Abstrakt

Det planteavledede toksinet aristolochic acid (AA) er årsaken til urte-nefropati og Balkan-nefropati. Høydose AA-inntak kan forårsake akutt nyreskade, mens kronisk lavdose AA-inntak kan føre til progressiv nyresykdom. Inntatt AA tas opp av renale tubulære epitelceller, noe som fører til DNA-skade og celledød. Procyclin D (CypD) er involvert i mitokondrieavhengig celledød, men hvorvidt denne mekanismen spiller en rolle ved akutt eller kronisk AA-indusert nyreskade er uklart. Vi tok opp dette spørsmålet ved å utsette CypD-/- og villtype (WT) mus for akutt høydose eller kronisk lavdose AA. 5 mg/kg AA-sondesonde i 3 dager i WT-mus induserte akutt nyreskade som bevist ved tap av nyrefunksjon, tubulær celleskade og død, og nøytrofil infiltrasjon. Alle disse parameterne ble betydelig redusert i CypD-/- mus. kronisk lavdose (2 mg/kg AA) administrering i WT-mus resulterte i kronisk nyresykdom med nedsatt nyrefunksjon og nyrefibrose etter 28 dager. CypD-/- mus ble imidlertid ikke beskyttet mot AA-indusert kronisk nyresykdom. Avslutningsvis fremmer CypD AA-indusert akutt nyreskade, men CypD fremmer ikke overgangen fra akutt nyreskade til kronisk nyresykdom under vedvarende AA-eksponering.

Nøkkelord

akutt nyreskade; aristolochic syre; celledød; Kronisk nyre sykdom; cyklofilin D; betennelse; nyrefibrose;Cistanche tubulosa

Klikk her for å kjøpeCistanche ekstrakt

Introduksjon

Aristolochic acid (AA) er en nitrofenantrenkarboksylsyre som finnes i familien Aristolochiaceae, som inkluderer nesten 500 plantearter.AA består hovedsakelig av en blanding av to metabolitter, 8-metoksy-6-nekrofil-(3) ,4-d)-1,3-deoksy-5-karboksylsyre (AAI) og 6-nekrofil-(3,4-d){{ 13}},3-deoksy-5-karboksylsyre (AAII) [1]. Undersøkelser av endemisk nyresykdom på Balkan identifiserte AA som nefrotoksinet som er ansvarlig for denne miljørelaterte sykdommen [2]. Aristolochia-arter som vokser i åkre med kornavlinger i regionen forurenser bakemel, og langsiktig forbruk av AA forårsaker kronisk nyresykdom, nyrestein og blærekreft [1]. Aristolochia spp. brukes også til fremstilling av ulike urtemedisiner der AA har blitt identifisert som et forårsakende toksin ved urte-nefropati [3]. I en studie av 300 pasienter med urte-nefropati var akutt nyreskade og langsommere progredierende kronisk nyresykdom assosiert med henholdsvis høyt eller lavt nivå av AA-inntak [4]. Identifikasjon av AA som et vanlig toksin i disse sykdommene fører til begrepet aristolochic acid nefropati (AAN). Det finnes ingen behandling for AAN, så det er avgjørende å forstå mekanismene som AA induserer akutt og kronisk nyreskade med.

Renale tubulære epitelceller er svært følsomme for AA-toksisitet fordi de uttrykker det organiske aniontransporterproteinet OAT1/3, som effektivt er i stand til å ta opp AA i cellene [5]. Intracellulært reagerer AA med DNA-baser for å produsere DNA-addukter som kan føre til en: T → T: en transformasjon, som resulterer i DNA-skade og muligens kreftutvikling [1]. I tillegg induserer AA døden av dyrkede tubulære epitelceller ved å indusere høye nivåer av reaktive oksygenarter (ROS) [6]. Både mus og rotter er følsomme for de toksiske effektene av AA, og derfor kan mekanismen for AA-indusert nefrotoksisitet undersøkes in vivo. En enkelt høy dose av AA-indusert akutt nyresvikt med tubulær nekrose hos dyr, mens gjentatte lave doser av AA-indusert kronisk nyresykdom med tubulær atrofi og fibrose [7,8].

Procykliner er en gruppe mye uttrykte enzymer med peptidyl cis-trans isomerase (PPIase) aktivitet som er involvert i proteinfolding. Cyclophilin D (CypD), også kjent som Peptidylprolyl Isomerase F (PPIF), er en komponent i mitokondriell membranpermeabilitetsovergangspore (mPTP). Etter celleskade åpnes mPTP på grunn av overflødig ROS eller andre stressfaktorer, noe som fører til frigjøring av cytokrom c inn i cytoplasmaet og påfølgende celledød [9]. CypD-gendelesjonsmus er fenotypisk normale, men CypD-/- mus er resistente mot nyreiskemi/reperfusjonsskade eller cisplatin-toksisitet-indusert tubulær nekrose og akutt nyresvikt [10-13]. I tillegg er CypD-/- mus beskyttet mot den unilaterale ureteral obstruksjon (UUO) modellen for nyrefibrose [14]. Det er imidlertid ikke klart om CypD spiller en rolle i AA-indusert TEC-skade. I denne studien undersøkte vi rollen til CypD i høydose AA-indusert akutt nyreskade og kronisk lavdose AA-indusert nyrefibrose.

Urte Cistanche

Resultater

Cyclophilin D-sletting beskytter mot aristolochic syre-indusert akutt nyreskade

Plasmakreatininnivåer i sunne villtype (WT) C57BL6/J mus varierte fra 8 til 16 μ mol/L. Administrering av 5 mg/kg AA til WT-mus resulterte i en akutt reduksjon i nyrefunksjonen på dag 3, definert som en 3- ganger økning i plasmakreatininnivåer (område 30 til 53 μ mol/L). Sammenlignet med WT-kontrollmus ble tubulære epitelceller fra WT-mus betydelig og histologisk skadet på dag 3 etter AA-administrasjon. Den apikale børstekanten gikk tapt, celler var hovne, kjerner ble tapt, celler ble kastet inn i det rørformede lumen, og det ble dannet gips i det rørformede lumen. Tubulær nekrose var synlig under høy forstørrelse. Vi vurderte også celledød ved farging for spaltet caspase 3. WT-kontrollmus manglet spaltet caspase 3-farging, men på dag 3 etter AA-administrasjon viste et stort antall tubulære epitelceller spaltede caspase 3-farginger. I samsvar med disse histologiske egenskapene til celleskade og celledød, var mRNA-nivåer av den tubulære skademarkøren Kim1 betydelig forhøyet, mens mRNA-nivåer av det beskyttende proteinet -Klotho ble betydelig redusert.

Nyrestrukturen og funksjonen var normal i CypD-gendelesjon (CypD-/-) mus. En enkelt administrering av 5 mg/kg AA beskyttet CypD-/- mus betydelig mot akutt nyreskade. Selv om plasmakreatininnivåer var mildt forhøyet hos 5/10 CypD-/- mus, var gjennomsnittlige plasmakreatininnivåer signifikant lavere enn i WT AA-gruppen og ikke signifikant forskjellig fra de for CypD-/- som ikke ble behandlet med AA. Et lignende bilde var tydelig i analysen av renal tubulær skade, med CypD-/- dag 3 AA-gruppen som viste signifikante reduksjoner i histologisk tubulær skade, spaltede caspase-3-fargede celletall og Kim1 mRNA-nivåer, samt en betydelig beskyttelse mot reduserte -Klotho mRNA-nivåer.

Cyclophilin D-sletting beskytter mot akutt aristolochic syre-indusert leukocyttinfiltrasjon

Nøytrofiler var stort sett fraværende i nyrene til WT- og CypD-/- kontrollgruppene. Imidlertid var et stort antall Ly6G pluss nøytrofile infiltrater tydelig i området med tubulær skade i WT-mus på dag 3 etter AA-administrasjon. nøytrofilinfiltrasjon ble betydelig redusert i CypD-/-a-gruppen. I motsetning til nøytrofiler var det et stort antall residente F4/80 pluss makrofager i WT og CypD-/- kontrollnyrer. Selv om makrofager ble økt i området med tubulær skade, nådde de ikke statistisk signifikans verken i WT AA-gruppen eller CypD-/- AA-gruppen. t-celler var stort sett fraværende i WT- og CypD-/- kontrollnyrene. Et lite, men signifikant T-celle-infiltrat ble sett i nyrene til både WT- og CypD-A-mus på dag 3 AA, selv om det ikke var noen forskjeller mellom WT- og CypD-/- mus.

Cyclophilin D-sletting beskytter ikke mot kronisk aristolochic syre-indusert nyresykdom

WT-mus som ble gitt 2 mg/kg AA hver 2. dag i 28 dager resulterte i kronisk nyresykdom med en 2.6- ganger økning i plasmakreatininnivåer. Histologisk undersøkelse avslørte fremtredende tubulær atrofi og dilatasjon, delvis tubulær gipsdannelse og i hovedsak normale glomeruli. dag 28 AA av WT viste ikke signifikant tubulær nekrose, men det var signifikant lysis av et stort antall caspase 3-fargede celler (sannsynligvis apoptotiske celler), selv om dette ble redusert med 66 prosent sammenlignet med dag 3 av WT AA (P < 0.001). Kim1-mRNA-nivåene økte og a-Klotho-mRNA-nivåene reduserte i WT AA-gruppen på dag 28; disse endringene var større enn i WT AA-gruppen på dag 3 (;p < 0,001). CypD-/- mus ble ikke beskyttet mot kronisk AA-indusert nyresykdom. De viste plasmakreatininnivåer, histologisk skade, Kiml- og a-Klotho-mRNA-nivåer, og en rekke spaltede caspase-3-fargede celler som kan sammenlignes med dag 28 AA WT-mus.

Cyclophilin D-sletting beskytter ikke mot kronisk aristolochic syre-indusert nyrefibrose

Interstitiell fibrose er et kjennetegn på kronisk nyresykdom og er preget av kollagenavsetning, aggregering av -SMA pluss myofibroblaster, makrofaginfiltrasjon og tap av peritubulære kapillærer [15]. Sammenlignet med WT og CypD-/- kontrollnyrer, hvor type IV kollagen var lokalisert til de glomerulære og tubulære basalmembranene (så vel som karveggen), var diffus type IV kollagenavsetning økt i den interstitielle regionen til 28- dag AA WT mus. En 2- ganger økning i interstitiell type IV kollagenavsetning var assosiert med en signifikant økning i nyre type I kollagen mRNA-nivåer. en 3.5- ganger økning i A - SMA mRNA-nivåer ble sett med en signifikant akkumulering av myofibroblaster. I WT-mus var det også signifikant makrofaginfiltrasjon på dag 28 AA, som bevist av forhøyede nivåer av CD68 mRNA og signifikant forhøyet ekspresjon av CD206 - en alternativt aktivert makrofagmarkør assosiert med fremme av nyrefibrose [15]. I tillegg viste AA WT-mus et signifikant fravær av CD31 pluss peritubulære kapillærer på dag 28 sammenlignet med WT-kontrollmus.

Urte Cistanche

Diskusjon

Tubulær nekrose er et trekk ved akutt nyreskade når giftige kjemikalier, slik som legemidler (f.eks. cisplatin, vancomycin, gentamicin og mucin) og fytonefrotoksiner (f.eks. aristolochic acid og Cynarin) fortrinnsvis tas opp av renale tubulære epitelceller [16] . Et vanlig trekk ved denne toksininduserte tubulære celledøden er mitokondriell skade. For eksempel, i tillegg til å forårsake DNA-skade, er akutt nyreskade indusert av høye doser cisplatin eller aa direkte assosiert med alvorlig mitokondriell skade i renale tubulære epitelceller [17,18].

CypD spiller en viktig rolle i toksinindusert mitokondrieavhengig celledød gjennom åpningen av mPTP [9]. Denne studien viser for første gang at CypD er nødvendig ved høydose aa-indusert tubulær epitelcelledød og akutt nyreskade. Denne konklusjonen er basert på CypD-/- mus som viser betydelig bedre nyrefunksjon, redusert tubulær vevsskade og tubulær celledød (som vist ved spaltet caspase 3-farging), redusert ekspresjon av den tubulære skademarkøren Kim-1, og en beskyttende effekt mot tap av a-Klotho uttrykk. Disse funnene stemmer overens med tidligere in vitro-studier om at AA induserer tubulær epitelcelledød via induksjon av mitokondrier-avledede reaktive oksygenarter [19] og at CypD er nødvendig for reaktive oksygenarter-indusert celledød i dyrkede tubulære epitelceller [14]. Videre, i den akutte AA-modellen, ble akkumuleringen av nøytrofiler betydelig redusert i CypD-/- mus. Lite er kjent om funksjonen til CypD i nøytrofiler; reduksjonen i nøytrofilinfiltrasjon kan imidlertid bare være en indirekte effekt av redusert tubulær celleskade og celledød, der en redusert frigjøring av risikorelaterte molekylære mønstre fører til redusert nøytrofilrekruttering.10 Selv om nøytrofiler fremmer en "andre bølge" av tubulære mønstre. celledød i modeller av nyreiskemi/reperfusjonsskade "[20-22], rollen til nøytrofile selv i akutt AA-indusert akutt nyreskade er ikke bestemt. Det var også en liten, men signifikant infiltrasjon av T-celler på dagen 3 av AA, men det var ingen forskjeller mellom WT og CypD-/- mus.Det var ingen signifikant forskjell i antall nyremakrofager på dag 3 av AA-modellen sammenlignet med kontroller.

CypD-/- mus er beskyttet mot høydose AA-indusert akutt nyreskade, noe som samsvarer med studier som viser at CypD-/- mus er beskyttet mot tubulær epitelcelledød og tap av nyrefunksjon etter cisplatin eller nyreiskemi/reperfusjonsskade ( IRI) [10-12], og at behandling med procyklidinhemmere beskytter mot IRI-indusert akutt nyreskade [23].

Etter å ha bestemt at CypD-/- mus er beskyttet mot høydose AA-indusert akutt nyreskade, antok vi at disse musene også ville være beskyttet mot langvarig eksponering for lavdose AA-indusert tubulær celledød og progressiv nyresykdom. Dette var imidlertid ikke tilfelle, og CypD-/- mus viste nivåer av tubulær celleskade (basert på Kim-1 og -Klotho), nyresvikt og nyrefibrose etter kronisk lavdose AA-administrasjon som ikke skiller seg fra WT-mus.

Det kan være flere årsaker til manglende beskyttelse hos CypD-/- mus under kronisk lavdose AA eksponering. Histologisk analyse viste tubulær nekrose i den akutte høydose AA-modellen, men ikke i den kroniske lavdose AA-modellen etter 28 dager, da skade var tydelig i form av atrofi og apoptotisk celledød (som vist ved lysis caspase 3-farging) . Dette antyder at høydose AA induserer tubulær nekrose, men ikke lavdose AA. Dette kan skyldes forskjeller i induksjon av reaktive oksygenarter indusert av lav- og høydose AA, eller at overlevende tubulære celler er resistente mot AA-indusert nekrose. Ytterligere detaljerte studier er nødvendig for å isolere disse mulige mekanismene eller for å identifisere en annen potensiell forklaring, for eksempel tubulær celleskade forårsaket av akkumulert DNA-skade i en kronisk AA-eksponeringsmodell. Imidlertid er det klart at CypD-gensletting ikke beskytter tubuli mot gjentatt skade ved lave doser av AA. Faktisk ble lignende funn funnet i disse akutte og kroniske AA-eksponeringsmodellene [24] ved bruk av JUN amino-terminal kinase (JNK)-hemmere. både JNK og CypD er involvert i ROS-indusert, mitokondrieavhengig tubuluscelledød [14,24]. jNK-hemmerbehandling hemmer tubuluscelledød i akutte høydose AA-modeller, men i kroniske lavdose AA-modeller [24] hadde ingen effekt på tubulær celledød eller utvikling av nyrefibrose.

Cistanche supplement

Den spesifikke rollen til CypD i nyrefibrose er beskrevet i tre tidligere studier. I modellen med unilateral ureteral obstruksjon (UUO) forhindret systemisk administrering av procyklidinhemmere eller bruk av CypD-/- mus tubulær celledød, myofibroblastakkumulering, kollagenavsetning og peritubulært kapillærtap [14,23]. Imidlertid skilte ikke dyrkede WT- og CypD-/- nyrefibroblaster seg i PDG-indusert celleproliferasjon og TGF- 1-indusert aktivering og kollagenproduksjon [14], noe som tyder på at CypD ikke direkte påvirker kollagenproduserende myofibroblaster i utviklingen av nyrefibrose. I UUO-modellen ble således den beskyttende effekten av CypD-/- på nyrefibrose hos mus tilskrevet en reduksjon i tubulær epitelcelledød og tap av peritubulære kapillærer [14]. I motsetning til dette fant en annen studie at CypD-/- mus viste mer alvorlig glomerulosklerose i en streptozotocin-indusert type 1 diabetisk nefropatimodell, mens behandling med en procyclidinhemmer ikke klarte å endre utviklingen av glomerulosklerose i en DB/DB-modell av type 2-diabetiker nefropati [25]. Den nåværende studien fant at CypD-mangel ikke hadde noen effekt på utviklingen av nyrefibrose i en kronisk lavdose-AA-eksponeringsmodell, heller ikke på tubulær epitelcelledød eller peritubulært kapillærtap. Disse komparative resultatene i tre forskjellige sykdomsmodeller antyder at rollen til CypD i utviklingen av nyrefibrose er svært avhengig av arten av den underliggende nyreskaden og kanskje ikke er av generell betydning for nyrefibrose.

Konklusjoner

Denne studien bekrefter involveringen av CypD i akutt tubulær nekrose og akutt nyreskade indusert av høydose AA-eksponering. I motsetning til dette bidrar ikke CypD til de toksiske effektene av kronisk lavdose-AA-eksponeringsindusert kronisk nyresykdom.

REFERANSER

1. Jadot, II; Declèves, A.-E.; Nortier, J.; Caron, N. Et integrert syn på Aristolochic Acid Nephropathy: Update of the Literature. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18, 297.

2. Debelle, FD; Vanherweghem, JL; Nortier, JL Aristolochic acid nefropati: Et verdensomspennende problem. Nyre Int. 2008, 74, 158–169.

3. Yang, B.; Xie, Y.; Guo, M.; Rosner, MH; Yang, H.; Ronco, C. Nefrotoksisitet og kinesisk urtemedisin. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 2018, 13, 1605–1611.

4. Yang, L.; Su, T.; Li, X.-M.; Wang, X.; Cai, S.-Q.; Meng, L.-Q.; Zou, W.-Z.; Wang, H.-Y. Aristolochic acid nefropati: Variasjon i presentasjon og prognose. Nephrol. Slå. Transplantasjon. 2011, 27, 292–298.

5. Bakhiya, N.; Arlt, VM; Bahn, A.; Burckhardt, G.; Phillips, D.; Glatt, H. Molekylær bevis for en involvering av organiske aniontransportører (OATs) i aristolochic acid nefropati. Toxicology 2009, 264, 74–79.

6. Yu, FY; Wu, TS; Chen, TW; Liu, BH Aristolochic acid I induserte oksidativ DNA-skade assosiert med glutationutarming og ERK1/2-aktivering i humane celler. Toxicol. In Vitro 2011, 25, 810–816.

7. Zhou, L.; Fu, P.; Huang, XR; Liu, F.; Chung, ACK; Lai, KN; Lan, HY Mekanisme for kronisk aristolochic acid nefropati: Rolle til Smad3. Er. J. Physiol. Physiol. 2010, 298, F1006–F1017.

8. Zhou, L.; Fu, P.; Huang, XR; Liu, F.; Lai, KN; Lan, HY Aktivering av p53 fremmer nyreskade ved akutt aristolochic acid nefropati. J. Am. Soc. Nephrol. 2009, 21, 31–41.

9. Elrod, JW; Molkentin, JD Fysiologiske funksjoner av cyklofilin D og mitokondriell permeabilitetsovergangspore. Circ. J. 2013, 77, 1111–1122.

10. Devalaraja-Narashimha, K.; Diener, AM; Padanilam, BJ Cyclophilin D-genablasjon beskytter mus mot iskemisk nyreskade. Er. J. Physiol. Physiol. 2009, 297, F749–F759.

11. Jang, H.-S.; Nei, M.; Jung, E.-M.; Kim, W.-Y.; Southekal, S.; Guda, C.; Foster, KW; Oupicky, D.; Ferrer, FA; Padanilam, BJ Proksimal tubuli cyclophilin D regulerer fettsyreoksidasjon ved cisplatin-indusert akutt nyreskade. Nyre Int. 2020, 97, 327–339.

12. Linkermann, A.; Bräsen, JH; Darding, M.; Jin, MK; Sanz, AB; Heller, J.-O.; De Zen, F.; Weinlich, R.; Ortiz, A.; Walczak, H.; et al. To uavhengige veier for regulert nekrose medierer iskemi-reperfusjonsskade. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2013, 110, 12024–12029.

13. Park, JS; Pasupulati, R.; Feldkamp, ​​T.; Roeser, NF; Weinberg, JM Cyclophilin D og mitokondriell permeabilitetsovergang i nyreproksimale tubuli etter hypoksisk og iskemisk skade. Er. J. Physiol. Physiol. 2011, 301, F134–F150.

14. Hou, W.; Leong, KG; Ozols, E.; Tesch, GH; Nikolic-Paterson, DJ; Ma, FY Cyclophilin D fremmer tubulær celleskade og utvikling av interstitiell fibrose i den obstruerte nyren. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 2017, 45, 250–260.

15. Tang, PMK; Nikolic-Paterson, DJ; Lan, H.-Y. Makrofager: Allsidige spillere innen nyrebetennelse og fifibrose. Nat. Rev. Nephrol. 2019, 15, 144–158.

16. Petejova, N.; Martinek, A.; Zadrazil, J.; Teplan, V. Akutt giftig nyreskade. Ren. Mislykket. 2019, 41, 576–594.

17. Jiang, Z.; Bao, Q.; Sun, L.; Huang, X.; Wang, T.; Zhang, S.; Li, H.; Zhang, L. Mulig rolle mtDNA-utarming og respiratoriske kjededefekter i aristolochic acid I-indusert akutt nefrotoksisitet. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2013, 266, 198–203.

18. Yang, Y.; Liu, H.; Liu, F.; Dong, Z. Mitokondriell dysregulering og beskyttelse ved cisplatin nefrotoksisitet. Arch. Toxicol. 2014, 88, 1249–1256.

19. Huang, X.; Wu, J.; Liu, X.; Wu, H.; Fan, J.; Yang, X. Den beskyttende rollen til Nrf2 mot aristolochic syre-indusert renal tubulær epitelcelleskade. Toxicol. Mech. Metoder 2020, 30, 580–589.

20. Klausner, JM; Paterson, IS; Goldman, G.; Kobzik, L.; Rodzen, C.; Lawrence, R.; Valeri, CR; Shepro, D.; Hechtman, HB Postiskemisk nyreskade er mediert av nøytrofiler og leukotriener. Er. J. Physiol. Physiol. 1989, 256, F794–F802.

21. Ryan, J.; Kanellis, J.; Blease, K.; Ma, FY; Nikolic-Paterson, DJ Milttyrosinkinasesignalering fremmer rekruttering av myeloidceller og nyreskade etter nyreiskemi/reperfusjonsskade. Er. J. Pathol. 2016, 186, 2032–2042.

22. Singbartl, K.; Ley, K. Beskyttelse mot iskemi-reperfusjon indusert alvorlig akutt nyresvikt ved å blokkere E-selektin. Crit. Care Med. 2000, 28, 2507–2514.

23. Leong, KG; Ozols, E.; Kanellis, J.; Badal, SS; Liles, JT; Nikolic-Paterson, DJ; Ma, FY Cyclophilin-hemming beskytter mot eksperimentell akutt nyreskade og nyre interstitiell fibrose. Int. J. Mol. Sci. 2020, 22, 271.

24. Yang, F.; Ozols, E.; Ma, FY; Leong, KG; Tesch, GH; Jiang, X.; Nikolic-Paterson, DJ c-Jun Aminoterminal kinasesignalering fremmer aristolochic syre-indusert akutt nyreskade. Front. Physiol. 2021, 12.

25. Lindblom, RS; Higgins, GC; Nguyen, T.-V.; Arnstein, M.; Henstridge, DC; Granata, C.; Snelson, M.; Thallas-Bonke, V.; Cooper, ME; Forbes, JM; et al. Avgrense en rolle for mitokondriell permeabilitetsovergang pore i diabetisk nyresykdom ved å målrette cyclophilin D. Clin. Sci. 2020, 134, 239–259.

Khai Gene Leong, Elyce Ozols, John Kanellis, Frank Y. Ma og David J. Nikolic-Paterson