Nyresykdomsassosierte varianter av apolipoprotein L1 viser funksjonsforsterkning i kationkanalaktivitet

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Jonathan Bruno og John C. Edwards

Varianter i Apolipoprotein L1 (ApoL1) er kjent for å være ansvarlige for økt risiko for noen progressivenyresykdommerblant mennesker med afrikansk aner. ApoL1 er et amfitropisk protein som kan settes inn i fosfolipidmembraner og gi anion- eller kationselektiv permeabilitet til fosfolipidmembraner avhengig av pH. Hvorvidt disse aktivitetene er forskjellige mellom variantene eller om de bidrar til sykdomspatogenese er ukjent. Vi brukte analyser av spenningsdrevet ionefluks fra fosfolipidvesikler og stabilmembranassosiasjon for å vurdere forskjeller mellom ApoL1isoformer. Det er en signifikant (omtrent to ganger) økning i den kationselektive ionepermeaseaktiviteten til de to nyresykdomsassosierte variantene sammenlignet med referanseproteinet. Derimot finner vi ingen forskjell i den anionselektive permeaseaktiviteten ved lav pH blant isoformene. Sammenlignet med referansesekvensen viser de to sykdomsassosierte variantene økt stabil assosiasjon med fosfolipidvesikler under forhold som støtter kationpermeaseaktiviteten, noe som tyder på at økt aktivitet kan skyldes mer effektiv membranassosiasjon og -innsetting. Det er ingen forskjell i membranassosiasjon blant isoformer under optimale forhold for anionpermeaseaktiviteten. Disse dataene støtter en modell der økt kationpermeabilitet kan bidra til de progressive nyresykdommene assosiert med høyrisiko ApoL1-alleler.

To distinkte varianter av proteinet ApoL1 er kjent for å være ansvarlige for den anerkjente økte risikoen for progressiv proteinurisknyresykdomhos mennesker med afrikansk aner, spesielt på grunn av fokal segmentell glomerulosklerose, hypertensiv nefrosklerose og HIV-assosiert nefropati (1–3). De funksjonelle rollene til ApoL1 i menneskelige celler, virkningen av sykdomsassosierte varianter på disse funksjonene, og hvordan slike endringer inaktivitet kan akselererenyresykdomer uklare (4, 5).

Den eneste biokjemiske aktiviteten som ApoL1-proteinet er kjent for å ha, er å fungere som en ionekanal. Det N-terminale domenet til ApoL1 har blitt notert å ha strukturell likhet med bakteriell kolicin A1 (6). I likhet med colicin A1 er ApoL1 et amfitropisk protein som under visse omstendigheter kan gå inn i en lipidmembran fra en vandig løsning og deretter fungere som en ionepermease (6–9). Renset rekombinant villtype ApoL1 er stabil i vaskemiddelløsning ved nøytral pH (8, 9). Ved lav pH kan ApoL1 gå inn i fosfolipidmembraner og øke den anionselektive permeabiliteten til membranene (6, 7, 9). Når cis-pH heves tilbake til nøytral, undertrykkes den anionselektive permeabiliteten og en kationselektiv kanal aktiveres (8, 9). Disse dataene støtter en modell der ApoL1, presentert for et surt rom langs enten de eksocytiske eller endocytiske banene, kunne settes inn i organellens begrensende membran som fører til økt anionpermeabilitet. Påfølgende transport av proteinet til andre membranrom hvor cis-pH ville være nøytral (som plasmamembranen eller mitokondrielle membraner) ville undertrykke anionpermeabiliteten og aktivere kationpermeasen. Hvorvidt disse ionepermeaseaktivitetene spiller en rolle i patogenesen til ApoL1-assosiertnyresykdommerer uklart.

Vi brukte vesikkelbaserte metoder for å analysere for forskjeller i ionpermeaseaktiviteter og membranbinding mellom referansesekvensen (villtype), betegnet G0, og de to sykdomsassosierte variantene, betegnet G1 og G2. Vi finner at sammenlignet med G0 viser både G1 og G2 isoformer økt spesifikk aktivitet av kationpermeaseaktiviteten ved nøytral pH uten å endre den anionselektive permeaseaktiviteten ved lav pH. Videre viser de sykdomsassosierte isoformene G1 og G2 økt stabil membranassosiasjon sammenlignet med G0 under forhold som støtter kationpermeaseaktiviteten, men ikke under forhold som støtter teanionpermeaseaktivitet. Vi finner ingen effekt på mønsteret av pH-følsomhet for verken bindingstrinnet eller utstrømningstrinnet til kationkanalaktiviteten, og vi finner ingen effekt på pH-følsomheten til den anionselektive permeaseaktiviteten. Vi konkluderer med at de sykdomsassosierte variantene av ApoL1 selektivt forbedrer kationkanalaktiviteten til proteinet, sannsynligvis i det minste delvis ved å forbedre membraninnsetting. Vi foreslår at denne forbedrede kanalaktiviteten bidrar til progressivnyresykdomhos personer som bærer høyrisiko-genotyper.

Cistanche kan behandlenyresykdom

Resultater

Rekombinante isoformer av ApoL1 med N-terminalsignalsekvensen fjernet og erstattet med en 6His/T7epitop-tag ble uttrykt og renset. Alle tre viste identiske kromatografiske egenskaper gjennom rensingen og var umulig å skille ved gelelektroforese, figur 1.

Toppfraksjoner ble fortynnet til 100 ug/ml og underkastet tovesikkelutstrømningsanalyser for evnen til å gi klorid- og kaliumpermeabilitet. Analysen består av to separate stadier. I assosiasjonsstadiet blandes ApoL1 med KCl-lastede fosfolipidvesikler og får settes inn i membranene. Ekstravehikulær KCl og buffer fjernes deretter ved passasje gjennom en avsaltingsspinkolonne som er ekvilibrert i isotonisk sukrose, og genererer store innvendig-til-utvendige gradienter av begge Kand. Cl-ioner. I efflukstrinnet fortynnes spinnkolonne-eluatet i en isotonisk bufret sukroseløsning som opprettholder KCl-gradienten ved ønsket pH. Ekstravehikulær Cl-konsentrasjon overvåkes med en klorid-selektiv elektrode. Selv om enten K- eller Cl-selektiv permeabilitet er tilstede, vil ingen av ionene kunne gå ut av vesiklene på grunn av manglende motion-bevegelse. Spenningsdrevet ioneutstrømning initieres ved tilsetning av en mettende konsentrasjon av en motionofor. Tilsetningen av den K-selektive ionoforen, valinomycin(Val), vil indusere et stort innvendig negativt membranpotensial som, hvis Cl-permeabilitet er tilstede, vil drive KCl-utstrømning som vil bli oppdaget av den klorid-selektive elektroden; således etter Val reflekterer hastigheten for Cl-utstrømning Cl-permeabilitet. Omvendt vil tilsetningen av den Cl-selektive ionoforen, Chloride Ionophore 1(CI1), indusere et innvendig positivt membranpotensial som vil drive KCl-utstrømning hvis en K-permeabilitet er tilstede. Derfor, etter tilsetning av Cl1, reflekterer hastigheten for Cl-utstrømning K-permeabilitet. Denne analysen kan således tjene som enten en Cl- eller K-permeabilitetsanalyse, avhengig av hvilken ionofor som brukes. Starthastigheten for ionefluks etter tilsetning av ionofor tas som den spesifikasjonsmessige permeabiliteten til vesiklene. Merk at Cl-utstrømning før tilsetning av ionofor indikerer en viss permeabilitet for både Kand Cl. Selv i denne omstendigheten representerer hastigheten for Cl-utstrømning etter tilsetning av et overskudd av motion-ionoforen permeabiliteten for ionet av interesse - Cl etter tilsetning av Val, og K etter tilsetning av Cl1.

Cistanche kan behandlenyresykdom

Kloridpermeaseaktivitet

Våre tidligere studier viste at anionpermeabiliteten er størst når både membranassosiasjonstrinnet og utstrømningstrinnet utføres ved pH 5.0, og disse forholdene ble brukt til å sammenligne Cl-permeabilitetsaktiviteten til de tre isoformene, ved å bruke Val for å initiere Cl permeabilitetsavhengig effluks. Eksempler på rådata er vist i figur 2A, som viser utgangen fra den Cl-selektive elektroden i millivolt plottet mot tid. Opptaket begynner før tilsetningen av spinkolonne-eluatet som inneholder vesikler og protein, mV-verdien gjenspeiler 10 μM Cl-konsentrasjonen. Det Cl-frie spinnkolonneeluatet tilsettes ved den første pilen, og fortynner Cl, som gjenspeiles i den oppadgående avbøyningen av mV-sporingen. Val er lagt til ved den andre pilen, og utløser Cl-utstrømning hvis Cl-permeabilitet er tilstede, noe som gjenspeiles av det progressive fallet inmV. Triton X-100 tilsettes ved den tredje pilen, og frigjør alt gjenværende intravesikulært klorid. Etter konvertering fra mV til kloridkonsentrasjon ved bruk av en standardkurve generert for elektroden under analysebetingelsene, bestemmes den fraksjonelle initialhastigheten for Cl-frigjøring etter tilsetning av Val og tas som kloridpermeabiliteten. Sammenlignet med ingen proteinkontroll (blå sporing), indikerer den høye hastigheten for Cl-frigjøring etter tilsetning av Val at ApoL1 gir betydelig Clpermeabilitet som ser ut til å være sammenlignbar blant de tre isoformene (røde, grønne og gule spor). Den svært lave utstrømningshastigheten før Val indikerer at kaliumpermeabiliteten er mye lavere enn Cl-permeabiliteten. En rekke konsentrasjoner av ApoL1-isoformene ble analysert for Cl-permeaseaktivitet (fig. 2B). Som tidligere rapportert for G0, finner vi at Clpermease-aktivitet er lineært relatert til massen av protein i analysen for alle tre isoformene. Permeaseaktiviteten ved hver konsentrasjon er ikke forskjellig blant de tre isoformene. Konsentrasjonskurven ble utført to ganger ved bruk av to forskjellige sett med proteinpreparater, og ga samme resultat.

Seks uavhengige preparater av de tre proteinene ble analysert for Cl-permeaseaktivitet ved pH 5.0 som oppsummert i figur 2C. I ingen av settene med preparater fant vi en signifikant forskjell i Cl-permeaseaktivitet blant isoformene (p > 0.05 for sammenligning av G0 med G1 eller G2 i hvert sett) . Gjennomsnittlig utstrømningshastighet for alle seks preparatene (merket ALL i fig. 2C) var 1,21 ± 0,32 prosent/s for referansesekvensen G0, 1,36 ± 0,41 prosent/s for G1, og 1,18 ± 0.34 for G2(gjennomsnitt ± SD, n=6 for hver; p=0.47 og 0.94 for sammenligning av G0 med G1 og G2, henholdsvis). For å bestemme om de sykdomsassosierte mutasjonene endrer pH-sensitiviteten til teanionpermeasen, ble Cl-permeabiliteten gitt av hver isoform analysert gjennom en rekke pH-verdier ved å bruke den indikerte pH-verdien for både assosiasjons- og utstrømningstrinn i analysen (fig. 2D). Vi fant ingen. betydelige forskjeller mellom isoformene. Dette eksperimentet ble utført to ganger ved bruk av to forskjellige sett med proteinpreparater, og ga samme resultat. Dermed er Clpermease-aktiviteten ikke signifikant forskjellig mellom de to sykdomsassosierte variantene og referansesekvensen.

Kaliumpermeaseaktivitet

Våre tidligere studier indikerte at kationpermeabiliteten er størst når membranassosiasjonstrinnet utføres ved pH 6.0 og utstrømningstrinnet utføres ved pH 7.5, og vi brukte disse betingelsene med mindre annet er spesifisert. Eksempler på rådata fra en K-permease-analyse er vist i figur 3. Som med Cl-permeabilitetsanalysene tilsettes spinnkolonne-eluatet ved den første pilen, ionoforen (i dette tilfellet Chloride Ionophore1, CI1) tilsettes ved den andre pilen, og vaskemiddel tilsettes ved den tredje pilen. De første utstrømningshastighetene etter tilsetning av ionofor, som representerer K-permeabiliteten, er vist med de grå stiplede linjene. Det blå sporet er fra ingen proteinkontroll, og viser den endogene bakgrunnspermeabiliteten til vesiklene alene. Det røde sporet viser aktiviteten til G0(villtype)-varianten, og viser tydelig tilstedeværelsen av Kpermeabilitet som er større enn kontrollvesikler gitt av proteinet som tidligere rapportert (9). De gule og grønne sporene viser aktiviteten til henholdsvis G1- og G2-variantene. De første stigningene etter tilsetning av ionofor er klart større for G1 og G2 enn for G0, noe som indikerer at de sykdomsassosierte variantene støtter større K-permeaseaktivitet enn G0.

I motsetning til Cl-permeabilitetsanalysen, og som tidligere rapportert for G0-isoformen (9), under K-permease-analysebetingelsene, er det noe utstrømning før ionofor i vesiklene som inneholder en av de tre isoformene, representert ved den nedadgående skråningen av opptakene etter tilsetning av prøve og før tilsetning av ionofor. Mens den høye utstrømningshastigheten etter tilsetning av ionofor indikerer tilstedeværelsen av betydelig K-permeabilitet, indikerer effluks før ionofor tilstedeværelsen av noe Cl-permeabilitet også, noe som lar begge ionene lekke ut av vesiklene i fravær av ionofor. Denne lekkasje står sannsynligvis for både den stumpe økningen i elektrodeutgang umiddelbart etter tilsetningen av spinnkolonneeluatet og den påfølgende nedadgående skråningen før CI1 som sees med alle registreringer som inneholder ApoL1. Forutsatt at denne lekkasjen begynner når prøven passerer gjennom spinnkolonnen, vil den også forklare forskjellene i den endelige Cl-konsentrasjonen etter tilsetning av vaskemiddel, siden ethvert tap av KCl på spinnkolonnen vil bety mindre total KCl tilsatt til analysen. Den kvantitative tolkningen av ionoforhastigheten er ikke enkel, annet enn at den må være en funksjon av permeabilitetene til både Kand Cl. Som før (9), tilskriver vi denne aktiviteten den gjenværende Cl-permeaseaktiviteten som vi ser ved pH 7,5 som i figur 2D (se også Bruno et al. (9), figur 4D).

Kaliumpermease-analyser ble utført over en rekke proteinkonsentrasjoner (fig. 4A). Aktiviteten var lineært relatert til massen av protein i analysen for hver isoform, men de to sykdomsassosierte isoformene viste vesentlig økt utstrømningsaktivitet sammenlignet med G0. Denne konsentrasjonskurven ble reprodusert med tre separate sett med proteinpreparat som ga svært like resultater.

Seks uavhengige preparater av de tre isoformene ble analysert for K effluksaktivitet ved å bruke 2 ug protein i hver analyse. I hvert av de seks settene var aktiviteten for G1- og G2-isoformene betydelig større enn for G0 (fig. 4B). Gjennomsnitt av alle seks datasettene ga utstrømningshastigheter på 0.349 ± 0.063 prosent /s for G{{10}}, {{15} },709 ± 0.176 prosent /s for G1, og 0.673 ± 0,142 prosent /s for G2 (gjennomsnitt ± SD, n=6 for hver; p < 0,00001="" for="" sammenligning="" av="" g0="" med="" enten="" g1="" eller="" g2).="" de="" spesifikke="" aktivitetene="" til="" k-permeasen="" til="" g1="" og="" g2="" er="" henholdsvis="" 2.03-="" og="" 1.93-="" ganger="" større="" enn="" g0="" ved="" denne="">

Avhengigheten av K-permeaseaktiviteten av pH i membranassosiasjonstrinnet og ioneutstrømningstrinnet ble analysert separat. Selv om vi bekreftet at den totale utstrømningsaktiviteten til G1 og G2 er større enn for G0 under "standard" betingelser (binding ved pH 6, effluks ved pH 7,5), fant vi ingen signifikant forskjell i formen på kurven aktivitet versus ekstern (cis) pH for enten membranassosiasjonstrinnet (fig. 4C) eller ioneutstrømningstrinnet (fig. 4D). Vi fant heller ingen forskjeller mellom isoformene i aktivitetens avhengighet av høy intravesikulær (trans) pH eller nødvendigheten av tilstedeværelsen av toverdig kation (fig. 4E), og bemerker videre at enten kalsium eller magnesium er like effektive når det gjelder å gi det nødvendige toverdige kationet for fullt aktivitet. Hvert av disse eksperimentene ble utført to ganger ved bruk av forskjellige sett med renset protein, noe som ga identiske resultater.

Stabil membranforening

Vi har tidligere vist at renset rekombinant ApoL1 spontant binder seg til fosfolipidmembraner som viser lignende avhengighet av pH og fosfolipidsammensetning som for ionepermeaseaktivitetene (9). Ved å bruke lignende metoder sammenlignet vi lipidvesikkelbindingsegenskapene til referanseversjonen av ApoL1 med nyresykdomsassosierte varianter under forhold som støtter optimale Cl- eller K-permeaseaktiviteter (fig. 5). For Clpermease-betingelsene ble proteinet inkubert med lipidvesikler ved pH 5.0 før kaotropisk ekstraksjon for å fjerne proteiner som ikke var stabilt assosiert med vesiklene. Membranbundet protein ble isolert ved flotasjon gjennom en sukrosepute og vurdert ved kvantitativ western blotting. Resultatene er vist i figur 5A. Det var ingen signifikant forskjell i mengden protein bundet til vesikler mellom G{{10}} og enten G1- eller G2-isoformer. Av 500 ng protein i hver reaksjon var mengden bundet til vesikler 223 ± 33 ng for G0,239 ± 38 ng for G1, og 191 ± 28 ng for G2 (gjennomsnitt ± SD ; n=8 for hver gruppe, p=0.35 og 0.076 for sammenligning av G0 med henholdsvis G1 og G2). Omtrent 40–50 prosent av proteinet i analysen er bundet til membraner under disse forholdene. Dette eksperimentet ble utført to ganger og ga svært like resultater.

For å vurdere binding under betingelser som er optimale for Kpermease-aktiviteten, ble proteinet inkubert med vesikler ved pH6.0, og deretter skiftet til pH 7.5 før kaotropisk ekstraksjon for å fjerne ikke-stabilt innsatt protein. Membranbundet protein ble isolert ved flotasjon av membranvesiklene gjennom asukrosepute og vurdert ved kvantitativ western blotting. Resultatene er vist i figur 5B. De sykdomsassosierte variantene viser betydelig mer effektiv binding sammenlignet med G0. Av de 500 ng protein som ble lagt til hver reaksjon, var mengden bundet til vesikler 43,5 ± 14,5 ng (n=8) for G{{30}} ,73.0 ± 17,7 ng (n=7) for G1, og 69,3 ± 10,3 ng (n=8) for G2(gjennomsnitt ± SD; p=0.00076 og 0,0018 for sammenligning av G0 med henholdsvis G1 og G2). Omtrent 9 prosent av G0-proteinet i reaksjonen var stabilt assosiert med vesiklene sammenlignet med omtrent 14 prosent av G1 og G2 under disse forholdene. Dette eksperimentet ble utført to ganger ved bruk av uavhengige preparater som ga lignende resultater.

Diskusjon

Vi presenterer her resultater fra studier av ionepermeaseaktiviteter til ApoL1 og densnyre-sykdom-assosierte varianter som ga flere signifikante resultater. For det første finner vi at de sykdomsassosierte variantene av ApoL1 har betydelig økt Kpermease-aktivitet, som er omtrent det dobbelte av G0-isoformen i våre analyser. For det andre, i motsetning til Kpermease, er det ingen signifikante forskjeller i den spesifikke aktiviteten til Cl-permeaseaktiviteten ved pH 5.0 blant isoformene. For det tredje er det ingen forskjeller i pH-sensitiviteten til verken K- eller Cl-permeaseaktivitetene, eller kravet til høy trans-pH og nødvendigheten av toverdig kation for Kpermease-aktiviteten blant isoformene. For det fjerde, under optimale forhold som støtter K-permeasen, viser de sykdomsassosierte variantene forbedret stabil membranassosiasjon sammenlignet med G0, men ingen forskjell i membranassosiasjon under optimale forhold for Cl-permeaseaktiviteten.

Funnene våre som viser økt K-permease uten effekt på Cl-permease er veldig robuste. Ved å bruke optimale forhold for hver permease-aktivitet fant vi i hovedsak identiske resultater blant seks uavhengige sett med preparater, med Kpermease-aktiviteten til de sykdomsassosierte variantene betydelig større enn G0 i hver. Hvert sett ble forberedt og analysert samtidig ved bruk av vanlige reagenser. Gyldigheten av proteinkonsentrasjonene bestemt av BCA-analysen ble bekreftet av den sammenlignbare intensiteten til Coomassie-farging på SDS-PAGE. Disse dataene inkluderer alle vellykkede forsøk på samtidig rensing - vi har aldri generert en ressurs av alle tre variantene der disse relative aktivitetene ikke ble observert.

På samme måte var fraværet av forskjeller i den anion-permeasespesifikke aktiviteten ved pH 5 konsistent blant alle settene av preparater. Derfor er vår primære konklusjon at de sykdomsassosierte variantene av ApoL1 gir selektiv gevinst av funksjon i K-permeaseaktiviteten uten å påvirke Cl-permeaseaktiviteten, som analysert under optimale forhold for hver av disse aktivitetene. Tilstedeværelsen av betydelige forskjeller i kationkanalaktiviteten til ApoL1-varianter som korrelerer med kapasiteten til å drive sykdom har implikasjoner for mulige patogene mekanismer. Den selektive naturen til den økte ionepermeabiliteten indikerer at økt kationpermeaseaktivitet til de sykdomsassosierte variantene kan bidra til sykdom, men at anionpermeaseaktiviteten ved lav pH, som ikke er forskjellig blant isoformene, er usannsynlig å spille en kritisk rolle.

Undersøkelsene av effektene av variantene på pH-sensitiviteten til aktivitetene og på graden av stabil membranbinding av proteinet kaster lys over mekanismen som K-permeaseaktiviteten kan økes med. For det første, bortsett fra å bekrefte den økte aktiviteten til K-permease under optimale forhold, fant vi ingen forskjeller i formene til kurvene som viser pH-effekter på membranassosiasjonen og utstrømningstrinnene til K-permeaseaktiviteten eller av effekten av pH på total Cl-permeaseaktivitet. Videre var det ingen forskjeller i kravet til forhøyet pH i det indre av vesiklene eller i kravet om tilstedeværelse av toverdig kation i reaksjonen for K-permeaseaktiviteten blant alle isoformer. Dermed fant vi ingen bevis for en forskjell i de iboende egenskapene til selve kanalen. Derimot viste variantene signifikant økt stabil assosiasjon med fosfolipidvesikler under forhold som støtter Kpermease-aktiviteten, med omfanget av denne effekten er omtrent det samme området som endringsinaktiviteten. Samlet antyder dataene at grunnlaget for den økte K-permeaseaktiviteten ganske enkelt er mer effektiv membraninnsetting under forholdene som støtter aktiviteten, uten behov for å påkalle fundamental endring i egenskapene til det innsatte proteinet.

Tre domener er identifisert i ApoL1-strukturen(6). Ionekanalaktiviteten antas å ligge i det kolicinhomologe "poredannende" domenet, som opptar omtrent 60 prosent av proteinet ved dets N-terminale ende. De sykdomsassosierte sekvensvariasjonene er ikke i det poredannende domenet, men ligger i avstand fra det i et coiled-coil-domene, som omfatter omtrent 16 prosent av proteinet ved C-terminalen. Sletting av dette domenet har ingen effekt på trypanolytisk aktivitet, men er sterkt bevart blant Apol-isoformer både innenfor og mellom arter (10). Det har blitt foreslått at denne regionen fungerer som et kontrollert domene (10), og våre data indikerer at sykdomsfremkallende mutanter i dette domenet faktisk har økt membranbinding under forhold som støtter kationkanalaktivitet og økt kationkanalaktivitet. En tolkning er at det C-terminale domenet tjener til å undertrykke membranassosiasjonen/innsettingen som er nødvendig for kationpermeaseaktivitet, og mutasjon av dette domenet avslapper denne undertrykkelsen.

Cistanche kan behandlenyresykdom

Observasjonene av membranbinding har ytterligere implikasjoner og belyser noen aspekter av forholdet mellom anion- og kationpermeaseaktiviteter. Vi finner her at vesentlig mer protein er bundet til membraner ved optimale anionpermeaseaktivitetsbetingelser (pH 5.0) enn ved optimale bindingsbetingelser som støtter kationpermeaseaktivitet (pH 6.0), og dette gjelder for alle isoformer (fig. 5). Legg merke til forskjellen i pH-sensitiviteten til anionpermeaseaktiviteten (fig. 2D) og membranbindingstrinnet for kationpermeaseaktiviteten (fig. 4C): anionpermease øker dramatisk under pH 6, mens evnen til protein satt inn i membranen til å støtte kation gjennomsyre aktiviteten faller betydelig. Våre tidligere rapporterte data viste at stabil membranassosiasjon av G0 stiger betydelig når pH faller gjennom det samme pH-området, og det er området der den iboende proteinfluorescensen er mest dramatisk undertrykt(9), noe som indikerer en betydelig overgang i strukturen til proteinet . Alt sammen tyder dataene på at membraninnsetting ved pH 6.0 er fundamentalt annerledes enn membraninnsetting ved pH 5.0. Ved pH 6.0 assosieres en mindre del av proteinet med membraner, ledsaget av bare en mindre endring i indre fluorescens og begrenset anionpermeaseaktivitet, men med kapasitet til å gå over til en kationpermeabel form når cis-rommet titreres til pH7 .5. Videre er effektiviteten til denne bindingen større for de sykdomsassosierte variantene, parallelt med den økte kationpermeaseaktiviteten etter pH-skifte. I motsetning til dette, ved pH 5.0 er en mye større del av proteinet assosiert med membranene; denne bindingen er ledsaget av en stor endring i intrinsicfluorescens og fremkomsten av mye større anionpermeaseaktivitet. Verken membranbinding eller anionpermeaseaktivitet er forskjellig blant isoformer. Kapasiteten for dette innsatte proteinet til å gå over til kationpermeasebekreftelsen er sterkt redusert. Vi antar at den tidligere rapporterte endringen i indre fluorescens når pH faller fra 6 til 5 reflekterer en strukturell transformasjon til en form som ikke er i stand til å gå over til kationpermeasekonformasjonen, og forskjeller mellom isoformene har ingen effekt på ionepermeaseegenskapene til denne konformasjonen.

En ytterligere ny observasjon er at kalsium- og magnesiumioner er like effektive for å støtte kationkanalaktiviteten til ApoL1. Dette antyder sterkt at rollen til divalent kation ikke er gjennom en viss høyaffinitetsbinding av proteinet, men mer sannsynlig en mindre spesifikk ladningsbroeffekt som lar negativt ladet protein interagere med den negativt ladede overflaten til fosfolipidmembraner.

Andre undersøkelser som vurderer forskjeller i ionekanalaktivitet til ApoL1 isoformer er publisert. Thompson og Finkelstein (8) brukte elektrofysiologiske metoder med plane lipid-dobbeltlagsteknikker for å vurdere kanalaktiviteten til renset rekombinant ApoL1, og rapporterte ingen forskjeller i kanalkarakteristikker blant isoformene. Det er viktig å merke seg at plane lipid-dobbeltlagsmetoder og vesikkelbaserte effluksanalyser, mens begge er kanalanalyser, gir forskjellige typer informasjon og kan betraktes som komplementære eksperimentelle systemer. Lipid-dobbeltlagsmetoder er en enestående tilnærming for å definere enkeltkanalsegenskaper til renset protein, men er mindre kraftige verktøy for å kvantifisere spesifikk aktivitet, mens vesikkelutstrømningsanalyser kan gi kvantitative data om aktiviteten til en populasjon, men lite informasjon om enkeltkanalegenskaper. Observasjonene til Thomp son og Finkelstein er derfor ikke inkonsistente med våre, som heller ikke viser noen tilsynelatende forskjeller i kanalens iboende egenskaper, men bare en forskjell i spesifikk aktivitet på omtrent todelt, en forskjellsskala som ville være ganske vanskelig å oppdages i lipid-dobbeltlagssystemer.

Undersøkelser som bruker renset protein og lipider har den fordelen å avsløre egenskaper som tydeligvis skyldes proteinet i seg selv og som ikke endres av andre komponenter, ekspresjonskinetikk eller membranhandel som kompromitterer mer komplekse systemer. Imidlertid er de nødvendigvis tause om den endelige effekten disse aktivitetene har på levende celler. Studier som bruker cellebaserte ekspresjonssystemer for å fjerne ionekanalaktivitetene til ApoL1 er rapportert (gjennomgått i Friedman og Pollak, 2019 (3)). Olabisi et al.(11) uttrykte ApoL1-isoformer i HEK-celler og vurderte steady-state intracellulær kaliumkonsentrasjon. De fant lavere intracellulært kalium i celler som uttrykker G1 og G2 sammenlignet med celler som uttrykker G0. Selv om denne observasjonen kan være i samsvar med økt plasmamembran K-permeabilitet, kan den nedre intracellulære K også være en uspesifikk konsekvens av den større cytotoksiske effekten av varianten gjennom en hvilken som helst mekanisme, noe som fører til mindre aktiv NaK ATPase-aktivitet og/eller nedbrytning av plasmamembranintegritet. O'Toole et al. (12) nøye kalibrerte ekspresjonsnivåer i HEK-celler og vurderte utseendet til plasmamembrankationkanalaktivitet, og fant nodifferanser mellom isoformene. Shah et al. (13) rapporterte målretting av ApoL1 til mitokondrier der de sykdomsassosierte variantene induserte åpning av overgangsporen for mitokondriell permeabilitet, i samsvar med nyere bevis for trypanosom cytotoksisitet. Hvorvidt denne effekten krever ionekanalaktivitet til ApoL1 er uklart. Med hver av disse studiene, på grunn av kompleksiteten til cellebaserte ekspresjonssystemer, kan det ikke være sikkert om noen forskjeller som er notert skyldes proteinets iboende egenskaper eller andre interagerende komponenter som er tilstede i celler.

Patogene gain-of-function mutasjoner viser typisk dominerende arvemønster, mensfenotype av nyresykdomassosiert med ApoL1-varianter er recessiv. En mekanisme som en forsterknings-av-funksjon-mutasjon kan være berecessiv er hvis proteinet fungerer som en homomultimer, og WT kan utøve en dominant-negativ effekt på den aktiverte varianten. Hvorvidt ApoL1 fungerer som en kanal som en monomerer en multimer er foreløpig ukjent.

Våre data tyder på at økt kationpermeabilitet til lignende nivåer av proteinekspresjon kan bidra til tocytotoksisitet i podocytter eller andre celler. Det kan imidlertid virke usannsynlig at bare en dobling av aktiviteten kan konvertere et tilsynelatende godartet molekyl til én kjøresykdom. Ikke desto mindre har sykdommene assosiert med ApoL1-varianter en tendens til å progrediere sakte, og subtile forskjeller over en lengre periode (måneder til år) kan tenkes å ha stor kumulativ effekt. Andre potensielle mekanismer for ApoL1action ansvarlig fornyreskadehar blitt foreslått og støttes av bevis (3–5, 11–16), inkludert effekter på apoptose, autofagi, mitokondriell funksjon, intracellulær membranhandel og medierende effekter av ekstracellulære signalmolekyler, blant andre. Den relative betydningen av forskjeller i ApoL1-kanalaktivitet beskrevet her versus andre potensielle virkningsmekanismer ved kjøring av sykdom gjenstår å bestemme.

Cistanche kan behandlenyresykdom

Eksperimentelle prosedyrer

Uttrykkskonstruksjoner

pET-ApoWT som koder for N-terminal 6His og T7 epitop-merket ApoL1 (G0 versjon) ble tidligere beskrevet (9). Det kodede proteinet er identisk med det til Genbank accession#BC143038 (haplotype 150K, 228I, 255K) fra aminosyre 28 til 398, og eliminerer signalsekvensen i aminosyrene 1–27 og med tillegg av N-terminal {{ 17}}His og T7-epitop-tagsen kodet av pET28a-plasmidet. Plasmider som koder for G1- og G2-variantene ble generert fra pET-ApoWT ved substitusjon av AleI til XhoI-restriksjonsfragmentet med fragmenter som inneholder variantsekvensene, syntetisert av Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, og identiteten til de resulterende plasmidene bekreftet ved direkte sekvensering. Alle tre konstruksjoner var identiske bortsett fra S342G- og I384M-aminosyresubstitusjonene i G1-isoformen og N388-Y389-delesjonen i G2-isoformen. Rekombinante ApoL1-isoformer ble uttrykt i bakterier og renset som beskrevet (8), bortsett fra at S200-kolonnebufferen inneholdt 0,03 prosent n dodecyl- -D-maltosid (DDM) (Millipore-Sigma). For alle sett med eksperimenter som sammenlignet isoformer, ble materialene forberedt samtidig under identiske forhold ved bruk av de samme reagensene. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt med BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) ved bruk av bovineserum albumin standard. For totalt protein som i figur 1 ble geler farget med Instant Blue (Expedeon Inc). Protein i S200-buffer ble hurtigfryst i flytende nitrogen og lagret ved –80 C. Alikvoter ble tint på is og fortynnet i S200-buffer før analyser.

Ionoforer

Valinomycin (Millipore Sigma) ble oppløst ved 50 mM inabsolutt etanol og fortynnet til 1 mM i absolutt etanol rett før bruk. Chloride Ionophore 1 (MilliporeSigma) ble oppløst ved 100 mM i 1-heksanol og fortynnet til 0,2 mM i absolutt etanol rett før bruk.

Membran vesikler

Asolectin (soyabønnefosfatidylkolin type II, Sigma) ble acetonekstrahert som beskrevet (30), tørket og deretter oppløst i kloroform og lagret ved –20 C. En alikvot av fosfolipider i kloroform ble tørket under en strøm av nitrogen og suspendert ved 20 mg/ml i 200 mM KCl, 5 mM HEPES pH 8,0 ved fem fryse-tine-sykluser og kraftig vortexing. Denne suspensjonen ble lagret ved –20 grader. For å generere KCl-belastede unilamellære vesikler med ca. 200 nm diameter, ble lipidsuspensjonen ført 15 ganger gjennom et 200 nm porepolykarbonatmembranfilter ved bruk av et ekstruderkammer (Avanti Polar Lipids) og protokollen gitt av produsenten (17, 18). Ekstruderte vesikler ble holdt på is og brukt innen 24 timer.

Aktivitetsanalyser

Ionepermeaseaktivitetsanalyser ved bruk av membranpotensialdrevet KCl-utstrømning detektert med en kloridselektiv elektrode ble utført som tidligere beskrevet (9). Tjue mikroliter ApoL1 i S200 buffer (15{{20}} mM NaCl, 10 mM Tris pH8,3, 0,3 prosent DDM) tilsettes til 380 ul reaksjonsblanding bestående av 82 mM KCl, 127 mM sukrose, 42,1 mM buffer ved angitt pH (MES for pH 5–6,5, HEPES for pH 7,0–8,0), 2,63 mMCa(glukonat)2 og 1,84 mg/ml ekstrudert vesikler. Blandingen inkuberes ved romtemperatur i 4 minutter før passasje gjennom en 3 ml Bio-Gel P-6DG (Bio-Rad) spinkolonne ekvilibrert i 330 mM sukrose. Eluatet tilsettes umiddelbart til 2 ml 330 mM sukrose, 10-5 M KCl, 2,5 mM Ca(glukonat)2 og 10 mM buffer (MES for pH 5–6,5; HEPES for pH 7–8) som angitt, med kontinuerlig overvåking med en kloridselektiv elektrode og registrert som beskrevet. Etter 20 s ble spenningsdrevet effluks initiert ved tilsetning av en ionofor (2,5 ul av enten 1 mM valinomycin eller 0,2 mMCloride Ionophore 1 i etanol) og fikk fortsette i 30 s etterfulgt av tilsetning av Triton X-100 til 0,1 prosent for å frigjøre gjenværende intravesikulært klorid. Rådata i mV ble konvertert til Cl-konsentrasjon ved bruk av en standardkurve generert for elektroden under analysens betingelser. Innledende fraksjonshastigheter av kloridfrigjøring ble avledet fra 3 s under maksimal umiddelbar respons på tilsetning av ionofor.

Alle aktivitetssammenligninger ble utført ved bruk av materiale fra samtidige preparater av de tre isoformene som hadde blitt fortynnet til 100 ug/ml protein i S200-buffer før analysen. Alle analyser brukt for direkte sammenligning mellom variantene ble utført på samme dag ved bruk av de samme ferske reagensene.

Membranassosiasjonsanalyse

Membranassosiasjonsanalyser ble utført separat under betingelser optimale for Cl-permeaseaktiviteten og for K-permeaseaktiviteten. For tilstander som støtter Clpermease-aktivitet, 5 ul av 100 ug/ml protein i 1{{30}} mM Tris pH8.2, 150 mM NaCl , 0,03 prosent DDM ble tilsatt til 95 ul reaksjonsblanding (3,4 mg/ml isolektinvesikler (lastet med 200 mM KCl, 5 mM HEPES pH 8), 20 mM MES pH 5,0, 2,5 mM Ca(glukonat) 2, 100 mM KCl, 100 mM sukrose) og inkubert ved romtemperatur i 1 min. Protein-til-lipid-forholdet i analysen er 1:680 masse/masse. Prøven ble fortynnet uten pH-forskyvning ved tilsetning av 200 ul 60 mM MES pH 5,0, 2,5 mMCa(glukonat)2, 100 mM KCl, 100 mM sukrose og inkubert i 20 s. Ett hundre mikroliter 8 M urea ble tilsatt, blandet og deretter inkubert ved romtemperatur i 15 min. Sukrosekonsentrasjonen ble brakt til 40 prosent ved tilsetning av 1,6 ml 50 prosent sukrose. Prøven på 2 ml ble lagt under 1 ml 30 prosent sukrose i 8 mM MES pH 5,0, som igjen var under 1,7 ml sukrosefri 8 mM MES pH 5,0. De bratte gradientene ble sentrifugert ved 200,000g i en Beckman Coulter TLA-110rotor i 90 minutter ved 4 C. Vesiklene ble samlet fra 0 til 30 prosent sukrosegrensesnitt. Like fraksjoner av prøver ble fortynnet 4 ganger og sentrifugert ved 100,000g i 1 time. Membranpelletene ble tørket, separert med SDS-PAGE, blottet til polyvinylidenfluoridmembran og probet ved westernblotting med antistoff mot T7-epitopen (MilliporeSigmaproduktnr. 69522-3) med kjemiluminescensdeteksjon ved bruk av et digitalt bildesystem. Seriefortynninger av renset protein ble inkludert på gelen for å generere en isotype og blot-spesifikk standardkurve for hvert protein.

For tilstander som støtter K-permease-aktivitet, ble 5 ul av 100ug/ml protein i 10 mM Tris pH 8,2, 150 mM NaCl, 0,03 prosent DDM tilsatt til 95 ul av reaksjonsblanding (3,4 ug/ml isolektinvesikler (lastet med 200 mM KCl, 5 mM HEPES pH 8), 20 mM MES pH 6,0, 2,5 mM Ca(glukonat)2, 100 mM KCl, 100 mM sukrose) og inkubert ved romtemperatur i 1 min. Prøven ble fortynnet med pH-skift til 7,5 ved tilsetning av 200 ul 60 mM HEPES pH 8,0, 2,5 mM Ca(glukonat) 2100 mM KCl, 100 mM sukrose og inkubert i 20 s. Etthundre mikroliter av 500 mM Na2CO3 ble tilsatt og inkubert ved romtemperatur i 15 minutter. Sukrosekonsentrasjonen ble brakt til 40 % ved tilsetning av 1,6 ml 50 % sukrose. Prøven på 2 ml ble lagt under 1 ml 30 prosent sukrose i 8 mM Tris pH 8,3, som igjen var under 1,7 ml sukrosefri 8 mM Tris pH 8,3. Sukroseputer ble sentrifugert og en prøve ble samlet og behandlet som ovenfor.

Statistikk

Betydningen av forskjeller mellom gjennomsnittspar innenfor datasett ble bestemt ved bruk av variansanalyse (ANOVA)(19). Statistiske parametere ble bestemt ved hjelp av en funksjon innebygd i Excel. P-verdier ble beregnet ved å bruke socscistatistics.com. Alle datapunkter presenteres som gjennomsnitt ± standardavvik (SD), bestemt med STDEV.S-funksjonen til Excel for hver enkelt gruppe replikaer.

DatatilgjengelighetAlle data som støtter denne artikkelen vil bli delt på forespørsel til Dr. John C. Edwards, john.edwards@health.slu.edu.

Cistanche kan behandlenyresykdom

Anerkjennelser—Vi takker avdelingen for nefrologi og avdelingen for indremedisin ved Saint Louis University for støtten som er nødvendig for å utføre dette arbeidet.

Forfatterbidrag—JCE unnfanget og overvåket studien, sikret finansiering, utførte utstrømningsanalysene, tolket data og skrev papiret; JB renset proteinene, utførte membranassosiasjonsanalysene, tolket data, forberedte figurene og redigerte papiret.

Finansiering og tilleggsinformasjon– Arbeidet ble finansiert av institusjonelle ressurser ved Saint Louis University og av NationalInstitutes of Health-stipend R01 DK120651 til JCE. Innholdet i denne artikkelen er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health.

Interessekonflikt—Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikt med innholdet i denne artikkelen.

Forkortelser—Forkortelsene som brukes er: ApoL1, apolipoproteinL1; C11, kloridionofor 1; DDM, n-dodecyl- -D-maltosid;PVDF, polyvinylidenfluorid; SD, standardavvik; Val, valinomycin.

Fra: 'Nyre-sykdom-assosierte varianter av Apolipoprotein L1 viser funksjonsøkning i kationkanalaktivitet' avJonathan Bruno og John C. Edwards

---J. Biol. Chem. (2021) 296 100238

Referanser

1. Genovese, G., Friedman, DJ, Ross, MD, Lecordier, L., Uzureau, P., Freedman, BI, Bowden, DW, Langefeld, CD, Oleksyk, TK, Uscinski Knob, AL, Bernhardy, AJ, Hicks, PJ, Nelson, GW, Vanhollebeke, B., Winkler, CA, et al. (2010) Association of trypanolytic ApoL1 variants withnyresykdomhos afroamerikanere. Science 329, 841–845
2. Parsa, A., Kao, WH, Xie, D., Astor, BC, Li, M., Hsu, CY, Feldman, HI, Parekh, RS, Kusek, JW, Greene, TH, Fink, JC, Anderson AH, Choi, MJ, Wright, JT, Jr., Lash, JP, et al. (2013) APOL1 risikovarianter, rase og progresjon av kroniskenyresykdom. N. Engl. J. Med. 369, 2183–2196
3. Friedman, DJ, og Pollak, MR (2020) APOL1 ognyresykdom: Fra genetikk til biologi. Annu. Rev. Physiol. 82, 323–342
4. Bruggeman, LA, O'Toole, JF og Sedor, JR (2017) Identifisering av den intracellulære funksjonen til APOL1. J. Am. Soc. Nephrol. 28, 1008–1011
5. Kopp, JB, Roshanravan, H. og Okamoto, K. (2018) Apolipoprotein L1 nephropathies: 2017 in review. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 27, 153–158
6. Perez-Morga, D., Vanhollebeke, B., Paturiaux-Hanocq, F., Nolan, DP, Lins, L., Homble, F., Vanhamme, L., Tebabi, P., Pays, A., Poelvoorde, P., Jacquet, A., Brasseur, R., og Pays, E. (2005) Apolipoprotein LI fremmer trypanosomlyse ved å danne porer i lysosomale membraner. Science 309, 469–472
7. Harrington, JM, Howell, S., og Hajduk, SL (2009) Membranpermeabilisering av trypanosom lytisk faktor, et cytolytisk humant lipoprotein med høy tetthet. J. Biol. Chem. 284, 13505–13512
8. Thomson, R., og Finkelstein, A. (2015) Human trypanolytisk faktor APOL1 danner pH-styrte kationselektive kanaler i plane lipid-dobbeltlag: Relevans for trypanosomlysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 112, 2894–2899
9. Bruno, J., Pozzi, N., Oliva, J., og Edwards, JC (2017) Apolipoprotein L1 gir fosfolipidvesikler pH-svitsjbar ionepermeabilitet. J. Biol. Chem. 292, 18344–18353
10. Vanhollebeke, B., og Pays, E. (2006) Funksjonen til apolipoproteiner L. Cell Mol. Life Sci. 63, 1937–1944
11. Olabisi, OA, Zhang, JY, Verplank, L., Zahler, N., DiBartolo, S., 3., Heneghan, JF, Schlondorff, JS, Suh, JH, Yan, P., Alper, SL, Friedman, DJ og Pollak, MR (2016) APOL1nyresykdomrisikovarianter forårsaker cytotoksisitet ved å tappe cellulært kalium og indusere
stressaktiverte proteinkinaser. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 113, 830–837
12. O'Toole, JF, Schilling, W., Kunze, D., Madhavan, SM, Konieczkowski, M., Gu, Y., Luo, L., Wu, Z., Bruggeman, LA, og Sedor, JR. (2018) ApoL1-overuttrykk driver variantuavhengig cytotoksisitet. J. Am. Soc. Nephrol. 29, 869–879
13. Shah, SS, Lannon, H., Dias, L., Zhang, JY, Alper, SL, Pollak, MR og Friedman, DJ (2019) APOL1nyrerisikovarianter induserer celledød via mitokondriell translokasjon og åpning av overgangsporen for mitokondriell permeabilitet. J. Am. Soc. Nephrol. 30, 2355–2368
14. Hayek, SS, Koh, KH, Grams, ME, Wei, C., Ko, YA, Li, J., Samelko, B., Lee, H., Dande, RR, Lee, HW, Hahm, E. , Peev, V., Tracy, M., Tardi, NJ, Gupta, V., et al. (2017) Et tredelt kompleks av suPAR, APOL1 risikovarianter og alphavbeta3 integrin på podocytter medierer kronisknyre sykdom. Nat. Med. 23, 945–953
15. Ma, L., Chou, JW, Snipes, JA, Bharadwaj, MS, Craddock, AL, Cheng, D., Weckerle, A., Petrovic, S., Hicks, PJ, Hemal, AK, Hawkins, GA, Miller, LD, Molina, AJ, Langefeld, CD, Murea, M., et al. (2017) APOL1 nyrerisikovarianter induserer mitokondriell dysfunksjon. J. Am. Soc. Nephrol. 28, 1093-1105
16. Wan, G., Zhaorigetu, S., Liu, Z., Kaini, R., Jiang, Z., og Hu, CA (2008) Apolipoprotein L1, et nytt Bcl-2 homologidomene {{4 }}kun lipidbindende protein, induserer autofagisk celledød. J. Biol. Chem. 283, 21540–21549
17. Hope, MJ, Bally, MB, Webb, G. og Cullis, PR (1985) Produksjon av store unilamellære vesikler ved en hurtig ekstruderingsprosedyre: Karakterisering av størrelsesfordeling, fanget volum og evne til å opprettholde et membranpotensial. Biochim. Biofys. Acta 812, 55–65
18. Olson, F., Hunt, CA, Szoka, FC, Vail, WJ og Papahadjopoulos, D. (1979) Fremstilling av liposomer med definert størrelsesfordeling ved ekstrudering gjennom polykarbonatmembraner. Biochim. Biofys. Acta 557, 9–23
19. Armitage, P. (1971) Statistical Methods in Medical Research, Blackwell Scientific Publications, Oxford, Storbritannia