Karnovskys fikseringsmiddel forhindrer at artefakter vises som vakuolering avledet fra vevsbehandling i nyrer behandlet med antisense oligonukleotid Ⅰ

Abstrakt: Antisense oligonukleotid(ASO) terapier har blitt identifisert som en ny behandlingsmodalitet foruovervinnelige sykdommer. Inyrer behandlet med ASOer, vakuoler, i tillegg til basofile granuler, observeres ofte i de proksimale tubuli. Noen rapporter har beskrevet at disse vakuolene sannsynligvis er et sekundært fenomen som følge avutvinning av ASOerunder vevsbehandling. I denne studien sammenlignet vi nyremorfologi etter fiksering med Karnovskys fikseringsmiddel eller 4 % paraformaldehydfosfatbuffer (PFA) med 10 % nøytralbufret formaldehydløsning (NBF). Sprague-Dawley hunnrotter, intravenøst ​​behandlet fire ganger med 50 mg/kg låst nukleinsyre inneholdende antisense-oligonukleotider (LNA-ASOs) i 1 eller 2 uker, ble undersøkt. Mikroskopisk ble vakuoler og basofile granuler i de proksimale tubuli observert i nyrene fiksert med NBF. Basofile granuler er indikasjoner på akkumulering av ASO-er. Dessuten inneholdt noen av vakuolene også svake basofile granuler, noe som tyder på at vakuolene var relevante for akkumulering av ASO-er. Selv om moderat vakuolering ble observert i de proksimale tubuli, var majoriteten av de vakuolerte epitelene negative for nyreskademolekylet-1 ved immunhistokjemisk farging. Vakuoler i de proksimale tubuli ble ikke observert i prøver utsatt for Karnovskys fiksering, selv om basofile granuler ble observert. I prøver utsatt for PFA-fiksering ble vakuoler og basofile granuler observert i de proksimale tubuli, lik de i prøver som ble utsatt for NBF-fiksering. Samlet sett viste funnene våre muligheten for overestimering av vakuolering på grunn av artefakter under vevsbehandling ved bruk av konvensjonell NBF-fiksering. Karnovskys fiksativ anses som et nyttig alternativ for å skille kunstige vakuoler fra ekte nefrotoksisitet. (DOI: 10.1293/tox.2021-0007; J Toxicol Pathol 2021; 34: 367–371)

Nøkkelord:antisense oligonukleotid, artefakt,Karnovskys fikseringsmiddel, vakuolering, basofil granulat, nyre

Cistanche Supplement Nyrefunksjon Støttetilskudd PhGs75% Ech 30% Act 12%

Nylig har antisense oligonukleotid-terapier (ASO) blitt etablert som nye modaliteter for behandling av intraktable sykdommer1, 2. ASO-er er korte, syntetiske, enkelttrådede oligodeoksynukleotider som binder seg til ribonukleinsyre og undertrykker genuttrykk3.

Toksikologisk er ASO-induserte toksisiteter kategorisert i hybridiseringsavhengige toksisiteter, som er relatert til ASO-sekvensen, og hybridiseringsuavhengige toksisiteter, som er relatert til kjemisk modifikasjon. Hybridiseringsuavhengige toksisiteter induseres av tre hovedmekanismer: 1) ASO-akkumulering, 2) pro-inflammatoriske effekter og 3) aptamere bindingseffekter4. Akkumulering av ASO-er observeres primært i lever og nyrer, og overdreven akkumulering fører til dysfunksjon av disse organene5. Den pro-inflammatoriske effekten induseres av stimulering av det medfødte immunsystemet via binding til Toll-lignende reseptorer hos gnagere og aper eller aktivering av den alternative komplementveien via inhibering av faktor H av ASOer hos aper6. Den aptameriske bindingseffekten induserer blodplateaktivering og aggregering/trombocytopeni for å binde den blodplatespesifikke reseptoren7. Dessuten regnes aptamerisk binding til intracellulære proteiner i hepatocytter som en av årsakene til levertoksisitet8–10. For å oppdage disse toksisitetene har forskere utviklet flere ikke-kliniske analyser; blant disse er histopatologisk undersøkelse en av de mest sensitive testene for å oppdage ASO-akkumulering.

Histopatologisk er akkumulering av ASO-er ofte observert som basofile granuler i cytoplasmaet til Kupffer-cellene i leveren eller de proksimale tubuli i nyrene. Den fremtredende akkumuleringen av basofile granuler er korrelert med en økt forekomst eller alvorlighetsgrad av degenerative forandringer, ofte observert som vakuolering eller degenerasjon/nekrose av det proksimale tubulære epitelet i nyrene4. Basofile granulat alene anses ikke som toksikologisk signifikant11; derfor er differensieringen av basofile granulatakkumulering fra degenerative endringer viktig for å evaluere ASO-relaterte toksisiteter.

Vakuoler, som ofte observeres i de proksimale tubuli av nyrene til cynomolgus-aper behandlet med ASO, inneholder basofilt materiale og viser den samme generelle fordeling i cellene som basofile granuler11, 12. Noen få rapporter har antydet at fikseringsprosessen kan påvirke utseende av ASO-akkumulering i fagolysosomal avdeling5, 11. I tillegg, Henry et al. og Engelhardt beskrev at vakuoler i de proksimale tubuli sannsynligvis vil være et sekundært fenomen som følge av ekstraksjon av ASOer under prosessering fordi vakuolene er fraværende i paraformaldehyd/glutaraldehyd perfusjonsfikserte nyrer5, 11. Vakuoler i de proksimale tremolguene til apecystene. med mipomersen ble spekulert i å dukke opp under fikseringsprosessen13.

Selv om vakuolering på grunn av ASO-behandling kan være en artefakt i noen tilfeller, har denne hypotesen ikke blitt klart bevist, og ingen rapporter har identifisert den passende fikseringsmetoden for toksikologisk evaluering. Følgelig sammenlignet vi i denne studien nyremorfologi etter fiksering med Karnovskys fikseringsmiddel eller 4 % paraformaldehydfosfatbuffer (PFA) med 10 % nøytralbufret formaldehydløsning (NBF). I tillegg demonstrerte vi nytten av Karnovskys fikseringsmiddel som et alternativt fikseringsmiddel for å forhindre artefaktavledet vakuolering.

Fire uker gamle Sprague-Dawley hunnrotter ble kjøpt fra Charles River Laboratories Japan Inc. (Kanagawa, Japan) og akklimatisert til laboratorieforhold. Dyrene ble holdt under kontrollerte forhold (12-times lys/mørke-syklus, temperatur på 23 ± 2 grader, relativ fuktighet på 50 ± 25%) og fikk fri tilgang til en standard kommersiell diett (autoklaveret CR-LPF; Oriental Yeast Co., Ltd., Tokyo, Japan) og vann fra springen. Tjue dyr ble tildelt følgende fire grupper (med fem dyr hver): gruppen 1-ukers saltvannsbehandlet (kontroll- 1W), 2-ukers saltvannsbehandlet gruppe (kontroll{11}} {14}}W), den 1-ukelåste nukleinsyren som inneholder antisense-oligonukleotid (LNA-ASO)-behandlet gruppe (ASO-1W), og 2-ukers LNA ASO-behandlet gruppe (ASO-2W). Dyrene var 5 uker gamle på tidspunktet for initiering av 50 mg/kg LNA-ASO-administrasjon. LNA-ASO ble administrert intravenøst ​​fire ganger totalt i henhold til følgende regime: dag 1, 4, 8 og 11 i ASO-2W-gruppen; og dag 1, 2, 3 og 4 i ASO-1W-gruppen. Dyrene i kontroll-1W- og ASO-1W-gruppene ble avlivet på dag 7. Dyrene i kontroll-2W- og ASO-2W-gruppene ble ofret på dag 14. Ved hver terminal obduksjon ble blodprøver for klinisk patologi tatt fra abdominal vena cava under dyp anestesi med isofluran. Etter blodprøvetaking ble alle rottene avlivet ved blodbad ved umiddelbart å kutte den abdominale aorta. Den ytre kroppsoverflaten, thorax- og bukhulene og innvollene ble makroskopisk undersøkt, og venstre nyrer ble fjernet og behandlet for mikroskopisk undersøkelse. Alle prosedyrer ble utført i samsvar med reglene for fôring og lagring av forsøksdyr og dyreforsøk fra Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation.

Serumprøver ble tatt ved sentrifugering av blodprøvene ved 4 grader. Serumbiokjemisk analyse ble utført ved bruk av et TBA-2000FR-instrument (Canon Medical Systems Corporation, Tochigi, Japan) for å vurdere nivåene av blodureanitrogen (BUN) og kreatinin (CRE)

Nyrene ble fiksert ved bruk av tre fikserende løsninger som følger: Etter å ha delt nyren på tvers i tre segmenter, ble den midtre delen inkludert nyrebekkenet fiksert i 10% NBF i 5 dager; den kraniale delen ble fikset i Karnovskys fikseringsmiddel (Muto Pure Chemicals Co., Ltd., Tokyo, Japan); og den kaudale delen ble fiksert i 4 % PFA i 17 timer ved 4 grader og deretter plassert i 10 % NBF i 24 timer. Hver fast prøve ble dehydrert og innebygd i parafin. Vevsseksjoner ble forberedt for hematoxylin og eosin (H&E)-farging. Immunhistokjemisk farging ble utført ved bruk av antistoffer rettet mot nyreskademolekyl-1 (KIM-1; R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA; 1:300 fortynning) og lysosomalt assosiert membranprotein 2 (LAMP{{ 13}}, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA; Histofine Simple Stain Rat MAX PO (Nichirei Biosciences Inc., Tokyo, Japan) ble brukt som sekundært antistoff.

Støttetjeneste fra Wecistanche:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tlf:+86 15292862950

Handle for flere spesifikasjoner:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop