Er sammenslutningen av de sjeldne Rs35667974 IFIH1-genpolymorfisme med autoimmune sykdommer et tilfelle av RNA-epigenetikk?

visualisering – AA, AP og EEE, tilsyn – EEE og finansieringsinnhenting – EEE. Alle forfattere har lest og godtatt den publiserte versjonen av manuskriptet. Abstrakt

Interferon indusert med helikase C-domeneholdig protein 1 (IFIH1)-gen koder for en cytoplasmatisk RNA-helikase ellers kjent som melanomdifferensieringsassosiert 5 (MDA5), en RIG-1-lignende RNA-helikase som gjenkjenner viralt RNA og er involvert i medfødt immunitet gjennom gjenkjennelse av viralt RNA. Ved binding til dobbelttrådet (ds) RNA, danner MDA5 en filamentøs sammenstilling langs lengden av dsRNA og bruker molekylære signaturer for å diskriminere selv, kontra ikke-selv basert på dsRNA-lengde og metylering. Missense-varianten rs35667974 er beskyttende mot type 1 diabetes, psoriasis og psoriasisartritt, men er også funnet å være assosiert med økt risiko for ankyloserende spondylitt, Crohns sykdom og ulcerøs kolitt. For å få innsikt i den komplekse rollen til denne varianten utførte vi en strukturell analyse av MDA5 i kompleks med dsRNA ved bruk av molekylær dynamikksimuleringer.

Våre data tyder på at mens Ile923Val-mutasjonen av rs35667974-varianten ikke påvirker bindingen til naturlig dsRNA signifikant, viser den en destabiliserende effekt i nærvær av 2'-O-uridinmetylering. Således introduserer tilstedeværelsen av 2'-O-metylering ved dsRNA en sensing signatur som fører til selektiv reduksjon av den totale MDA katalytiske aktiviteten. Denne studien representerer en evaluering av rollen til den delte rs35667974-varianten av autoimmun locus IFIH1, rapportert å føre til selektivt redusert katalytisk aktivitet av den modifiserte MDA5-fenotypen og, som en konsekvens, redusert negativ tilbakemelding på cytokin- og kjemokinsignalering og selektiv beskyttelse mot autoimmunitet .

Helicase C-domenet er et viktig enzymprotein som kan avvikle DNA-dobbelhelixstrukturen. Det kan hjelpe DNA til å fullføre riktig replikering, redigering og levering i prosessen med cellereplikasjon, reparasjon og transkripsjon, og er en av nøklene til normal funksjon av celler. Samtidig er immunitet en svært viktig forsvarsmekanisme i menneskekroppen, som effektivt kan beskytte oss mot patogener som bakterier og virus.

Studier har vist at helikase C-domenet spiller en viktig rolle i immunitet. Først av alt kan helicase C-domenet sikre stabiliteten og kodingseffektiviteten til gener ved å hjelpe normal replikasjon, reparasjon og transkripsjon av cellulært DNA, og dermed forbedre immuniteten til menneskekroppen. For det andre kan helikase C-domenet fremme gjenkjennelsen av proteinheterogenitetsmolekyler av celler, og regulere signaloverføringen til immunsystemet, og dermed støtte kroppens forsvarsfunksjon. Begge de to ovennevnte metodene har spilt en positiv rolle i å fremme vedlikehold og forbedring av immunitet.

I tillegg gir dybdestudiet av forholdet mellom helicase C-domenet og immunitet også viktig inspirasjon for oss til å oppdage nye medikamenter for behandling av kreft og immunrelaterte sykdommer. Medikamentutvikling og genterapi rettet mot helicase C-domenet kan forbedre kroppens motstand mot kreft og andre immunrelaterte sykdommer, og hjelpe pasienter bedre å takle behandling og utvinning av relaterte sykdommer.

For å oppsummere er forholdet mellom helikase C-domenet og immunitet veldig nært, og det spiller en viktig rolle i å sikre genstabilitet, fremme cellulær immunitet og støtte kroppsforsvar. Håpet er at vi gjennom relevant forskning og behandlingsmetoder bedre kan opprettholde og styrke menneskelig immunitet og skape et sunnere og bedre liv for oss. Fra dette synspunktet må vi styrke personlig immunitet. Cistanche har en betydelig effekt på å forbedre immuniteten fordi kjøttpasta er rik på en rekke antioksidantstoffer, som vitamin C, vitamin C, karotenoider osv. Disse ingrediensene kan rense frie radikaler og redusere oksidativt stress. Stimulere og forbedre motstanden til immunsystemet.

Klikk cistanche tubulosa fordeler

Nøkkelord

Enkelnukleotidpolymorfisme (SNP) · Molekylær modell · Interferon indusert med helikase C domene 1 (IFIH1) · Melanomdifferensieringsassosiert 5 (MDA5) · RNA-metylering.

Introduksjon

Gener og mekanismer involvert i autoimmune sykdommer, som påvirker omtrent 5 prosent av befolkningen, er fortsatt unnvikende, men akkumulering av data tyder sterkt på at forskjellige autoimmune sykdommer kan dele en felles genetisk bakgrunn, og påpeker dermed eksistensen av varianter som deles av forskjellige autoimmune sykdommer (Zhernakova et al. 2009). Forsøk på å nøste opp denne genetiske informasjonen til biologisk meningsfulle mekanismer som fører til sykdommer, refererer til identifisering av årsaksgener. Identifisering av sykdomsfremkallende varianter er en vanskelig, men nødvendig oppgave i forsøket på å etablere effektive metoder for sykdomsprediksjon, forebygging og intervensjon (Biros et al. 2005).

Ulike typer RNA-molekyler er involvert i reguleringen av flere biologiske prosesser, inkludert messenger-RNA (mRNA), overførings-RNA (tRNA), ribosomalt RNA (rRNA), mikroRNA (miRNA) og lang ikke-kodende RNA (lncRNA). RNA-molekyler inneholder tallrike (mer enn 150) kjemiske modifikasjoner (Machnicka et al. 2013; Boccaletto et al. 2018). Disse modifikasjonene er funksjonelt knyttet til alle stadier av RNA-metabolismen, som struktur, stabilitet og interaksjoner, og spiller kritiske roller i flere biologiske prosesser, som å modulere replikasjonen av virus og antivirale immunresponser (Machnicka et al. 2013). Blant dem er ribosemetylering blant de mest allestedsnærværende modifikasjonene som finnes i RNA. 2′-O-metyluridin finnes i rRNA, snRNA, snoRNA og tRNA fra Archaea, Bacteria og Eukaryota (Aučynaitė et al. 2018). Ribose-2′-Ometyleringen øker hydrofobisiteten til nukleotidene og beskytter dem mot virkningen av nukleaser (Yildirim et al. 2014).
Akkumulerende bevis indikerer at 2'-O-metylering av viralt RNA (2'OMe-RNA) spiller en viktig rolle i unndragelsen av cellulære medfødte immunresponser i vertscellene (Dimitrova et al. 2019). Züst og medarbeidere har vist at 2′ OMe av viralt RNA bidro til å unnslippe den interferon (IFN)-medierte antivirale responsen, og dermed fremme viral replikasjon (Züst et al. 2011). Vitali og Scadden har også foreslått at IU-dsDNA undertrykker MDA5 IFN-stimuleringsveien (Vitali og Scadden 2010).

Interferon indusert med helicase C domene 1 (IFIH1)-genet koder for en cytoplasmatisk RNA-helikase også kjent som MDA5 (Melanoma differensieringsassosiert protein 5), og det er en RIG-I-lignende reseptor (RLR) som utfører en antiviral funksjon i medfødt immunitet ved å påvise virale RNA. MDA5 gjenkjenner 0.5–1 kb RNA-dupleksstammestruktur som vanligvis dannes under picornaviral replikasjon og medierer en immunrespons på virusinfeksjon (Nejentsev et al. 2009; Crow 2011). MDA5, ved påvisning av lange virale dobbelttrådete RNA (dsRNA), generert under replikering av picornavirus, aktiverer type I interferon-signalveien. Studier har vist at MDA5 danner et filament langs dsRNA-lengden og bruker ATP-avhengig filamentdynamikk for å skille mellom seg selv og ikke-selv basert på dsRNA-lengde (Toro et al. 2015). MDA5 ble vist å være involvert i moduleringen av krysstale mellom celler og det medfødte/adaptive immunsystemet gjennom lokal produksjon av cytokiner og kjemokiner.

Endringer i MDA5-ekspresjon og/eller aktivitet kan utløse -celleresponser på dsRNA, et biprodukt av virusreplikasjon (Colli et al. 2010). Det har også blitt vist at mutasjon av flamentdannende assosierte rester resulterer i tap av filamentdannelse og MDA5-avhengig signalering, bortsett fra et par mutasjoner, som moderat forbedrer signalering. Disse resultatene tyder på at ATP-uavhengige mekanismer, dvs. tettere RNA-binding og/eller mer stabil protein-protein-interaksjon, sannsynligvis er ansvarlig for den observerte stabiliteten til MDA5-filamentdannelsen in vitro og for høyere signalaktivitet i celler (Sohn og Hur 2016).

Smyth et al. (2006) og Nejentsev et al. (2009) beskrev en sjelden allel av IFIH1-genet som gir beskyttelse mot type 1 diabetes (T1D). Denne rs35667974 IFIH1 enkeltnukleotidpolymorfismen (SNP), der konservert isoleucin (kodon [ATT]) i posisjon #923 endres til valin (kodon [GTT]), er en sjelden variant ettersom den mindre allelfrekvensen (MAF) er C {{ 9}}.010031 (2655 individer i en total prøve på 264690) basert på TOPMED (Taliun et al. 2021) og C = 0.016267 (3343 individer i en total prøve på 205514) basert på ALFA (Phan et al. al. 2020; Sherry et al. 2001). I tabell 1 presenteres den menneskelige biogeografien av frekvensen av polymorfismen i forskjellige kontinentale regioner basert på ALFA-prosjektdataene (Phan et al. 2020; Sherry et al. 2001). Senere studier bekreftet at denne sjeldne allelen hadde samme effekt på T1D, psoriasis (PS) (Li et al. 2010) og psoriasisartritt (PsA) (Budu-Aggrey et al. 2017). Tvert imot har denne SNP blitt assosiert som en risikofaktor for mottakelighet for utvikling av ankyloserende spondylitt (AS) (Ellinghaus et al. 2016), Crohns sykdom (CD) (Ellinghaus et al. 2016; Budu-Aggrey et al. 2017 ), og ulcerøs kolitt (UC) (Ellinghaus et al. 2016; Budu-Aggrey et al. 2017).

Chistiakov et al. (2010) har vist at tap av funksjonsmutasjoner E627X og I923V av MDA5 er assosiert med lavere poly(I:C)-indusert interferonproduksjon i perifere mononukleære blodceller hos type 1 diabetespasienter og er derfor T1D-beskyttende. Det er også uttalt at i MDA5-molekylet ligger I923V-aminosyresubstitusjonen i nærheten av en H927-rest, som bidrar til bindingen av dsRNA (Yoneyama og Fujita 2008). Imidlertid ble MDA-varianten I923V vist å ha en normal evne til å binde dsRNA, men en 2.5- ganger redusert katalytisk aktivitet (Shigemoto et al. 2009). Derfor ser denne polymorfismen ikke ut til å påvirke de nukleotidsyrebindende egenskapene til denne cytoplasmatiske RNA-følende helikasen i stor grad, men endrer dens funksjon ved en fortsatt ukjent mekanisme.

Sammenhengen mellom IFHI1-polymorfismen og forekomsten av enterovirusinfeksjon i T1D og assosiasjonen mellom MDA5 I923V-varianten og frekvensen av enteroviralt RNA hos T1D-pasienter er funnet (Looney et al. 2015). Videre viste nyere studier på MDA5-- og MAVSknockout-mus en kritisk rolle for disse proteinene i å formidle type 1-interferonresponser mot Coxsackie B-virus (Wang et al. 2010). Et mengovirus lederprotein er vist å forhindre ekspresjonen av IFN- ved å blokkere dimeriseringen av IRF3 som er nødvendig for aktivering av denne faktoren (Hato et al. 2007). Denne observasjonen antyder at varianter som forstyrrer IFIH1-funksjonen i vertens antivirale respons er blitt negativt selektert, snarere enn positivt valgt fordi de gir beskyttelse mot T1D (Crow 2011).

Chow et al. (2018) har omfattende analysert blant annet de RIG-I-lignende reseptorene, mens Brisse og Ly (2019) har gjennomgått omfattende utviklingen og spesifikasjonen av MDA5 og dens relaterte RIG-I. Plasseringen av de endrede restene i eller nær RNA-bindings- og ATP-bindingsstedene eller filamentgrensesnittet førte til at vi antok en hypotese om at de observerte mutasjonene kan forbedre stabiliteten til IFIH1-filamentet ved å øke den iboende affiniteten mellom IFIH1 og dsRNA eller mellom IFIH1 molekyler i filamentet eller ved å redusere effektiviteten til ATP-hydrolyse og dermed filamentets demonteringshastighet (Rice et al. 2014).

Dette arbeidet representerer en strukturell studie av den potensielle rollen til den delte rs35667974-varianten av autoimmun locus IFIH1, rapportert å føre til en hemmet funksjonsfenotype som koder for en Ile923Val-aminosyresubstitusjon i IFIH1-genproteinproduktet MDA5. Sistnevnte er et biologisk plausibelt kausalt kandidatgen som deles mellom flere sykdommer, og som påvirker kontrollen av det lokale uttrykket av cytokiner og kjemokiner som beskytter mot autoimmunitet (Colli et al. 2010). Dette arbeidet tar sikte på å utforske den ukjente stillestående mekanismen som Ile923Val-substitusjonen reduserer den katalytiske aktiviteten til human MDA5. I denne studien undersøkte vi forskjellene i interaksjonen mellom MDA5 og dsRNA mellom naturlig og den sjeldne varianten Ile923Val i initieringen av betennelsesmekanismen. Følgelig hadde vi som mål å undersøke den dynamiske oppførselen til det humane MDA5/dsRNA-komplekset i et vandig miljø i nærvær av Ile923 eller Val923 når uracil 2'-O er metylert eller ikke. Denne strukturelle analysen av sjeldne delte genetiske mottakelighets- eller beskyttelsessteder kan gi innsikt i vår forståelse av patofysiologien til autoimmune sykdommer, og forskningsresultatene kan påvirke bedre håndtering av sykdommene som studeres.

Materialer og metoder

Sekvenshenting, fylogenetisk trekonstruksjon og positiv seleksjonsanalyse

Proteinsekvensen til Homo sapiens (sekvens-ID: NP_071451.2) ble hentet fra UniProt-databasen (The UniProt Consortium 2021). For å finne homologer på tvers av arter, ble BLAST-søk utført med Mega BLAST (National Center for Biotechnology Information, NCBI, Bethesda, MD, USA) ved RefSeq og NR proteindatabasen (og PDB og UniProt) ved bruk av Blastp (protein–protein BLAST) med standardparametere (Altschul et al. 1997). 1000 homologer til de humane MDA5-proteinene ble først valgt og et utvalg på tvers av arter med fokus på det C-terminale domenet som inneholder sekvensen rundt den humane I923V-substitusjonen ble brukt for å identifisere denne variasjonen i andre arter. Clustal Omega, multippelsekvensjusteringsprogrammet (Clustal-O) (Sievers et al. 2011), og T-Cofee multippelsekvensjusteringsserver (Notredame et al. 2000; Di Tommaso et al. 2011) ble brukt til å utføre proteinsekvensjusteringer og Unipro UGENE plattform bioinformatikk programvare (Okonechnikov et al. 2012) for selektivt å visualisere flere justeringer.

Evolusjonsanalysen brukes til å identifisere posisjoner på proteinsekvensene som er sterkt bevart på tvers av arter, noe som indikerer strukturell betydning (Andreou et al. 2018). Det fylogenetiske treet ble konstruert ved bruk av Maximum Likelihood-metoden (Nei og Kumar 2000) og Tamura-Nei-modellen (Tamura og Nei 1993) med 500 bootstrap-replikater (Felsenstein 1985). De første treene for det heuristiske søket ble oppnådd automatisk ved å bruke Neighbor-Join- og BioNJ-algoritmer på en matrise med parvise avstander estimert ved bruk av Tamura–Nei-modellen og deretter velge topologi med overlegen log-sannsynlighetsverdi. Den fylogenetiske analysen involverte 52 homologe nukleotidsekvenser (39 ortologer og 13 paraloger) av det humane IFIH1-genet. Kodonposisjoner inkludert var 1. pluss 2. pluss 3. pluss Noncoding. Det var totalt 3729 stillinger i det endelige datasettet. Evolusjonsanalyser ble utført ved bruk av MEGA11-programvarepakken (Tamura et al. 2021).

For å oppdage om IFIH1-genet har utviklet seg adaptivt, har vi brukt codeml-programmet i PAML v4.9j-programvarepakken (Yang 2007). Nukleotidsekvensen og korresponderende proteinsekvensjusteringsfil ble sendt til PAL2NAL (Suyama et al. 2006) for å danne de riktige CODEML-inndata nukleotidjusteringsfilene. De positive seleksjonsanalysene for de ortologe MDA5-genene ble utført ved bruk av steds- og grenstedmodeller (Yang et al. 2005; Yang og Bielawski 2000). Det ikke-synonyme/synonyme substitusjonshastighetsforholdet (ω=dN/dS) gir et mål på selektivt trykk på aminosyrenivå. Størrelsen på verdien av dN/dS (ω) representerer typene seleksjon: ω<1 for negative selection, ω=1 for neutral selection, and ω>1 for positiv seleksjon (Yang et al. 2005). I CODEML ble stedsmodellene (M0, M1, M2, M3, M7 og M8) og grenstedmodeller (Clade A og C) valgt for å utføre den positive seleksjonsanalysen (Bielawski og Yang 2004; Yang og Nielsen 2002). I stedsmodellene ble likelihood ratio-testen (LRT) brukt for å teste positiv seleksjon ved å sammenligne de tre parene med modeller (M0/M3, M2/M1 og M7/M8). Analysen ble utført både for sekvensen i full lengde og C-Terminal Domain (CTD)-sekvensen.

Strukturanalyse og molekylær dynamikksimuleringer

Kryoelektronmikroskopi (cryo-EM) strukturen til hMDA5–dsRNA filament i nærvær av ATP (PDB ID: 6GKM) (Yu et al. 2018) (Berman et al. 2000) ble brukt som et modellsystem for molekylær dynamikk ( MD) simuleringer. Alle proteinrester ble løst (307–1020), de 14 baseparene av dobbelttrådet RNA (dsRNA) og den koordinerte sinken ble beholdt, mens manglende rester ble modellert ved bruk av SWISS-MODEL-serveren (Waterhouse et al. 2018). Kraftfeltparametere og hydrogenatomer ble lagt til ved bruk av XLEaP-modulen til AMBER 18 (Case et al. 2005). AMBER-kraftfeltene f14SB (Maier et al. 2015) og f99OL3 (Zgarbová et al. 2011) ble brukt for henholdsvis proteinet og RNA, med modrna08 (Aduri et al. 2007) parametere for modifiserte nukleosider. I923V-mutasjonen ble introdusert i MDA5 ved å manuelt fjerne Cδ-metylgruppen til I923, mens den modifiserte ribosen til U12 ble metylert ved 2′-O ved å bruke modrna08-bibliotekresten MRU. Sinkionet ble bundet med de 4 cysteinrestene 907, 910, 962 og 964, ved å bruke passende kraftfeltparametere for å beholde en tetraedrisk koordinasjonssfære (Zn–S-bindingslengder på 2,35 Å med 50 kcal·mol–1·Å–2 kraftkonstanter og S–Zn–S-vinkler på 109,5 grader med 25 kcal·mol–1·rad–2).

På denne måten forberedte vi 4 systemer for MD-simuleringene: (i) det opprinnelige MDA5–dsRNA, (ii) MDA5(V923)–dsRNA, (iii) MDA5–dsRNA(2′OMe), og (iv) MDA5( V923)–dsRNA(2′OMe). Alle systemene ble solvatisert i avkortede oktaedriske løsemiddelbokser med forhånds-ekvilibrerte TIP3P-vannmolekyler, med en minimumsbuffer på 10 Å rundt komplekset, og deretter ble det nødvendige antallet motioner tilsatt for å oppnå ladningsnøytralisering av systemene. MD-simuleringer ble utført med den GPU-akselererte versjonen av PMEMD (Salomon-Ferrer et al. 2013)-modulen i AMBER 18 og et tidstrinn på 2 fs. Temperaturen ble regulert ved hjelp av Langevin-termostaten med en kollisjonsfrekvens på 1,0 ps–1, mens trykket ble regulert med Berendsen-barostaten med en trykkavspenningstid på 1,0 ps. SHAKE ble brukt for å begrense bindinger som involverte hydrogenatomer med en toleranse på 10–6 Å, mens ikke-bundne interaksjoner ble beregnet med en direkte romgrense på 10 Å.

Energiminimering ble først utført for 1{{20}},000 trinn med posisjonsbegrensninger på 100 kcal·mol–1·Å–2 kraftkonstant på ikke-hydrogenatomene til MDA5-dsRNA. Løsningsmidlet ble deretter ekvilibrert ved 300 K og 1 atm gjennom korte runder med simuleringer i NVT- og NPT-ensemblene, henholdsvis 100 ps og 400 ps, ​​mens begrensningene på ikke-hydrogenatomer i det oppløste stoffet ble holdt. Deretter ble energiminimering utført i 10,000 trinn, men med posisjonsbegrensninger på 10 kcal·mol–1·Å–2 bare på C-atomene til MDA5 og fosfatryggraden i dsRNA. I 3 sub ble gradvis avslappet (10,0, 1,0, 0,1 kcal·mol–1·Å–2) gjennom 1 ns, etterfulgt av 9 ns uhemmet ekvilibrering under konstant trykk. Etter disse innledende 10 ns ekvilibrering (ikke brukt i analysen), ble 100 ns med produksjonssimuleringer i NPT-ensemblet utført for hvert system ved 300 K og 1 atm, mens øyeblikksbilder av systemet ble lagret hver 5.0 ps for analyse ved bruk av CPPTRAJ modul av AMBER 18 (Roe og Cheatham 2013). Alle figurer som viser 3D-modeller ble generert ved hjelp av PyMOL molekylært grafikksystem (v.2.3 open source build).

Resultater

Fylogenetisk analyse av Ile923Val-substitusjonen av MDA5

Utviklingen og spesifikasjonen av MDA5 og dens relaterte RIG-I er gjennomgått omfattende av (Brisse og Ly 2019). Her ble IFIH1-evolusjonen brukt for å definere bevaringselementer i MDA5-sekvensen om den spesielle polymorfismen. Evolusjonsanalyse avslørte tung sekvenskonservering blant MDA5 av forskjellige arter (984 av 1000 sekvenser som ble undersøkt har isoleucin i den ekvivalente posisjonen til hMDA #923) i RD/CTD-domenet, noe som indikerer strukturell/funksjonell betydning. Polymorfismen rs35667974 i ekson 14 av det humane genet forårsaker en konservert aminosyremutasjon i posisjon 923 fra Ile til Val i hMDA5. Imidlertid er det ytterligere seksten fjerne arter som har samme posisjon okkupert av en valin (fig. 1) som indikerer levedyktigheten til denne endringen på tvers av arter i RD/CTD-domenet til MDA5 og det nært homologe RS/GY-domenet til isoformene X1, X3 og DHX58 helikaser (fig. 2). I tillegg avslører sekvensjusteringen av regionen rundt hMDA #923-posisjonen (MDAs CTD-interaksjonssløyfe) en moderat til svært konservert sekvens blant fjerne arter som indikerer den funksjonelle betydningen av regionen på tvers av arter.

Påvisning av positiv seleksjon

For å oppdage om IFIH1-genet har utviklet adaptivt stedsmodeller og grenstedsmodeller ble brukt til å utføre positiv seleksjonsanalyse av ortologer av hele genet og CTD-domenet. I stedsmodellene ble ingen positive seleksjonssteder identifisert for CTD-domenet (tabell 2). M0 innebærer en konstant utviklingshastighet (ω=dN/dS=0.2) (tabell 2). Noen steder som hadde gjennomgått positiv seleksjon ble identifisert ved bruk av M2-- og M8-stedmodellmetoden for hele genet (Suppl. Tabell 1), men ikke i de RNA-interagerende regionene og CTD-domenet. I stedsmodellene er ω (dN/dS).<1 which indicates a highly conserved gene (Table 2, Suppl. Table 1). In the branch-site model, the human branch (as well as the primate's branch) was used as the foreground clade, the ω value was low, and no sites with posterior probability greater than 0.85 were identified (Suppl. Table 2).

Spesielt for grenstedmodellen C for CTD-domenet (Suppl. Tabell 3), utvikler 33 prosent av nettstedene seg i kategori ω0=0. 036. Siden lokaliteter som utvikler seg under denne kategorien ikke skiller mellom grentyper, har begge grentypene samme verdi på ω for lokaliteter under denne kategorien. Dessuten utvikler 55 prosent av nettstedene seg under kategori ω2. Likevel har disse ω-verdier som er betinget av grentypen (ω20=0.25 og ω21=0). For grenstedmodellen C for de 39 ortolog MDA5-genene (Suppl. Tabell 4), utvikler 33 prosent av nettstedene seg i kategori ω0=0. 027. På den annen side utvikler 41 prosent av lokalitetene seg under kategori ω2. Likevel har disse ω-verdier som er betinget av grentypen (ω20=0.25 og ω21=15.32).

Struktur analyse

Den utførte evolusjonsanalysen viser at Ile923Val-substitusjonen ikke er en unik variant i den menneskelige arten, siden Val eksisterer i MDA5-sekvensposisjonen i andre arter også. MDA5 er en viral dobbelttrådet RNA (dsRNA) reseptor som spiller en nøkkelrolle i antiviral immunitet gjennom sin distinkte spesifisitet for viralt RNA (Wu et al. 2013). Det har blitt vist at 2'-O-metylering av viralt mRNA er viktig for medfødte immunresponser, derfor har det blitt foreslått at 2'-O-metylering er en molekylær signatur for å skille mellom selv- versus ikke-selv-mRNA. (Zust et al. 2011). For å undersøke den potensielle rollen til Ile923Val-substitusjon i missense IFIH1-varianten rs35667974, analyserte vi kryoelektronmikroskopi (cryo-EM) strukturen til MDA5-dsRNA filament i nærvær av ATP (PDB ID: 6GKM) (Yu et al. 2018). Posisjon 923 er plassert på løkken 921–927 som samhandler direkte med dsRNA (fig. 3A). Spesielt er Ile923 lokalisert 4,8 Å fra 2′-ΟΗ av uridin U12, og deres interaksjon er stabilisert gjennom en hydrogenbinding mellom den tilstøtende His927 og uracilbasen. Substitusjon av Ile923 med Val i rs35667974-varianten forventes ikke å introdusere noen steriske sammenstøt, snarere enn å minimere interaksjoner med 2′-ΟΗ av uridin U12 (fig. 3B). I tilfelle RNA er metylert ved ribosen til U12, viser den naturlige MDA5-varianten med Ile923 en gunstig van der Waals-kontakt med en 2'-OMe-gruppe av U12 ved 3,6 Å (fig. 3C), mens Val923 av rs35667974-varianten er lokalisert ved 5,0 Å (fig. 3D). Disse forskjellene kan ikke antyde en stor effekt av Ile923Val-substitusjonen i seg selv; subtile strukturelle endringer fører imidlertid ofte til betydelige funksjonelle endringer gjennom forstyrrelse av den strukturelle dynamikken i systemet.

Molekylær dynamikkberegninger

For å undersøke effekten av I923V-mutasjonen av MDA5 i dens interaksjon med dsRNA, både naturlig og 2′-Ο-metylert, har vi brukt molekylær dynamikksimuleringer av 4 systemer på 100-ns tidsskala. Dynamikken til systemene ble overvåket ved å bruke rot-middel-kvadrat-fluktuasjonene (RMSF) til hver proteinrest og hydrogenbindingsavstanden til H927 med U12 (fig. 4). Våre beregninger tyder på at mutasjon av I923 til V923 i MDA5 resulterte i mindre forstyrrelser av dynamikken innenfor RNA-kontaktregionen (restene 923–934) og interproteininteraksjonssløyfen (950–955) av komplekset med naturlig dsRNA (fig. 4C). . Denne observasjonen var lik i tilfellet med 2'-O-metylering i U12, selv om en mer uttalt effekt ble observert i den generelle dynamikken til den karboksyterminale regionen til MDA5 V923-mutanten (fig. 4D).

Når vi nå vurderer nøkkelhydrogenbindingsinteraksjonen til den tilstøtende H927-resten med uracilbasen, tyder våre MD-simuleringer på at metylering ved 2′-O ikke påvirker den i den opprinnelige MDA5 (fig. 4E). Imidlertid påvirker V923-mutasjonen ikke hydrogenbindingen til H927 i det native dsRNA, men viste en destabiliserende effekt i nærvær av 2'-O-metylering (fig. 4F). Samlet antyder våre MD-simuleringer at selv om effekten av I923V-mutasjon av MDA5 i interaksjonen med naturlig dsRNA er marginal, er effekten av dynamikken og stabiliteten til MDA5/RNA-komplekset mer signifikant når uracil er 2'-O-metylert .

Diskusjon

Denne studien representerer en evolusjonær og strukturell undersøkelse av rollen til den delte rs35667974-varianten av autoimmun locus IFIH1, rapportert å føre til en modifisert funksjonsfenotype for MDA5 (Downes et al. 2010). Anvendelsen av evolusjonssted- og grenstedmodeller for å utføre positiv seleksjonsanalyse indikerer ingen positive seleksjonssteder i RNA-interaksjonsstedene der rs35667974-polymorfismen er bosatt. Verken grensidemodellene indikerer at noen bestemte steder har gjennomgått positiv seleksjon i CTD-domenet.

Dette er i samsvar med de svært lave utseendefrekvensene til Ile923Val-varianten selv blant den menneskelige befolkningen (tabell 1). Likevel har den europeiske befolkningen sammenlignet med de andre en forskjell i frekvensen av C-allelen av én størrelsesorden. Uten å overse den lille prøvestørrelsen, viser den geografiske fordelingen av polymorfismen som studeres at dens opptreden i den europeiske befolkningen som utgangspunkt kan skyldes levekår og ernæring som har endret seg de siste årene. Den strukturelle undersøkelsen av rollen til den undersøkte SNP ble utført ved å undersøke strukturen til dsRNA-MDA5 (native og mutant) komplekset.

På dsRNA-MDA5-kompleksdannelsesnivået påvirker introduksjonen av Ile923Val-mutasjonen interaksjonen mellom protein C-terminaldomenet (CTD) med dsRNA med introduksjonen av et hydrofobt hulrom ved siden av ribosesukkeret til en-strengen til dsRNA. . Vi har vist at i tilfelle av metylert RNA ved fosforibosylkjeden til den ene tråden, kan ytterligere dynamiske effekter påvirke interaksjonen til mutanten uten å påvirke villtypen. Dette er i samsvar med eksperimentelle studier (Looney et al. 2015; Brisse og Ly 2019) som viser at effekten av Ile923Val-polymorfismen identifisert i nærheten av et MDA5-dsDNA-interaksjonspunkt kanskje ikke påvirker de native dsRNA-bindende egenskapene, men endres av 2.5-fold reduksjon av den katalytiske aktiviteten (Shigemoto et al. 2009). De molekylære dynamiske studiene har også vist den kritiske rollen til metylering i mutanten angående mobiliteten og stabiliteten til MDA5-løkker 941–959 og 970–977 involvert i dsRNA-interaksjon og interprotein-interaksjon i MDA-filamentdannelsen. Slike effekter kan hindre MDA5-filamentsammenstillingen, MDA5–MAVS-foreningen og MAVS-filamentsamlingen som ytterligere aktiverer ekspresjonen av type I-interferon-genene (IFN1: IFN og IFN ). I tilfeller med T1D og PsA, som en konsekvens, beskytter reduserte nivåer av MDA5-proteinaktivitet og derfor lavere IFN-produksjon mot autoimmunitet. Disse observasjonene antyder at flere IFIH1-varianter, spådd å påvirke interaksjonen mellom MDA5 og MAVS og reduksjon av IFN-produksjonen, vil redusere risikoen for sykdommer, mens normal MDA5-funksjon er assosiert med dem (Shigemoto et al. 2009).

Dette fører til konklusjonen at som i tilfellet med viralt RNA, er selv-dsRNA-metylering, en RNA-identifisert mutasjon, en viktig seleksjons-/aktiveringsfaktor for innføring av beskyttende effekter i enkelte autoimmune sykdommer. Resultatene fra denne studien utvider kunnskapen om den biologiske betydningen av rs35667974 SNP av IFIH1 locus i utviklingen av de nevnte sykdommene og fremhever viktigheten av studier av delte gener av flere autoimmune sykdommer. I populasjonsstudier for den genetiske assosiasjonen av SNP-er med autoimmune sykdommer, ved bruk av f.eks. PCR-RFLP-er, sekvensering eller genotyping-brikker, blir et tilfelle av RNA-metylering ikke tatt i betraktning. Det er derfor viktig å vite tilstanden til metylering av det interagerende dsRNA og dets effekt på allelen MDA5. Som i tilfellet med viral dsRNA-gjenkjenning (Wu et al. 2013) og skillet mellom selv- og ikke-selv-mRNA (Züst et al. 2011), tapet av en metylgruppe fra den interagerende MDA5, som i tilfellet med mutant Ile923Val MDA5, kan påvirke filamentdannelsen og induksjonen av type I interferon.

Merk at Plenge et al. (2013) hadde tidligere diskutert potensialet til en sjelden variant i et årsakssykdomsgen til å representere et antatt terapeutisk mål for farmasøytisk intervensjon. For dette formål må den biologiske funksjonen til årsaksvarianten være kjent i ethvert forsøk på å koble genetiske funn med et nytt terapeutisk mål. Derfor ser det ut til å være av avgjørende betydning å finne posisjonen til en årsaksvariant i 3D-strukturen til det respektive proteinet og å undersøke dets rolle fra et strukturelt/funksjonelt synspunkt i en patogenetisk vei som fører til en autoimmun sykdom. pasientene. Det er fortsatt et overordnet behov for å gå utover oppdagelsen av assosierte SNP-er til en dypere forståelse av årsaksvarianter for å belyse de molekylære mekanismene og sykdomsveiene. Ytterligere strukturell-funksjonell analyse er nødvendig for å undersøke bindingen av ribose-2′-Ο-metylert selv-dsRNA til MDA5 og hvordan dette påvirker MDA5-fibrilsammensetningen. Den unnvikende biologiske rollen 2'-Ο-metylert av mRNA som en sensor for forskjell mellom viralt og selv-mRNA i induksjonen av type I interferon kan ha blitt utvidet til en beskyttende sensor i visse autoimmunopatier.

Konklusjon

Den sjeldne rs35667974 IFIH1-genpolymorfismen beskytter mot T1D, PS og PsA, mens IFIH1-allelen som bæres av majoriteten av befolkningen disponerer for sykdommene. Finansieringen av at mutanten Ile923Val MDA5 fungerer annerledes i interaksjonen med selv-dsRNA og spesielt med 2'-O-metylert antyder at i noen tilfeller kan varianter som interagerer med metylert dsRNA forstyrre MDA5-filamentdannelse, MAVS-interaksjon og filamentdannelse, og IFN-signalering, som i vertens antivirale respons, kan mulig ha blitt negativt selektert fordi de gir beskyttelse mot sykdommer.

Forfatterbidrag

Konseptualisering – AA, AP, EEE og GNG, metodikk – AA, AP og EEE, validering – AA, AP, MIZ, GNG og EEE, undersøkelse – GNG, AA, AP og MIZ, ressurser – GNG, AA, AP og MIZ, datakurering – AA og AP, skriving og originalutkast – EEE, GNG, AA, AP og MZ, skriving, gjennomgang og redigering av manuskriptet – AA, AP, MZ, GNG og EEE, visualisering – AA, AP og EEE, tilsyn – EEE og finansieringsinnhenting – EEE. Alle forfattere har lest og godtatt den publiserte versjonen av manuskriptet.

Finansiering

Åpen tilgangsfinansiering er levert av HEAL-Link Hellas. Dette arbeidet ble støttet av prosjektet "INSPIRED-The National Research Infrastructures on Integrated Structural Biology, Drug Screening Eforts and Drug Target Functional Characterization" (Grant MIS 5002550), som er implementert under handlingen "Reinforcement of the Research and Innovation Infrastructure," finansiert av det operative programmet "Competitiveness, Entrepreneurship, and Innovation" (NSRF 2014–2020) og samfinansiert av Hellas og EU (European Regional Development Fund).

Datatilgjengelighet

Datasettene som er brukt og/eller analysert under den nåværende studien er tilgjengelig fra den tilsvarende forfatteren på forespørsel.

Erklæringer

Interessekonflikt

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt. Finansierne hadde ingen rolle i utformingen av studien; i innsamling, analyser eller tolkning av data; i skrivingen av manuskriptet, eller i beslutningen om å publisere resultatene.

Etisk godkjenning

Ikke aktuelt.

Samtykke til å delta

Ikke aktuelt.

Samtykke til publisering

Ikke aktuelt.

Åpen tilgang

Denne artikkelen er lisensiert under en Creative Commons Attribution 4.0 internasjonal lisens, som tillater bruk, deling, tilpasning, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium eller format, så lenge du gir passende kreditt til den(e) originale forfatteren(e) ) og kilden, oppgi en lenke til Creative Commons-lisensen, og angi om endringer ble gjort. Bildene eller annet tredjepartsmateriale i denne artikkelen er inkludert i artikkelens Creative Commons-lisens med mindre annet er angitt i en kredittgrense til materialet. Anta at materiale ikke er inkludert i artikkelens Creative Commons-lisens og den tiltenkte bruken ikke er tillatt av lovbestemt regulering eller overskrider tillatt bruk. I så fall må du innhente tillatelse direkte fra rettighetshaveren.

Referanser

1. Aduri R, Psciuk BT, Saro P et al (2007) AMBER kraftfeltparametere for de naturlig forekommende modifiserte nukleosidene i RNA. J Chem Theory Comput 3:1464–1475.

2. Altschul SF, Madden TL, Schäfer AA et al (1997) Gapped BLAST og PSI-BLAST: en ny generasjon av proteindatabasesøkeprogrammer. Nucleic Acids Res 25:3389-3402.

3. Andreou A, Giastas P, Christoforides E, Eliopoulos EE (2018) Strukturell og evolusjonær innsikt innenfor polysakkariddeacetylase-genfamilien til bacillus anthracis og bacillus cereus.

4. Aučynaitė A, Rutkienė R, Tauraitė D et al (2018) Identifikasjon av en 2′-O-metyluridinnukleosidhydrolase ved bruk av metagenomiske biblioteker. Molekyler.

5. Berman HM, Westbrook J, Feng Z et al (2000) Proteindatabanken. Nucleic Acids Res 28:235-242.

6. Bielawski JP, Yang Z (2004) En metode for maksimal sannsynlighet for å oppdage funksjonell divergens ved individuelle kodonsteder, med anvendelse på evolusjon av genfamilien.

7. Biros E, Jordan MA, Baxter AG (2005) Gener som formidler miljøinteraksjoner ved type 1 diabetes.

8. Boccaletto P, Machnicka MA, Purta E, et al (2018) MODOMICS: en database med RNA-modifikasjonsveier. 2017-oppdatering. Nucleic Acids Res 46:D303–D307.

9. Brisse M, Ly H (2019) Sammenlignende struktur- og funksjonsanalyse av de RIG-I-lignende reseptorene: RIG-I og MDA5.

10. Budu-Aggrey A, Bowes J, Stuart PE et al (2017) En sjelden kodende allel i IFIH1 er beskyttende for psoriasisartritt. Ann Rheum Dis 76:1321–1324.

For more information:1950477648nn@gmail.com