Isolering og rensing av fenyletanoidglykosider fra Cistanche Deserticola ved høyhastighets motstrømskromatografi

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Li a,b, Rong Tsao b,*, Raymond Yang b, Chunming Liu a, J. Christopher Young b, Honghui Zhu b

Abstrakt

Fem fenyletanoidglykosider (PhGs), echinacoside, cistanosid A, acteosid, isoacteosid og 20-acetylacteosid, ble isolert og renset fraCistanche deserticolafor første gang ved høyhastighets motstrømskromatografi (HSCCC) ved bruk av to bifasiske systemer, ett bestående av etylacetat-etanol-vann (5:0.5:4.5, v/v/v) og et annet av etylacetat-n-butanol-etanol-vann ({{10}}.5:0.5:0.1:1, v/v/v/v). Totalt 28,5 mg echinacosid, 18,4 mg cistanosid A, 14,6 mg acteosid, 30,1 mg isoacteosid og 25,2 mg 20-acetylacteosid ble renset fra 1412 mg av n-debutanolerticola C, hver ekstrakt. ved over 92,5% renhet som bestemt ved HPLC. Strukturene ble identifisert ved deres retensjonstid, UV, LC-ESI-MS i negativ ion-modus, og bekreftet av NMR-eksperimenter. Det karakteristiske LC–ESI-MSn-fragmenteringsmønsteret til de fem forbindelsene er diskutert, og funnet å være et veldig spesifikt og nyttig verktøy for strukturell identifisering av PhG fra denne viktige medisinplanten.

Nøkkelord:Cistanche deserticola; Phenylethanoid; Echinacoside; cistanoside A; Acteosid; isoakteosid; 20-Acetylakteosid; HSCCC; LC–ESI-MS; NMR

1. Introduksjon

Cistanche deserticola YC Maer en velkjent kinesisk urtemedisin og har vært mye brukt i tradisjonelle preparater som ligner på dagens funksjonelle matingredienser eller kosttilskudd (Wong, Li, Cheng, & Chen, 2006). De viktigste bioaktive ingrediensene i C. deserticola er fenyletanoidglykosider (PhGs), inkludert echinacoside, acteosid, isoacteosid, 20-acetylacteosid og cistanoside A (Kobayashi, Karasawa, & Miyase, 1984; Kobayashi et al., 1987.). PhG-er er vidt distribuert i planteriket, og har blitt grundig studert for deres ulike biologiske funksjoner som hepatobeskyttende (Xiong et al., 1998), anti-inflammatorisk, antinociseptiv aktivitet (Schapoval et al., 1998) og antioksidantaktiviteter ( Cheng, Wei, Guo, Ni, & Liu, 2005; He, Lau, Xu, Li, & But, 2000; Li, Wang, & Wang, 1997; Li, Wang, Zheng, Liu, & Jia, 1993; Wang, Jiang, Wu, & Wang, 2001; Xiong, Kadota, Tani, & Namba, 1996), forbedring av seksuell funksjon (Xie & Wu, 1993; Zong, He, Wu, & Chen, 1996) og beroligende effekt (Lu, 1998) ).

På grunn av de signifikante bioaktivitetene ovenfor, er store mengder rene forbindelser et presserende behov som referansestandarder og for ulike in vitro- og in vivo-studier knyttet til bruk av tradisjonelle kinesiske medisiner. Effektive metoder for isolering, rensing og strukturell karakterisering av PhG-er blir derfor nødvendig. Slikt arbeid krever imidlertid vanligvis bruk av flere kromatografiske trinn for opprydding og isolering av prøver (Gross, Lahloub, Anklin, Schulten, & Sticher, 1988; Nishimura, Sasaki, Inagaki, Chin, & Mitsuhashi, 1991; Ravn, Nishibe , Sasahara, & Li, 1990; Shoyama, Matsumoto, & Nishioka, 1987), som vanligvis resulterer i lave utvinningsgrader på grunn av irreversible adsorpsjoner av PhG på den faste bæreren under separasjon (Lei et al., 2001). I motsetning til dette har høyhastighets motstrømskromatografi (HSCCC) blitt et effektivt alternativ til de konvensjonelle kromatografiske teknikkene for separasjon av noen PhG fra planteekstrakter (Lei et al., 2001; Li et al., 2005). Lei et al. vellykket separert akteosid og 20-acetylakteosid fraCistanches salsa(CA Mey.) G. Beck ved å bruke HSCCC (Lei et al., 2001). Forfatterne av denne artikkelen har tidligere rapportert separasjonen av acteosid og isoacteosid fra Plantago psyllium L. av HSCCC (Li et al., 2005). Det er imidlertid ikke publisert noen rapport om separasjon og rensing av flere PhG fra C. deserticola ved bruk av HSCCC. På grunn av mangelen på standarder har LC-MS metoder blitt utviklet og brukt som et kraftig analytisk verktøy for rask karakterisering og identifisering av noen PhG i planteekstrakt (Li et al., 2005; Wang et al., 2000).

I denne artikkelen rapporterer vi en HSCCC-metode utviklet for fremstilling av echinakosid, cistanosid A, acteosid, isoacteosid og 20-acetylacteosid fra C. deserticola. Karakterisering og analyse av de fem PhG-ene som ble separert ble oppnådd ved bruk av LC kombinert med in-line ESI-massespektrometri og NMR-eksperimenter. Retensjonstiden, molekylvekten og de karakteristiske fragmentionene til de fem PhG-ene er presentert og diskutert i denne artikkelen. Strukturene til de fem PhG-ene identifisert i denne undersøkelsen er vist i fig. 1.

Effektive ingredienser av Cistanche deserticola

2. Eksperimentell

2.1. Kjemikalier og reagenser

Acteosid ble kjøpt fra Sigma–Aldrich (Oak-Ville, ON), echinacoside ble kjøpt fra ChromaDex (Santa Ana, CA). Isoacteosid ble isolert fra P. psyllium L. (Li et al., 2005). C. deserticola ble kjøpt fra Beijing TongRenTang Medicinal Store (Kina). Alle løsningsmidler var av HPLC-kvalitet og kjøpt fra Caledon Laboratories Ltd. (Georgetown, ON).

2.2. Prøveforberedelse

C. deserticola (20 g) ble ekstrahert fem ganger ved romtemperatur i 12 timer hver med 100 ml 80 prosent vandig etanol. Hver gang ble ekstraksjonsblandingen filtrert gjennom et Whatman No.1 filterpapir (Whatman International Ltd., Maidstone, England). Det kombinerte filtratet ble konsentrert til 100 ml i vakuum ved < 40="" grader.="" den="" resulterende="" vandige="" løsningen="" ble="" avfettet="" to="" ganger,="" hver="" med="" 100="" ml="" heksan,="" og="" deretter="" ekstrahert="" suksessivt="" i="" fem="" ganger,="" hver="" med="" 100="" ml="" n-butanol.="" n-butanollagene="" ble="" kombinert="" og="" konsentrert="" til="" tørrhet="" i="" vakuum="" ved="">< 40="" grader,="" noe="" som="" ga="" 2,2="" g="" n-butanolekstrakt.="" ekstraktet="" ble="" lagret="" ved="" -20="" grad="" før="">

2.3. HSCCC separasjonsprosedyre

Den preparative HSCCC ble utført i en Model CCC{{0}} høyhastighets motstrømskromatografi (Pharma-Tech Research, Baltimore, Maryland USA). Dette apparatet hadde tre preparative spoler, koblet i serie (totalt volum, 325 ml). Omdreiningshastigheten til apparatet kunne reguleres mellom 0 og 2000 rpm. HSCCC-systemet var utstyrt med en HPLC-pumpe (Pharma-Tech Research, Baltimore, Maryland, USA), en modell 450 UV-detektor (Alltech, USA), en modell L 120 E flatbed-opptaker (Linseis Inc., Princeton Jct, USA), en fraksjonssamler (Advantec MFS Inc., USA) og en prøveinjeksjonsventil med en 10-mL prøvesløyfe.

En blanding av etylacetat-etanol-vann (5:0.5:4.5, v/v/v) ble ristet kraftig i en skilletrakt og lot stå og skille seg ved romtemperatur. De to fasene ble brukt i HSCCC etter at de nådde likevekt. Hele den kveilede kolonnen ble først fylt med det øvre laget, som fungerer som den stasjonære fasen. Det nedre laget (mobil fase) ble deretter pumpet inn i hodeenden av kolonnen med en strømningshastighet på 1,5 ml/min. Rotasjonshastigheten ble satt til 1050 rpm. En prøve (ca. 230 mg hver gang) oppløst i 8 ml av blandingen av etylacetat-etanol-vann (5:0,5:4,5, v/v/v) ble fylt inn i injeksjonsventilen etter at systemet nådde hydrodynamisk likevekt. Dette bifasiske løsningsmiddelsystemet ble valgt basert på fordelingskoeffisienten (K), som var 0,87, 1,11 og 1,32 for henholdsvis akteosid, isoakteosid og 20 acetylakteosid. K-verdien var forholdet mellom konsentrasjonene i topp- og bunnsjikt av samme forbindelse som bestemt ved HPLC (fig. 2). Utløpet fra utløpet av kolonnen ble kontinuerlig overvåket av en UV-detektor ved 254 nm og samlet i reagensrør med en fraksjonsoppsamler satt til 4 minutter for hvert rør.

2.4. LC-forhold

statisk auto-sampler og en fotodiode array-detektor (DAD) ble brukt for analyse av PhG i n-butanolekstraktet av C. deserticola og fraksjoner samlet fra HSCCC-separasjonen. Separasjonen ble utført i en Phenomenex ODS-C18 kolonne (250 × 4,6 mm, 5 lm) med en C18 guard kolonne. Den binære mobile fasen besto av acetonitril (løsningsmiddel A) og vann inneholdende 2 prosent eddiksyre (løsningsmiddel B). Alle løsemidler ble filtrert gjennom en

{{0}}.45 lm filter før bruk. Strømningshastigheten ble holdt konstant på 1,0 ml/min i en total kjøretid på 25 minutter. Systemet ble kjørt med et gradientprogram: 0–20 min: 90 prosent B til 60 prosent B; 20–22 min: 60 prosent B til 0 prosent B; og 22–25 minutter, 0 prosent B til 90 prosent B. Prøveinjeksjonsvolumet var 10 l. Topper av interesse ble overvåket ved 320 nm av en DAD-detektor.

2.5. LC–ESI-MS-eksperimenter

LC-MS-eksperimenter ble utført ved bruk av et Finnigan LCQ DECA ionefelle-massespektrometer (Thermo Finnigan, San Jose, CA, USA) utstyrt med en elektrosprayioniseringskilde (ESI). Prøvene ble analysert i samme kromatografiske tilstand. En negativ modell ble brukt for datainnsamling. Mantelgass og hjelpestrømningshastigheter ble satt til henholdsvis 96 og 7 (vilkårlig enhet). Kapillærspenningen ble satt til 29 V og temperaturen ble kontrollert til 350 grader. Inngangslinsespenningen ble fastsatt til 40 V og multipol RF-amplituden ble satt til 540 V. ESI-nålspenningen ble kontrollert til 4,5 kV. Rørlinseforskyvningen var 16 V, multipollinse 1-forskyvningen var 8,20 V og multipollinse 2-offset var 10,5 V. Elektronmultiplikatorspenningen ble satt til 980 V for ionedeteksjon.

2.6. NMR for identifikasjon

NMR-spektra ble registrert på et Bruker Avance-600-spektrometer (Bruker BioSpin Ltd., Milton, Canada). Bare forbindelsene 2 og 5 (ingen standarder tilgjengelig) ble utsatt for NMR-eksperimenter. Prøver ble oppløst i CD3OD.

Aktive ingredienser i cistanche: echinacoside og acteosid

3. Resultater og diskusjon

En vellykket HSCCC-separasjon avhenger i stor grad av et passende to-fase løsningsmiddelsystem som gir en ideell fordelingskoeffisient (K) rundt 1 for den ønskede forbindelsen. Et slikt bifasisk system bør også gi en rimelig kort avviklingstid (Chen, Games, & Jones, 2003; Foucault & Chevolot, 1998; Oka, Oka, & Ito, 1991). I vårt forsøk valgte vi fire serier med løsemiddelsystemer i henhold til løseligheten til målforbindelsene i C. deserticola. HPLC ble brukt for å måle konsentrasjonen i hver fase, hvorfra K-verdiene til målforbindelsene ble beregnet. To systemer, etylacetat-n-butanol-etanol-vann (4:0,6:0,6:5, v/v/v/v) og etylacetat-vann (1:1, v/v), har tidligere blitt brukt i HSCCC for å skille akteosid og 20-acetylakteosid fra

C. salsa, og acteosid og isoacteosid fra P. Psyllium,

henholdsvis (Lei et al., 2001; Li et al., 2005). Selv om det første systemet hadde en relativt kort sedimenteringstid, hadde det dårlig ytelse i å separere PhG-ene til C. deserticola, på grunn av de lave K-verdiene for forbindelsene 1 og 2, og høye K-verdiene for forbindelsene 3–5. K-verdiene var svært lave for forbindelsene 1–4 i det andre systemet, men svært høye for forbindelse 5 (tabell 1). Et modifisert system inneholdende etylacetat-etanol-vann (5:0,5:4,5, v/v/v), ga en ideell K-verdi for forbindelsene 3-5 ved henholdsvis 0,87, 1,11 og 1,32, og resulterte i god separasjon av disse tre forbindelsene (fig. 3A og B). Dette systemet ble imidlertid produsert

for liten K-verdi for forbindelsene 1 og 2, noe som får de to forbindelsene til å sameluere nær løsningsmiddelfronten (fraksjon 1 i fig. 3A). En ytterligere modifikasjon av systemet (etylacetat–n-butanol–etanol-vann (0.5:0.5:0.1:1, v/v/v/ v) hevet K-verdiene for forbindelse 1 og 2 til henholdsvis 0.52 og 0.92, og førte til fullstendig separasjon (fig. 3C). Fig. 3A viser HSCCC-separasjonen av en prøve som inneholder 230 mg av n-butanolekstraktet av C. deserticola ved bruk av etylacetat-etanol-vann (5:0.5:4.5, v/v/v). Fraksjoner som ble bekreftet ved HPLC for å inneholde bare forbindelsene 3, 4 eller 5 ble kombinert separat, og de som inneholdt forbindelsene 3 og 4 ble slått sammen, frysetørket og gjenunderkastet HSCCC for ytterligere separasjon (fig. 3B). HSCCC-separasjon beskrevet ovenfor ga totalt 14,6 mg, 30,1 mg og 25,2 mg av forbindelsene 3–5 fra 1412 mg n-butanolekstrakt. Fig. 3C viser HSCCC-separasjonen av en prøve som inneholder forbindelsene 1 og 2 (fraksjon 1 i den første separasjonen) ved bruk av etylacetat-n-butanol-etanol-vann (0.5:0.5:0.1:1, v/v/v/v). Totalt 28,5 og 1 8,4 mg av forbindelsene 1 og 2 ble oppnådd. Den kromatografiske renheten til de frysetørkede forbindelsene 1–5 var over 92,5 prosent, som ble direkte brukt til LC–ESI-MS og NMR-analyser.

Tentativ identifikasjon av forbindelsene 1, 3 og 4 ble oppnådd ved kongruente retensjonstider og UV-spektrale data med de for det autentiske echinacoside, acteoside og isoacteoside (fig. 2). Forbindelsene 2 og 5 var ukjente, men UV-spektrene til alle fem forbindelsene var svært like, noe som indikerer lignende strukturelle trekk.

For ytterligere å undersøke strukturene til disse fem forbindelsene, ble LC–ESI-MSn-eksperimenter forsøkt og resultatene er vist i figur 4 og tabell 2. Forbindelser relatert til toppene (1–5) i figur 2 viste intense deprotonerte molekylære ioner [MH]— ved henholdsvis m/z 785, 799, 623, 623 og 665 i negativ modus. Dimeriske [2M H]-ioner ble også observert for topper 1–4 i fig. 2. Disse bekreftet at molekylvektene til toppene 1–5 var henholdsvis 786, 800, 624, 624 og 666. LC–MSN-dataene (tabell 2) ga svært nyttig strukturell informasjon for de fem PhG-ene, for eksempel det nøytrale tapet av en eksperimentell prosedyre: ca. 1 mg av hver prøve ble veid i et 10 ml reagensrør hvori 1 ml av hver fase av det pre-ekvilibrerte to-fase løsningsmiddelsystemet ble tilsatt. Reagensrøret ble lukket og ristet kraftig i 1 min, og fikk stå til det skilte seg fullstendig. En alikvot på 100 l av hvert lag ble tatt ut og inndampet separat til tørrhet i vakuum kl.<40 °c.="" the="" residue="" was="" dissolved="" in="" 10="" ll="" methanol="" and="" analyzed="" by="" hplc="" for="" determining="" the="" partition="" coefficient="" (k)="" of="" compounds="" 1–5.="" the="" k="" value="" was="" expressed="" as="" the="" peak="" area="" of="" the="" target="" compound="" in="" the="" upper="" phase="" divided="" by="" that="" in="" the="" lower="">

LC–ESI-MS for topp 1 er vist i fig. 4A. Det deprotonerte molekylære ion [MH] — ved m/z 785 med høy overflod og et dimert deprotonert molekyl.ion [2M H]— ved m/z 1571 ble observert i negativ modus, noe som tyder på en molekylvekt på 786, som var den samme som for echinakosid. Ytterligere undersøkelser i LC–MS2-eksperimentet av m/z 785-ionene ga ett hoveddatterion ved m/z 623 (fig. 4B) produsert direkte fra m/z 785 ved tap av en kaffeoyldel eller en heksosedel som [M 162 H]—. LC-MS3-spekteret til m/z 623 viste to hovedioner ved m/z 477 og 461, og to mindre ioner ved m/z 315 og 179 (fig. 3C, tabell 2). Masseforskjellene mellom m/z 623 og fragmentionene m/z 477 og 461 var henholdsvis 146 og 162, tilsvarende tapet av en rhamnoseenhet og en glukosedel eller en caffeoyldel [M 162H]—. m/z 623-ionene mistet også en caffeoyl-del og en rhamnose-del for å produsere m/z 315-ionene. Ionet ved m/z 179 ble produsert fra spaltningen av kaffeoyldelen, med den negative ladningen igjen på den delen av kaffeoyldelen. LC–ESI-MSN-eksperiment på den autentiske echinacosiden viste det samme fragmenteringsmønsteret. Topp 1 ble derfor bekreftet å være echinacosid.

For topp 2 viste LC–ESI-MS m/z 799 som det deprotonerte molekylære ion [MH]— og m/z 1599 som dets dimere ion, noe som tyder på en molekylmasse på 800. Under MS2-eksperimenter ble m/z 799 ioner dannet tre døtre ved m/z 637, 623 og 475 (tabell 1). Ionet ved m/z 637 ble produsert direkte fra moderionet til m/z 799 igjen på grunn av det nøytrale tapet av kaffeoylen [M—162—H]— eller en glukosedel [M—162—H]—. Ionet ved m/z 623 resulterte fra tapet av et CH2-radikal. Ionet ved m/z 475 ble dannet fra det nøytrale tapet av både kaffeoyldelen [M 162 H]— og glukosedelen fra moderionet. MS3-eksperimentet på m/z 637 produserte tre ioner ved m/z 619, 491 og 475, tilsvarende tapene av henholdsvis ett vann, en rhamnoseenhet og en glukosedel. M/z 623-datterionet produserte m/z 461 og 315 i MS3-studien, som fulgte de samme fragmenteringsveiene som echinacoside som diskutert ovenfor. LC– ESI-MSN-dataene støttet en tentativ identifikasjon for topp 2 som cistanosid A. Begge toppene viste det samme [MH]-ionet ved m/z 623 og dimer ved m/z 1247 i negativ modus (tabell 1), noe som indikerer de er muligens isomerer med samme molekylvekt av

624, det samme som acteosid og isoacteosid. MS2-spektrene til [MH]—-ionene viste også ett samme datterion på m/z 461, noe som indikerte tapet av kaffeoyldelen fra moderionet m/z 623 (tabell 1). Lignende MS3-spektra ble oppnådd for de to forbindelsene. For topp 3 dannet MS3-spekteret til ionet ved m/z 461 tre ioner ved m/z 315, 161 og 135. M/z 315 dannes etter å ha mistet rhamnose som diskutert tidligere. Ionet m/z 161 ble produsert fra spaltningen av kaffeoyldelen, etterfulgt av et ytterligere tap av ett vann; ladningen forble på den delen av kaffeoyldelen. Ionet ved m/z 135 [aglykon 18 H]- oppsto fra spaltningen av den glykosidiske bindingen ved C1-posisjon med et ytterligere tap av ett vann, og etterlot ladningen å være på en del av aglykondelen. MS3-spekteret til topp 4 fulgte samme fragmenteringsvei som topp 3 bortsett fra det manglende ionet ved m/z 135. Molekylionet og fragmenteringsmønstrene til disse to forbindelsene stemmer overens med litteraturdataene om akteosid og isoakteosid (Wang et al. ., 2000), selv om et ytterligere ion m/z 153 ble funnet og proton-NMR-data for cistanoside A og 20-acetylacteosid ble tilordnet [aglykon H]— av Wang et al. (Wang et al., 2000). Dette ionet kan ha vært ustabilt og mistet vann for å gi m/z 135 i vårt forsøk. Basert på MS-dataene og de kongruente retensjonstidene for topper 3 og 4 med standardene, blir de derfor identifisert som henholdsvis akteosid og isoakteosid.

LC–ESI-MS-dataene for topp 5 er vist i tabell 2. Et deprotonert molekylært ion [MH]— (m/z 665) var det eneste ionet som ble funnet i negativ modus, noe som antyder en molekylmasse på 666. Tre datterioner ble observert ved m/z 623, 503 og 461 i MS2-eksperimentet (tabell 2). Datterionene ved m/z 623 og 503 ble dannet direkte fra moderionet ved tap av henholdsvis en COCH2-gruppe og en kaffeoyldel. Ionet ved m/z 461 kom fra tapet av både kaffeoyl- og COCH2-delen [M 162 42 H] – fra moderionet. I MS-eksperimentet produserte m/z 623 m/z 461, og m/z 503 ga tre ioner ved m/z 485, 461 og 315. MS3-spekteret til datterionet m/z 461 ga to ioner ved 443 og 315. Ved å sammenligne LC–MSN-fragmenteringsmønsteret til topp 5 med andre forbindelser rapportert i denne studien og med andre rapporterte (Li et al., 2005; Wang et al., 2000), konkluderte vi med at topp 5 var strukturelt svært relatert. til akteosid med den eneste forskjellen som COCH3-enheten i R3-posisjonen. En tentativ identitet ble derfor gitt til topp 5 som 20-acetylakteosid (fig. 1).

Strukturene til de to tentativt identifiserte forbindelsene, topp 2 (som cistanosid A) og topp 5 (som 20-acetylakteosid) ble bekreftet av deres strukturer ved 1H NMR. De kjemiske skift og koblingskonstanter for alle protoner i forbindelse 2 og 5, som vist i tabell 3., samsvarte med de rapporterte NMR-dataene for henholdsvis cistanosid A og 20-acetylakteosid (Kobayashi et al., 1984, 1987) . 2D NMR-eksperimenter (langdistanse COSY-, ROESY- og CH-korrelasjon) ble også utført i denne studien, og de bekreftet ytterligere identifikasjonen (data ikke vist).

Acteosid fra Cistanche deserticola

4. Konklusjoner

I denne artikkelen ble HSCCC vellykket brukt for isolering og rensing av echinakosid, cistanosid A, acteosid, isoacteosid og 20-acetylacteosid fra n-butanolekstraktet av C. deserticola. Det er derfor et velprøvd middel for semi-preparativ separasjon av bioaktivt. I mellomtiden har strukturene til de fem PhG-ene i C. deserticola blitt undersøkt ved hjelp av LC–ESI-MSN; Det ble funnet noen karakteristiske trekk ved PhG, som gjorde det mulig for oss å bestemme de funksjonelle gruppene i strukturene. LC–ESI-MSN-metoden er derfor et kraftig verktøy for rask identifisering av fenyletanoider og deres glykosider i C. deserticola-ekstrakter, spesielt når det er underbygget av NMR-data.

Bekreftelse

Forfatterne vil gjerne takke Jun Gu fra Nuclear Magnetic Resonance Centre, University of Guelph, Ontario, Canada for hennes hjelp til NMR-eksperimenter. Dette prosjektet ble delvis støttet av finansiering fra Jilin-provinsen, Kina (nr. 20060904).

Referanser

Chen, LJ, Games, DE, & Jones, J. (2003). Isolering og identifisering av fire flavonoidbestanddeler fra frøene til Oroxylum Indicum ved høyhastighets motstrømskromatografi. Journal of Chromatography A, 988, 95–105.

Cheng, XY, Wei, T., Guo, B., Ni, W., & Liu, CZ (2005). Cistanche deserticola cellesuspensjonskulturer: Fenylethanoid glykosider biosyntese og antioksidantaktivitet. Process Biochemistry, 40, 3119–3124.

Foucault, AP, & Chevolot, L. (1998). Motstrømskromatografi: instrumentering, valg av løsemidler og noen nyere anvendelser til naturlig produktrensing. Journal of Chromatography A, 808, 3–22.

Gross, G.-A., Lahloub, MF, Anklin, C., Schulten, H.-R., & Sticher, O. (1988). Teucrioside, et fenylpropanoidglykosid fra Teucrium Chamaedrys. Phytochemistry, 27, 1459–1463.

He, ZD, Lau, KM, Xu, HX, Li, PC, & But, PPH (2000). Antioksidant aktivitet av fenylethanoid glykosider fra Brandisia sjanser. Journal of Ethnopharmacology, 71, 483–486.

Kobayashi, H., Karasawa, H., & Miyase, T. (1984). Studier av bestanddelene i Cistanchis Herba. III. Isolering og strukturer av nye fenylpropanoidglykosider, Cistanoside A og B. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 32, 3009–3014.

Kobayashi, H., Oguchi, H., Takizawa, N., Miyase, T., Ueno, A., Usmanghani, K., et al. (1987). Nye fenyletanoidglykosider fra Cistanche tubulosa (Schrenk) Hook. FI. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 35, 3309–3314.

Lei, L., Yang, FQ, Zhang, TY, Tu, PF, Wu, LJ, & Ito, Y. (2001). Preparativ isolering og rensing av acteosid og 2'-acetylacteosid fra Cistanches salsa (CA Mey) G. Beck ved motstrømskromatografi. Journal of Chromatography A, 912, 181–185.

Li, L., Tsao, R., Liu, ZQ, Liu, SY, Yang, R., Young, JC, et al. (2005). Isolering og rensing av akteosid og isoakteosid fra Plantago psyllium L. ved høyhastighets motstrømskromatografi. Journal of Chromatography A, 1063, 161–169.

Li, LL, Wang, XW og Wang, XF (1997). Antilipidperoksidasjon og antiradikal virkning av glykosider i herba Cistanches. China Journal of Chinese Materia Medica, 22, 364–367.

Li, J., Wang, PF, Zheng, RL, Liu, ZM, & Jia, ZJ (1993). Beskyttelse av fenylpropanoidglykosider fra Pedicularis mot oksidativ hemolyse in vitro. Planta Medica, 59, 315–317.

Lu, MC (1998). Studier av den beroligende effekten av Cistanche deserticola. Journal of Ethnopharmacology, 59, 161–165.

Nishimura, H., Sasaki, H., Inagaki, N., Chin, M., & Mitsuhashi, H. (1991). Ni fenetylalkoholglykosider fra Stachys szeboldzz. Phytochemistry, 30, 965–969.

Oka, F., Oka, H., & Ito, Y. (1991). Et systematisk søk ​​etter egnede to-fase løsningsmiddelsystemer for høyhastighets motstrømskromatografi. Journal of Chromatography, 538, 99–108.

Ravn, H., Nishibe, S., Sasahara, M., & Li, X. (1990). Fenolforbindelser fra Plantago Asiatica. Phytochemistry, 29, 3627–3631.

Schapoval, EES, Winter de Vargas, MR, Chaves, CG, Bridi, R., Zuanazzi, JA, & Henriques, AT (1998). Antiinflammatoriske og antinociseptive aktiviteter av ekstrakter og isolerte forbindelser fra Stachytarpheta cayennensis. Journal of Ethnopharmacology, 60, 53–59.

Shoyama, Y., Matsumoto, M., & Nishioka, I. (1987). Fenolglykosider fra syke røtter av Rehmannia glutinosa Var. Purpurea. Phyto Chemistry, 26, 983–986.

Wang, XW, Jiang, XY, Wu, LY og Wang, XF (2001). Rensende effekt av glykosider av Cistanche deserticola på frie radikaler og dets beskyttelse mot OH-indusert DNA-skade in vitro. Journal of Chinese Pharmacology, 36, 29–31.