstoffer kompromitterer menneskers helse [55,56]. Videre er næringsstoffer de viktigste regulatorene av cellulær metabolisme som kontrollerer flere biologiske prosesser, inkludertaldring, en stor risikofaktor av flerekroniske sykdommer. En nedgang imetabolsk aktiviteter et av kjennetegnene tilaldring [10]. Nyere forskning på forskjellige organismer, inkludert pattedyr, har vist at det er mulig å forsinke aldring og øke helsespennet ved hjelp av anti-aldringsintervensjoner, inkludert rapamycin og metforminmedisin.11,16]. Disse stoffene retter seg mot de næringssansende kompleksene TORC1 og AMPK som er de viktige metabolske regulatorene til cellene [11,16]. 

Jern er et essensielt næringsstoff involvert i flere avgjørende metabolske reaksjoner i cellene [23–26]. Jernmangel svekker metabolsk aktivitet som resulterer i kompromitterte cellulære funksjoner, noe som fører til mange sykdommer, inkludert anemi, kognitiv svekkelse og tap avmuskelstyrke [26,57–59]. Jernmangel er utbredt i eldre populasjoner i alderenStørre enn eller lik65 år [60–62]. 

Siden jern regulerer metabolske prosesser, undersøkte vi dets rolle i aldring. Vi brukte gjær som en modellorganisme for å undersøke rollen til jern i kronologisk aldring. Vi undersøkte effekten av jerntilskudd på CLS av gjær. Vi fant at både FeSO4 og FeCl3 økt cellulær levetid. Ved å bruke forskjellige salter av sulfat, klorid og jernkelator, bekreftet vi at den cellulære levetiden forlenges med jern. Aldring er relatert til en gradvis akkumulering av oksidativt stress, som er skadelig for cellulære funksjoner og reduserer celleoverlevelse [34]. Siden vi fant ut at jerntilskudd forsinket aldring, testet vi om det kunne gi motstand mot oksidativt stress. For å undersøke fenotypen oksidativt stress behandlet vi cellene med det oksidative indusermiddel H2O2 og målte celleoverlevelsen. Vi fant at jerntilskudd økte motstand mot oksidativt stress sammenlignet med kontroll. Disse funnene korrelerer med rollen til jerntilskudd i forlengelsen av levetiden.

Vi avdekket ytterligere antialdringsmekanismen for jerntilskudd. Mitokondrier er de viktigste cellulære forbrukerne av jernutnyttelse og metabolisme [35–38]. Vi analyserte først uttrykket av mitokondrielle TCA-syklusgener. Vi fant at uttrykket av nesten alle TCA-syklusgener ble oppregulert av jerntilskudd. Viktigere, jerntilskudd nedregulerte uttrykket av mitokondriell anaplerose og oppregulerte kataplerotiske metabolske gener. Disse resultatene avslører at jerntilskudd forbedrer syntesen av TCA-syklus-mellomprodukter og forhindrer deres cellulære utnyttelse. Disse funnene støttet antialdringsaktiviteten til jerntilskudd, ettersom regelmessig eksport av TCA-syklus-mellomprodukter påvirker mitokondriell integritet [47]. Dessuten er etterfylling av mitokondriell karbonbasseng avgjørende for å opprettholde de mitokondrielle funksjonene som kreves for å overleve under cellulær aldring.

TCA-syklusen mellomliggende -ketoglutarat har vist seg å forlenge levetiden til forskjellige organismer [63]. Imidlertid fant vi at jerntilskudd økte uttrykket av -ketoglutarat dehydrogenase (KGD1ogKGD2) som konverterer - ketoglutarat for å danne succinyl-CoA. Dessuten observerte vi at uttrykket av succinatdehydrogenasegener (SDH1ogSDH2) ble sterkt oppregulert blant andre testede gener i TCA-syklusen. Viktigere er at succinatdehydrogenase deltar i både TCA-syklusen og ETC-komplekset II. Disse resultatene antydet at i stedet for å akkumulere et bestemt TCA-syklus-mellomprodukt, kan antialdringsaktiviteten til jerntilskudd involvere ETC-veien.

Siden TCA-syklusen er funksjonelt forbundet med ETC, analyserte vi uttrykket av ETC-gener. Vi fant at jerntilskudd sterkt oppregulerte uttrykket av ETC-gener. TCA-syklusprodukter NADH og FADH2 oksideres av ETC-komplekser og genererer ATP gjennom OXPHOS. Vi fant at jerntilskudd øker det cellulære ATP-nivået, som er korrelert med oppreguleringen av TCA-syklusen og ETC-genene. Deretter belyste vi om økningen i ATP-nivå ved jerntilskudd er nødvendig for å forlenge cellulær levetid. Vi fant at levetidsforlengelse ved jerntilskudd ble avskaffet ved å hemme ATP-syntese. Derfor antyder disse funnene at jerntilskudd øker nivået av ATP som er nødvendig for å forlenge cellulær levetid. Resultatene våre er i samsvar med de tidligere rapportene som viser rollen til ATP i den cellulære levetiden [51,64,65]. Videre brukte vi jerntilskudd for å forbedre mitokondrielle funksjoner og reddet den korte levetiden og den oksidative stresssensitive fenotypen til AMPK-mutanten. Til sammen avslørte disse resultatene at jerntilskudd potenserer mitokondriefunksjonene som forsinker aldring og øker cellenes levetid.

Nyere studier har vist at jerntilskudd gjenoppretter mitokondriedefekten til lysosomsvekkede mutanter og forhindrer mitokondriell nedgang under aldring.66,67]. Dermed støtter resultatene våre de tidligere funnene om at jerntilskudd forbedrer mitokondriefunksjonene. Interessant nok viste en av de tidligere studiene at jerntilskudd reddet den akselererte replikative aldring av lysosom-svekkede mutanter; imidlertideffekt på villtypecellene ble ikke inkludert i rapporten [67]. Likevel er resultatene våre korrelert med tidligere funn, og til tross for ulike aldringsmodeller (kronologisk aldring), fant vi at jerntilskudd forsinker aldring og øker cellulær levetid. Samlet antyder derfor våre resultater og tidligere rapporter tydelig at jerntilskudd kan være et potensielt terapeutisk middel for å målrette aldring og øke helsespennet.

Tilleggsmaterialer:Figur S1: Vekst og kronologisk levetidsanalyse av jernsupplerte gjærceller; Figur S2: Vekstanalyse av forskjellige jern-, sulfat- og kloridholdige salter-supplerte gjærceller; Figur S3: Oksidativ stressresistensanalyse av jernsupplerte gjærceller. Figur S4: Mitokondriell genuttrykk, membranpotensial og strukturanalyse av jernsupplerte gjærceller; Figur S5: Vekstanalyse av jern- og antimycin A-supplerte gjærceller; Tabell S1: Liste over primere brukt for RT-PCR i denne studien.

Forfatterbidrag:JLJ: Metodikk, formell analyse, undersøkelse og gjennomgang; TCYN: Metodikk, formell analyse, undersøkelse og gjennomgang; FN: Validering, formell analyse og gjennomgang; FE: Gjennomgang, redigering og tilsyn; MA: Konseptualisering, datakurering, metodikk, skriving, gjennomgang, redigering og veiledning. Alle forfattere har lest og godtatt den publiserte versjonen av manuskriptet.

Finansiering:Dette arbeidet ble støttet av Bioinformatics Institute (BII), A*STAR Career Development Fund (C210112008) og Global Healthy Longevity Catalyst Awards-stipendet (MOH-000758-00).

Anerkjennelser:Vi takker Maurer-Stroh Sebastian, Lee Hwee Kuan, Loo Lit Hsin, Chiam Keng Hwee og Prakash Arumugam for å støtte denne forskningen.

Interessekonflikter:Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske og ikke-finansielle interesser.

Referanser

1. Bloom, DE; Canning, D.; Lubet, A. Global befolkningsaldring: fakta, utfordringer, løsninger og perspektiver.Chall. Løsning. Perspektiv. Daedalus2015, 144, 80–92. 

2. FNs avdeling for økonomiske og sosiale saker, befolkningsavdelingen.Verdens befolkningsutsikter 2019; Høydepunkter (ST/ESA/SERA/423); FN: New York, NY, USA, 2019.

3. Robine, J.Aldrende befolkninger: Vi lever lengre liv, men er vi sunnere?FN, Department of Economics and Social Affairs, Population Division: New York, NY, USA, 2021; UN DESA/POP/2021/TP/NO.

4. Niccoli, T.; Partridge, L. Aldring som en risikofaktor for sykdom.Curr. Biol.2012, 22, R741–R752. [Kryssref] [PubMed] 

5. Hou, Y.; Dan, X.; Babbar, M.; Wei, Y.; Hasselbalch, SG; Croteau, DL; Bohr, VA Aldring som en risikofaktor for nevrodegenerativ sykdom.Nat. Rev. Neurol.2019, 15, 565–581. [Kryssref] [PubMed] 

6. Harman, D. Aldringsprosessen: Hovedrisikofaktor for sykdom og død.Proc. Natl. Acad. Sci. USA1991, 88, 5360–5363. [Kryssref] [PubMed] 

7. Partridge, L.; Deelen, J.; Slagboom, PE Å møte de globale utfordringene med aldring.Natur2018, 561, 45–56. [Kryssref] [PubMed] 8. Fontana, L.; Kennedy,

BK; Longo, VD; Seals, D.; Melov, S. Medisinsk forskning: Behandle aldring.Natur2014, 511, 405–407. [Kryssref] [PubMed] 

9. Fontana, L.; Partridge, L.; Longo, VD Forlenger sunn levetid - fra gjær til mennesker.Vitenskap2010, 328, 321–326. [Kryssref] [PubMed] 

10. López-Otín, C.; Blasco, MA; Partridge, L.; Serrano, M.; Kroemer, G. Kjennetegnene på aldring.Celle2013, 153, 1194–1217. [Kryssref] 

11. Partridge, L.; Fuentealba, M.; Kennedy, BK Jakten på å bremse aldring gjennom oppdagelse av narkotika.Nat. Rev. Drug Discov.2020, 19, 513–532. [Kryssref]

12. Zimmermann, A.; Hofer, S.; Pendl, T.; Kainz, K.; Laget av.; Carmona-Gutierrez, D. Gjær som et verktøy for å identifisere antialdringsforbindelser.FEMS Gjær Res.2018, 18, foy020. [Kryssref] 

13. Kaeberlein, M.; Burtner, CR; Kennedy, BK Nylig utvikling innen gjæraldring.PLoS Genet.2007, 3, e84. [Kryssref] 

14. Longo, VD; Shadel, GS; Kaeberlein, M.; Kennedy, B. Replikativ og kronologisk aldring iSaccharomyces cerevisiae. Cell Metab.2012, 16, 18–31. [Kryssref] 15. Longo, VD; Fabrizio, P. Kronologisk aldring i Saccharomyces cerevisiae.Aldring Res. Gjær2011, 57, 101–121. [Kryssref] 

16. Kulkarni, AS; Gubbi, S.; Barzilai, N. Fordeler med Metformin i å dempe kjennetegnene ved aldring.Cell Metab.2020, 32, 15–30. [Kryssref] 

17. Alfatah, M.; Wong, JH; Krishnan, VG; Lee, YC; Sin, QF; Goh, CJH; Kong, KW; Lee, WT; Lewis, J.; Hoon, S.; et al. TORC1 regulerer transkripsjonsresponsen på glukose og utviklingssyklus via Tap42-Sit4-Rrd1/2-banen i Saccharomyces cerevisiae.BMC Biol.2021, 19, 1–22. [Kryssref] 

18. Saxton, RA; Sabatini, DM mTOR-signalering i vekst, metabolisme og sykdom.Celle2017, 168, 960–976. [Kryssref]