Longitudinell immunprofilering avslører dominerende epitoper som medierer langsiktig humoral immunitet hos covid-19-konvalescente individer
Sep 12, 2023
Bakgrunn: Alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) er et høypatogent og smittsomt koronavirus som har forårsaket en global pandemi med 5,2 millioner omkomne til dags dato. Spørsmål angående serologiske trekk ved langvarig immunitet, spesielt dominante epitoper som medierer varige antistoffresponser etter SARS-CoV-2-infeksjon, gjenstår å bli belyst.
Objektiv: Vi hadde som mål å dissekere kinetikken og levetiden til immunresponser hos pasienter med koronavirussykdom 2019 (COVID-19), så vel som epitopene som er ansvarlige for vedvarende langsiktig humoral immunitet mot SARS-CoV-2.
Metoder: Vi vurderte SARS-CoV-2 immundynamikk opptil 180 til 220 dager etter sykdomsdebut hos 31 individer som hovedsakelig opplevde moderate symptomer på COVID-19, og utførte deretter en proteomomfattende profilering av dominante epitoper som er ansvarlige for vedvarende humorale immunresponser.
Resultater: Longitudinell analyse avslørte vedvarende SARS-CoV-2 piggproteinspesifikke antistoffer og nøytraliserende antistoffer hos COVID-19-pasienter, sammen med aktivering av cytokinproduksjon i tidlige stadier etter SARS-CoV-2-infeksjon. Svært reaktive epitoper som var i stand til å mediere langsiktige antistoffresponser ble vist å være lokalisert ved spike- og ORF1ab-proteinene. Nøkkelepitoper av SARS-CoV-2 piggproteinet ble kartlagt til det N-terminale domenet til S1-underenheten og S2-underenheten, med varierende grader av sekvenshomologi blant endemiske humane koronavirus og høy sekvensidentitet mellom de tidlige SARS- CoV-2 (Wuhan-Hu- 1) og aktuelle sirkulerende varianter.
cistanche supplement fordeler-hvordan styrke immunforsvaret
Konklusjon: SARS-CoV-2-infeksjon induserer vedvarende humoral immunitet hos COVID-19-konvalescente individer ved å målrette mot dominante epitoper lokalisert ved spike og ORF1ab-proteiner som medierer langsiktige immunresponser. Våre funn gir en vei for å hjelpe rasjonell vaksinedesign og diagnostisk utvikling. (J Allergy Clin Immunol 2022;149:1225-41.)
Nøkkelord:
SARS-CoV-2, COVID-19, langsiktig immunrespons, humoral immunitet, proteomomfattende peptidmikroarray, dominant epitop
Alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV- 2), det forårsakende patogenet til den pågående pandemien med koronavirussykdom 2019 (COVID-19), tilhører slekten Betacoronavirus, som inkluderer 2 andre kjente høypatogene mennesker koronavirus: det alvorlige akutte respiratoriske syndromet (SARS) og Midtøsten respiratorisk syndrom (MERS) koronavirus.1 Siden starten av det første registrerte tilfellet i slutten av desember 2019, har SARS-CoV-2-infeksjon resultert i mer enn 263 millioner bekreftede tilfeller og 5,2 millioner dødsfall over hele verden per november 2021, og påvirket 220 land og regioner på 5 kontinenter.2 Etter infeksjon spenner kliniske presentasjoner vidt, inkludert asymptomatiske infeksjoner, milde eller moderate symptomer, eller til og med livstruende alvorlig lungebetennelse.3 Til tross for tilgjengeligheten av flere typer vaksinetilnærminger, sliter mange land fortsatt med å inneholde nye bølger av infeksjoner, med virusvarianter som ser ut til å vise økt overførbarhet og motstand mot antivirale immunresponser. En effektiv humoral immunrespons mediert av nøytraliserende antistoffer bør ha en kraftig og uunnværlig adaptiv immunitet for å blokkere infeksjon og eliminere virale patogener. Etter SARS-CoV-2-infeksjon ble en høy rate (over 90 %) av robust serokonversjon blant infiserte individer observert 7 til 14 dager etter sykdomsdebut.4-6 Produksjonen av antigenspesifikk IgA, IgG, og IgM som gjenkjente spikeproteinet (S) og nukleokapsidproteinet (N) av SARS-CoV-2 var påviselig under sykdommens akutte fase og det tidlige stadiet av rekonvalesens.4,5,7 Størrelsen på nøytraliserende antistoffer så ut til å være assosiert med alder, symptomatisk infeksjon og sykdommens alvorlighetsgrad. Eldre pasienter og individer som viser alvorlige covid-19-symptomer har en tendens til å utvikle høyere nivåer av nøytraliserende antistoffer.4,8-10 Flere studier angående levetiden til antistoffresponser har vist at til tross for tap av serum/plasma-reaktivitet mot virus antigener og synkende nøytraliserende antistofftitere over tid i noen symptomatiske COVID-19-tilfeller, ble det observert et vedvarende nivå av total langsiktig humoral immunitet i opptil 8 til 12 måneder etter infeksjon hos COVID-19-konvalescente individer .10-13 Videre holdt antallet SARS-CoV-2-antigenspesifikke minne B-celler stabilt i minst 6 til 12 måneder,12,13 sammen med pågående seleksjon og akkumulering av B-cellekloner som uttrykker nøytraliserende antistoffer,12,14 som indikerer opprettholdelse av vedvarende humoral immunitet etter SARSCoV-2-infeksjon.
cistanche supplement fordeler-øke immunitet
Nøytraliserende antistoffer spiller en grunnleggende rolle i vertens forsvar mot virusinfeksjon. Et panel av svært potente monoklonale antistoffer av SARS-CoV-2 er identifisert,15-17 primært rettet mot epitoper lokalisert ved reseptorbindingsdomenet til S-proteinet som samles til trimerer på virionoverflaten og letter virusinntrengning og fusjon på å engasjere den angiotensin-konverterende enzym 2-reseptoren.18 Andre regioner av S-protein, inkludert det N-terminale domenet (NTD) til S1-underenheten og S2-underenheten, inneholder også immunogene epitoper som er i stand til å indusere nøytraliserende antistoffer.16 ,19,20 Foruten nøytralisering, kan antistoffer av SARS-CoV-2 gi beskyttelse in vivo via Fc-medierte effektorfunksjoner, slik som antistoffavhengig fagocytose utløst av naturlige drepeceller og antistoffavhengig cytotoksisitet av monocytter eller makrofager. 21,22 I tillegg til å bekjempe virusinfeksjoner, kan antistoffer generert ved naturlig infeksjon eller vaksinasjon lette viruspatogenesen, enten ved økt betennelsesaktivering eller økt virusinfeksjon gjennom antigen/antistoff-immunkompleksdannelse eller ved Fc-avhengige funksjoner,23-25 selv om den forsterkede virusinfeksjonen ikke er observert i sammenheng med SARS-CoV-2 in vivo. Disse divergerende rollene til antistoffresponser nødvendiggjør en systematisk karakterisering av SARSCoV-2-epitoper, så vel som egenskapene til langvarige antistoffer rettet mot nøytraliserende eller ikke-nøytraliserende epitoper. Til tross for nylig fremgang med hensyn til kinetikk og varighet av antistoffresponser etter SARS-CoV-2-infeksjon, er longitudinell analyse av fremtredende epitoper som opprettholder langsiktige humorale immunresponser fortsatt begrenset. Tidligere studier har profilert epitoper av antistoffrespons hos COVID-19-infiserte individer, hovedsakelig ved bruk av ELISA-baserte analyser, 26,27 fag- eller bakterievisningsbaserte tilnærminger,28-31 og mikroarray-baserte teknologier.30,{{ 38}} Flere immundominante epitoper av SARS-CoV-2 S-protein er identifisert; de hyppigst påviste områdene ble kartlagt nær eller spenner over fusjonspeptidet (FP) til S2-underenheten, den andre heptad-repetisjonen i S2-underenheten og på det C-terminale domenet til S1-underenheten.26,28-30, 32,33 I tillegg avslørte serologisk screening også epitoper lokalisert ved andre proteiner på tvers av SARS-CoV-2-proteomet, inkludert N-protein, membran-(M)-protein og ORF1ab, ORF3a og ORF7a.28-30, 34,35 Selv om tidligere studier har gitt viktig innsikt i antigene epitoper, har disse studiene i stor grad fokusert på epitopprofilering av COVID-19-pasienter i den tidlige rekonvalesensfasen. De eksakte epitopene som medierer holdbare SARS-CoV-2-spesifikke antistoffresponser samt dynamikken til epitopgjenkjenning gjenstår å bli belyst. Her, for å få en dypere forståelse av kinetikken og levetiden til humorale immunresponser hos COVID-19-pasienter, spesielt epitoper som er ansvarlige for vedvarende langsiktig immunitet mot SARS-CoV-2, utførte vi en omfattende longitudinell analyse av immunprofilering hos 31 COVID-19-pasienter opptil 180 til 220 dager etter symptomdebut. Basert på evalueringen av antigenbindende og nøytraliserende antistoffer samt serumcytokinnivåer, identifiserte vi videre et panel av epitoper lokalisert ved ORF1ab, S og N proteiner av SARSCoV-2 som medierer vedvarende humorale immunresponser ved bruk av et peptid mikroarray som omfatter hele proteomet til SARS-CoV-2. Resultatene våre kaster lys over egenskapene til langsiktig immunitet for å overvinne virusinfeksjon og vil bidra til å informere rasjonelt vaksinedesign og utvikling av forbedrede serologiske diagnostiske verktøy.
METODER
Studiedeltakere og prøvesamling
For å evaluere kinetikken til SARS-CoV-2-rettet immunrespons, ble det samlet inn 101 serumprøver fra 31 SARS-CoV-2-infiserte individer som ble innlagt på Nantong Third Hospital tilknyttet Nantong University (Nantong) , Kina) mellom januar og mars 2020. Alle pasienter ble diagnostisert med bekreftet SARS-CoV-2-infeksjon gjennom kvantitativ PCR-testing med revers transkripsjon; Sykdommens alvorlighetsgrad ble definert som mild til moderat (ikke alvorlig) eller alvorlig COVID-19 i henhold til versjon 7 av Diagnosis and Treatment Protocol for Novel Coronavirus Pneumonia utgitt av Folkerepublikken Kinas nasjonale helsekommisjon.36 Pasienter ble fulgt. opp langsgående i 4 til 8 måneder etter bedring etter akutt infeksjon. Blodprøver ble samlet i en langsgående måte fra 4 til 219 dager etter symptomdebut for 20 pasienter blant 31 studiedeltakere (median 4,5 prøver per individ, varierende fra 2 til 8), mens prøvetaking på ett tidspunkt ble utført for hver av studiene. andre 11 individer som var i en sen rekonvalesent sykdomsfase (dag 122 til 214 etter sykdomsdebut). Følgelig ble sera (n 5 20) fra alders- og kjønnstilpassede friske donorer også inkludert som kontrollgruppen. Ingen studiedeltakere hadde en dokumentert tidligere infeksjon med SARS eller MERS.
Studien ble godkjent av den etiske komiteen ved Nantong Third Hospital tilknyttet Nantong University (godkjenning EL2020006). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver av studiedeltakerne. Serum ble separert fra perifert blod i serumgelrør via sentrifugering, formet til alikvoter og lagret ved 2808C før bruk.
Cellelinjer
HEK293T- og Huh7-celler ble dyrket i Dulbecco-modifisert Eagle-medium (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass) supplert med 10 % varmeinaktivert føtalt bovint serum (Gibco), 100 U/mL penicillin (Gibco) og 100 mg/ ml streptomycin (Gibco) ved 378C med 5 % CO2.
cistanche fordeler for menn styrker immunforsvaret
Klikk her for å se Cistanche Enhance Immunity-produkter
【Be om mer】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Påvisning av IgG-antistoff ved ELISA
Nivåene av antigenbindende IgG-antistoffer i humane serumprøver ble bestemt ved ELISA. Nittiseks-brønns ELISA-plater (Corning, Corning, NY) ble forhåndsbelagt med SARS-CoV-2 nukleokapsidprotein (Sino Biological, Beijing, Kina, katalognr. 40588-V08B , 50 ng per brønn) eller piggprotein (Sino Biological, 40589-V08B1, 100 ng per brønn), SARS-CoV piggprotein (Sino Biological, 40634-V08B, 100 ng pr. brønn), eller MERS-CoV spikeprotein (Sino Biological, 40069-V08B, 50 ng per brønn) over natten ved 48C. Etter blokkering med 5 % fettfri melk i fosfatbufret saltvann (PBS) som inneholder 0,05 % Tween 20 (PBS-T) i 2 timer ved 378C, 3-fold seriefortynnede varmeinaktiverte serumprøver ved en startfortynning på 1 :200 ble tilsatt i forhåndsbelagte plater i 2 timer ved 378°C. Brønner ble vasket 3 ganger mellom hvert trinn med PBS-T. Reaksjoner ble visualisert ved inkubering med pepperrotperoksidase-konjugert anti-humant IgG-antistoff (Abcam, Cambridge, Storbritannia, 1:100,000 fortynning) i 1 time ved 378C, etterfulgt av tilsetning av tetrametylbenzidinsubstrat (Life Technologies, Carlsbad , California). Utviklingsreaksjonene ble stoppet med 2 mol H2SO4, og absorbansen ble målt ved 450 nm med korreksjonsbølgelengden satt til 630 nm (OD450 2 OD630). For å beregne endepunkttiteren til bindende antistoffer ble data linearisert ved å plotte log10 av serumfortynninger mot de korrigerte verdiene for optisk tetthet (OD) (OD450 2 OD630) innenfor den lineære delen av kurven (y 5 kx 1 b , r2 > 0,99), og serumfortynningen der den justerte OD-verdien (OD450 2 OD630) 5 0 ble beregnet for å gi en endepunktstiter. Antigenspesifikke IgG-antistoffer i peptidimmuniserte mus ble vurdert ved peptidbasert ELISA. Kort fortalt ble 96-brønn ELISA-plater (Thermo Fisher Scientific) belagt med 1 mg per brønn av 4 blandede peptider (peptider 318, 356, 510 og 530) i karbonatbuffer (pH 9,6) over natten ved 48C. Etter blokkering med PBS-T inneholdende 5 % fettfri melk, ble brønnene inkubert med serumprøver fortynnet ved 1:40 i 1 time ved 378C. Deretter ble platene vasket og inkubert med pepperrotperoksidase-konjugert anti-muse IgG-antistoff (Abcam). Reaksjoner ble visualisert med tetrametylbenzidinsubstrat (Life Technologies), og absorbansen ved 450 nm ble målt etter å ha stoppet reaksjoner med 2 mol H2SO4.
Pseudovirusproduksjon og titrering
Det kodonoptimaliserte genet som koder for SARS-CoV-2 (NC_045512) eller SARS-CoV (AY291315.1) spikeprotein med C-terminal 19 aa-sletting, eller MERS-CoV (JX{{10) }}) piggprotein avkortet med C-terminal 16 aa ble klonet inn i henholdsvis pcDNA3.1(1)-vektor. HEK 293T-celler dyrket i en 100 mm vevskulturskål ble kotransfektert med 1 mg av et plasmid som koder for spikeprotein og 15 mg av en env-mangelfull, luciferase-uttrykkende ryggrad (pNL4-3.luc.RE) ved bruk av polyetylenimin (Polysciences) , Warrington, Pa). Pseudovirusholdige cellekultursupernatanter ble samlet 48 timer etter transfeksjon, filtrert og lagret ved 2808C i alikvoter. For å bestemme virustitere (50 % vevskulturinfeksiøs dose), ble seriefortynninger av pseudovirus tilsatt til 1 3 104 Huh7-celler forhåndssådd i 96-brønnplater. Etter 12 timers infeksjon ble det virusholdige mediet erstattet med et friskt vekstmedium, og cellene ble dyrket i ytterligere 48 timer. Luciferaseaktiviteten til cellelyse ble målt med Steady-Glo Luciferase Assay System (Promega, Madison, Wisc) ved bruk av en mikroplateleser (BioTek Instruments, Winooski, Vt), og brønner som produserte relative luminescensenheter høyere enn 10 ganger gjennomsnittlig bakgrunnsverdi ble vurdert positivt.
Pseudovirus-nøytraliseringsanalyse
Varmeinaktiverte serumprøver fra COVID-19-pasienter eller friske donorer ble 2-fold seriefortynnet og inkubert med 200 pseudovirus ved 50 % vevskulturinfeksiøs dose i 1 time ved 378C. Blandingene ble deretter påført for å infisere Huh7-celler forhåndssådd i 96-brønnplater i duplikat. Brønner ble etterfylt med friskt vekstmedium 12 timer etter infeksjon, og luciferaseaktiviteten til cellene ble bestemt 48 timer senere. 50 % nøytraliseringstiterne (NT50) mot SARS-CoV-2 og SARS-CoV pseudovirus ble beregnet ved ikke-lineær regresjon ved bruk av GraphPad Prism 8.0-programvare (GraphPad Software, La Jolla, California); og NT50 av MERS-CoV pseudovirus ble definert som den høyeste fortynningen av serum som resulterte i en 50 % reduksjon av relative luminescensenheter sammenlignet med viruskontrollen uten påføring av serumprøver.
Protein mikroarray-basert cytokindeteksjon
Den kvantitative målingen av flere cytokiner (IL-1a, IL-1b, IL- 4, IL-6, IL-8, IL-10 , IL-13, MCP-1, IFN-g og TNF-a) i serumprøver ble utført ved bruk av en multipleks ELISA-array (RayBiotech, Peachtree Corners, Ga) i henhold til produsentens protokoll. Kort fortalt ble glassglass forhåndsbelagt med cytokinspesifikke antistoffer blokkert med prøvefortynningsmiddel ved romtemperatur i 30 minutter, etterfulgt av tilsetning av 60 mL 2- ganger fortynnede serumprøver eller cytokinstandardfortynninger. Etter inkubering over natten ved 48C ble objektglass vasket 5 ganger og farget med 80 ml biotinylert deteksjonsantistoffcocktail og deretter Cy3-ekvivalent fargestoffkonjugert streptavidin ved romtemperatur i 1 time. Fluorescensintensiteten ble oppdaget av InnoScan 300 mikroarray-skanner (Innopsys, Chicago, Ill) ved 532 nm, og data ble analysert med Q-Analyzer-programvare (RayBiotech).
Peptidsyntese og konjugering med bovint serumalbumin
Totalt 515 peptider (15 aa i lengde, overlappende med 11 aa) som dekker SARS-CoV-2-proteomet ble syntetisert av GL Biochem (Shanghai, Kina) på grunnlag av aminosyresekvensen til SARS-CoV -2 stamme Wuhan-Hu-1. Peptidene ble konjugert med bovint serumalbumin (BSA) ved å bruke kryssbinderen Sulfo-SMCC (Thermo Fisher Scientific) i henhold til produsentens instruksjoner. Kort fortalt ble Sulfo-SMCC tilsatt med 30-fold molart overskudd til BSA, etterfulgt av dialyse til PBS. Deretter ble peptidet inneholdende cystein tilsatt i et forhold på 1:1 (vekt/vekt) inkubert i 2 timer, og videre dialysert med PBS for å eliminere frie peptider.
Peptid mikroarray fabrikasjon
For å forberede peptidmikroarrayen, peptider av SARS-CoV-2, så vel som den negative kontrollen (BSA) og positive kontroller (anti-humane IgG og anti-humane IgM-antistoffer; Sigma-Aldrich, St Louis, Mo) , ble immobilisert på PATH-substratobjektglass (Grace Bio-Labs, Bend, Ore) i tre eksemplarer ved bruk av en Super Marathon-skriver (Arrayjet, Edinburgh, Skottland, Storbritannia). Deretter ble peptidmikroarrayer bevart ved 2808C for videre bruk.
cistanche tubulosa-forbedre immunsystemet
Mikroarray-basert epitopkartlegging
Mikroarray-basert serumanalyse ble utført som Li et al,37 med mindre modifikasjoner. For å lage individuelle kammer for de identiske undergruppene, ble en 14-kammergummipakning montert på hvert peptidmikroarray-glass. Slide-arrayene ble varmet opp til romtemperatur før bruk, deretter blokkert med 3% BSA i PBS-T i 3 timer. Serumprøvene fra COVID-19-pasienter eller sammenslåtte sera fra 20 friske donorer (kontrollgruppe) ble fortynnet ved 1:200 i PBS-T for de fleste prøvene og deretter inkubert med hver subarray i 2 timer kl. 48C. Arrayene ble vasket med PBS-T og inkubert med Cy3-konjugert geit-anti-menneskelig IgG og Alexa Fluor 647-konjugert esel-anti-menneskelig IgM (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) ved 1:1000 fortynning hver i 1 time ved romtemperatur. Etter inkubering ble arrayene vasket med PBS-T og deretter tørket fullstendig ved sentrifugering ved romtemperatur. Deretter ble matrisene skannet ved hjelp av en LuxScan 10K-A mikroarrayskanner (CapitalBio, Beijing, Kina), og FL-fluorescensintensitetsdataene ble innhentet og analysert av GenePix Pro 6.0-programvare (Molecular Devices, Sunnyvale, California).
FIG 1. Longitudinell dynamikk av antistoffresponser hos COVID-19-pasienter. Et skjema over studiedesignet. Totalt 31 SARS-CoV-2-infiserte individer og 20 friske givere ble registrert i studien. Serumprøvetaking ble utført longitudinelt ved flere tidspunkter for 20 pasienter blant 31 SARS-CoV-2-infiserte individer, mens prøvetaking på et enkelt tidspunkt ble utført for de andre 11 pasientene. Antall deltakere og serumprøver brukt i ulike analyser er oppført. B og C, totalt 101 serumprøver fra 31 COVID-19-pasienter ble testet med ELISA for SARS-CoV-2 N-protein (B) og S-protein (C)-bindende IgG-antistoffer på forskjellige tidspunkter etter symptomdebut (dager 1-30, n 5 37; dager 31-61, n 5 18; dager 100-150, n 5 21; dager {{21 }}, n 5 25). Serumprøver fra 20 friske givere ble inkludert som kontrollgruppe. D, NT50 mot SARS-CoV-2 pseudovirus over tid ble beregnet ved ikke-lineær regresjon. E, Distribusjon av serumnøytraliserende aktivitet hos COVID-19-pasienter på angitte tidspunkter etter sykdomsdebut. Prøver med en NT50-titer under 20 ble definert som ingen nøytraliserende
Peptid mikroarray dataanalyse
IgG- og IgM-dataene ble henholdsvis analysert. Signalintensiteten til hvert punkt ble definert som forgrunnen minus bakgrunnen og gjennomsnittet av trippelflekkene for hvert peptid. Cutoff-verdien for den positive peptidresponsen til COVID-19-prøver ble satt til to ganger signalintensiteten til den friske donorkontrollen. Peptider med positive rater over 80 % blant prøver testet ved alle 3 prøvetakingstidspunkter (dagene 10-60, 100-150 og 180-220 etter sykdomsdebut) ble definert som dominante og vedvarende peptider og peptider med en positiv svarfrekvens over 60 % ved alle 3-tidspunkter ble ansett som subdominant og vedvarende. Den gjennomsnittlige signalintensiteten til hvert peptid i 3 prøvetakingstidspunktgrupper ble beregnet; peptider som viser høy signalintensitet (over gjennomsnittet 1 SD for signalintensiteter for alle testede prøver) ble også valgt. Databehandling og -analyse ble utført av R v3.6.3-programvare (https://www.r-project.org/), og signifikante endringer i signalintensiteten mellom ulike samplingstidspunktgrupper ble evaluert basert på Limma. Forskjeller med P < 0,05 ble ansett som statistisk signifikante.
Immunisering av mus
BALB/c hunnmus i alderen 6 til 8 uker ble kjøpt fra Beijing Vitalstar Biotechnology (Beijing, Kina). Alle mus ble plassert i spesifikke patogenfrie fasiliteter, og dyrestudiet ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Tianjin Medical University (Tianjin, Kina). For immunisering ble grupper av mus (n 5 5) injisert intramuskulært med 25 mg per dose av hvert peptid (henholdsvis peptidene 318, 356, 510 og 530) blandet med 50 mg alun (InvivoGen, San Diego, California) og 10 mg CpG-adjuvanser, og forsterket to ganger med 50 mg per dose peptider i nærvær av adjuvanser med 2-ukers intervaller. Vaksinasjon med adjuvanser alene fungerte som negativ kontroll. Sera ble samlet fra immuniserte mus på dag 10 eller dag 14 etter den andre og tredje immuniseringen.
Statistiske og strukturelle analyser
Alle grafene ble plottet av GraphPad Prism. Statistiske sammenligninger mellom gruppene i fig. 1, 2 og 4 ble utført ved 1-måte ANOVA med Tukey-multippel sammenligning. Korrelasjoner vist i Fig 1 Fig E9 og Fig E10 i Online Repository tilgjengelig på www.jacionline.org ble bestemt ved Pearson korrelasjonsanalyse. Forskjeller med P < 0,05 ble ansett som statistisk signifikante. Strukturene til SARS-CoV-2 piggprotein (Protein Data Bank [PDB; http://www.wwpdb.org/] ID: 6VXX og PDB ID: 6ZGI) og dimeriseringsdomenet til SARS-CoV{{ 13}} nukleokapsidprotein (PDB ID: 6YUN) ble brukt til å dissekere de strukturelle detaljene til identifiserte epitoper lokalisert på spikeproteinet og dimeriseringsdomenet til nukleokapsidproteinet. Sekvensjustering og homologianalyse blant forskjellige humane koronavirus ble utført av Clustal W-algoritmen i MEGA v10.1.6-programvaren.
RESULTATER
SARS-CoV-2-infeksjon induserer vedvarende antigenspesifikk binding og nøytraliserende antistoffer
For å vurdere antistoffresponser etter SARS-CoV-2-infeksjon i lengderetningen, ble det samlet inn 101 serumprøver fra 31 individer med PCR-bekreftet SARS-CoV-2-infeksjon (fig 1, A). Studiedeltakerne inkluderte 26 pasienter med moderat COVID-19, 1 med asymptomatisk presentasjon, 2 med mild sykdom og 2 med alvorlige symptomer (se tabell E1 i Online Repository tilgjengelig på www.jacionline.org). Pasienter som ble registrert i denne studien varierte fra 17 til 66 år (median alder, 45 år), med en omtrent lik fordeling av mannlige (51,6 %) og kvinnelige (48,4 %) forsøkspersoner. De vanligste symptomene blant studiedeltakerne inkluderte feber (83,9 %), hoste (67,7 %), myalgi (22,6 %) og frysninger (22,6 %), med en gjennomsnittlig sykdomsvarighet på 15 dager. Totalt 90 serumprøver fra 20 COVID-19-pasienter ble samlet inn under sykehusinnleggelse og utskrivning etter bedring på flere tidspunkter opptil 219 dager etter symptomdebut (fig 1, A, og se tabell E2 i online-depotet). Prøvetaking fra de andre 11 deltakerne ble utført på et enkelt tidspunkt under sen rekonvalesens (dag 122 til 214 etter symptomdebut). I tillegg ble prøver fra 20 friske givere med samsvarende alder og kjønnsfordeling inkludert som en kontrollgruppe (tabell E1). Antigenspesifikke IgG-antistoffer i serumprøver ble kvantifisert ved ELISA precoated med SARS-CoV-2 N-protein eller S-protein. Sammenlignet med friske givere ble både anti-N og anti-S IgG-antistoffer utviklet hos COVID-19-pasienter innen 30 dager etter symptomdebut, med en geometrisk gjennomsnittlig endepunkttiter på 4,10 (log10 anti-N IgG) og 4.20 (log10 anti-S IgG) (Fig 1, B og C; og se Tabell E3 i Online Repository på www. jacionline.org; Fig E1, A og B; og Fig E2), i samsvar med tidligere observasjoner om at serokonversjon oppstår 1 til 2 uker etter SARS-CoV-2-infeksjon.5,38 Etterpå falt antigenbindende antistofftitere i varierende grad over tid. Raskt og dramatisk synkende anti-N IgG-antistoffnivåer ble observert hos COVID-19-pasienter, mens høyere nivåer av anti-S IgG-titere ble opprettholdt opptil 180 til 220 dager etter sykdomsdebut sammenlignet med friske givere (fig 1, B) og C). Korrelasjonsanalyse avdekket en signifikant korrelasjon mellom log10 anti-N IgG titere og anti-S IgG titere (r 5 0.50 og P <.001; Fig. 1, F). I tillegg til å kvantifisere bindende antistoffer, ble dynamikken til funksjonelle nøytraliserende antistoffer hos individer med COVID-19 bestemt videre ved å bruke pseudotype SARS-CoV-2. Over 95 % av pasientserumprøvene (35/37) samlet inn mellom 4 og 30 dager etter symptomdebut hadde robuste nøytraliserende aktiviteter mot SARS-CoV-2, og en stor andel av prøvene viste moderate (NT50 80-320 ) til sterk (NT50 > 320) nøytraliserende aktivitet (fig 1, D og E). Merk at 2 prøver med ingen eller lave nøytraliserende titere (NT50 ved en minimumserumfortynning på 1:20) ble samlet i en tidlig periode etter virusinfeksjon (på dag 4 og dag 11 etter symptomdebut) før de fremkalte potente nøytraliserende antistoffer (fig. 1, D, og Fig. E1, C). Til tross for synkende nivåer av SARS-CoV-2-nøytraliserende antistoffer hos covid{104}}-pasienter over tid, var de fleste pasientserumprøver (24/25) oppnådd i løpet av 180 til 220 dager etter symptomdebut vedvarende positivitet for nøytralisering mot SARS- CoV-2, med en 2.8- ganger reduksjon i geometrisk gjennomsnittlig NT50-titere (fig 1, D og E; tabell E3; fig E3). Som forventet, sammenlignet med anti-N IgG-antistoffer, ble det identifisert en sterkere korrelasjon mellom SARS-CoV-2 S-bindende IgG-titre og nøytraliserende antistofftitere (r 5 0.61 og P < .001; Fig. 1 , G og H), i samsvar med funnene om at SARS-CoV-2 S-protein er hovedmålet for nøytraliserende antistoffer. S-proteinet til SARS-CoV-2 deler en høy sekvenslikhet med svært virulent SARS-CoV (76 % sekvensidentitet) og viser en lav sekvenshomologi med MERS-CoV (34 % sekvensidentitet). Serologisk kryssreaktivitet blant koronavirus er rapportert; 8,10,28,29 men data om longitudinell oppfølgingsevaluering av kryssreaktivitet av antistoffer mot SARS-CoV-2 mot andre koronavirus er fortsatt begrenset. Vi bestemte kryssbindings- og kryssnøytraliserende antistoffer i longitudinelle sera fra SARS-CoV-2-infiserte individer. Resultatene viste at mer enn 80 % av pasientserumprøvene bandt seg til S-proteiner av SARS-CoV og/eller MERS-CoV innen 1 måned etter symptomdebut, med 27 % av prøvene som viste dobbel kryssreaktivitet (fig 1, I). Reaktivitet mot SARS-CoV S-protein hadde en større andel (73 %) enn MERS-CoV (35 %) blant prøver testet i en tidlig periode (1-30 dager etter sykdomsdebut) (fig 1, I). De dobbeltkryssbindende og SARS-CoV-kryssbindende antistoffene viste en gradvis nedgang over tid, med bare 8 % dobbeltkryssbinding og 20 % SARS-CoV enkeltkryssbindingsprøver 180 til 220 dager etter sykdomsdebut (fig 1) , I; i Online Repository tilgjengelig på www.jacionline.org, se Fig E4, A; Fig E5, A; og Fig E6 i denne artikkelens Online Repository på www.jacionline.org). Interessant nok forble positiviteten til MERS-CoV S proteinreaktive antistoffer relativt konstant over tid (fig 1, I). Forskjellig fra den høye kryssbindingskapasiteten, kryssnøytraliserte bare et lite antall pasientserumprøver SARS-CoV og/eller MERS-CoV pseudovirus (Fig 1, I; Fig E4, B; Fig E5, B; og se Fig E7 i Online arkiv). Omtrent 27 % av prøvene samlet 1 til 30 dager etter symptomdebut viste kryssnøytraliserende aktivitet, og dette tallet falt til 20 % ved 180 til 220 dager, med mer dramatiske endringer i SARS-CoV kryssnøytraliserende aktivitet (fig 1, I ). En høyere andel av prøvene kryssnøytraliserte SARSCoV enn MERS-CoV innen 30 dager etter sykdomsdebut. Det er verdt å merke seg at til tross for lignende andeler av prøver som viser SARS-CoV og MERS-CoV kryssnøytralisering, var NT50-verdiene for MERS-CoV mye lavere enn for SARSCoV blant serumprøver som var positive for kryssnøytralisering (fig E4, B; Fig. E5, B; Fig. E7).
cistanche planteøkende immunsystem
SARS-CoV-2-infeksjon resulterer i aktivering av cytokinproduksjon
For å karakterisere de immunologiske endringene etter SARS-CoV-2-infeksjon, vurderte vi ytterligere endringer i dynamikk i cytokinnivåer i sera fra COVID-19-pasienter. Femtifem longitudinelle serumprøver som ble samlet i løpet av de første 2 månedene etter symptomdebut ble brukt til påvisning av cytokinproduksjon ved hjelp av proteinbasert mikroarray. Økte serumnivåer av flere cytokiner ble observert i løpet av den første måneden av sykdommen, inkludert IL-1a (proinflammatorisk), IL-6 (proinflammatorisk) og IL-10 (anti-inflammatorisk ), som har vært knyttet til cytokinfrigjøringssyndrom i alvorlige COVID-19-tilfeller,39,40 samt IFN-g (TH1-type) og IL-4 (TH2-type) (Fig 2, A, og Fig E8 i Online Repository tilgjengelig på www.jacionline.org). Spesielt økte serumnivåene av IL-6, IL-10 og IFN-g innen 15 dager etter symptomdebut hos pasienter og reduserte i senere faser, mens frigjøringen av IL-1 a og IL-4 ble vist å være bemerkelsesverdig økt i løpet av 16 til 30 dager fra sykdomsutbruddet, og falt raskt til det normale etterpå (fig 2, A). Korrelasjonsanalyse indikerte en svak eller ingen lineær assosiasjon mellom antigenspesifikke antistoffresponser og cytokinproduksjon etter SARS-CoV-2-infeksjon, selv om det ble observert en statistisk signifikans mellom nivåer av IL-10 og SARS-CoV{{ 34}} N-proteinbindende antistoff (r 5 0.321 og P <.05), mellom IL-1b-produksjon og S-proteinbindende antistoff (r 5 20.335 og P<.05), and between TNF-a and S protein binding antibody levels (r 5 20.335 and P <.05; see Fig E9 in the Online Repository). To allow direct visualization and comparison among patient samples across multiple cytokine responses over time, we constructed a heat map showing fold changes in cytokine release relative to the healthy donor control group (Fig 2, B). Consistent with our findings presented above, elevated serum cytokine levels after SARS-CoV-2 infection were predominantly observed during the acute phase and an early period of convalescence (within 30 days after disease onset) (Fig 2, A and B). Among cytokines tested, proinflammatory IL-6 exhibited the most robust response, with a 4.9-fold increase and a 2.9-fold increase on average for samples collected during 1 to 15 days and 16 to 30 after onset of symptoms, respectively (Fig 2, B). Of note, 1 serum sample (sample Pt-S22, collected on day 18 after disease onset) obtained from a COVID–19–infected individual with moderate disease, exhibited a marked increase in the production of multiple proinflammatory cytokines, including IL-1a, IL-1b, IL-6, and TNF-a (Fig 2, B). Additionally, hyperproduction of cytokines including IL- 1a, IL-4, IL-6, IL-10, IL-13, and IFN-g was also detected in 1 sample (sample Pt-S11, collected at day 15 after disease onset) collected from a severe case of COVID-19; presumably, these are associated with disease severity and outcome (Fig 2, B). These results indicate broad inflammatory activation and changes over time involving the concomitant release of proinflammatory and anti-inflammatory cytokines as well as TH1-type and TH2-type cytokines in COVID-19 patients.
Proteomomfattende epitopkartlegging identifiserer dominante epitoper som medierer vedvarende humorale immunresponser hos COVID-19-pasienter
For bedre å karakterisere de karakteristiske trekk ved humoral immunitet mot SARS-CoV-2 over tid, brukte vi en proteomomfattende epitopkartlegging ved bruk av peptidbaserte mikroarrayer. Et peptidbibliotek som dekker SARS-CoV-2-proteomet ble generert og immobilisert på objektglass, der hvert peptid var 15 aa langt med en 11 aa overlapping. Totalt 51 longitudinelle serumprøver fra 19 pasienter med enten asymptomatisk (n 5 1) eller mild (n 5 2) til moderat (n 5 15) eller alvorlig (n 5 1 ) SARS-CoV-2-infeksjoner ble testet (tabell I). For å oppnå relativt balanserte prøvetakingstall, intervaller og tidspunkter, ble prøver samlet inn sekvensielt ved 2 eller 3 tidspunkter fra hver COVID{18}}-deltaker, fra 16 til 219 dager etter symptomdebut. Flertallet av pasientene (18/19) genererte nøytraliserende antistoffer etter virusinfeksjon, bortsett fra enkeltindividet med asymptomatisk infeksjon (tabell I). I henhold til de forskjellige prøvetidspunktene ble prøvene delt inn i 3 grupper: dager 10-60 (n 5 18), dager 100-150 (n 5 18) og dager {{28 }} (n 5 15). Longitudinell vurdering av virusepitop-profiler hos COVID-19-pasienter ble utført for både serum-IgG- og IgM-antistoffer, med sammenslåtte sera fra 20 friske donorer brukt som negativ kontroll. Ved å bruke SARS-CoV-2-proteommikroarrayen ble kinetikken til peptidbindende antistoffresponser bestemt og analysert for (1) bindingssignalintensitet og (2) prosentandel av positive-reaktive prøver (positiv hastighet) for hvert peptid . Basert på grenseverdien for en positiv peptidbindende respons, som ble satt til to ganger signalintensiteten til den negative kontrollen, identifiserte vi totalt 460 positive peptider for IgG og 479 positive peptider for IgM som var reaktive med minst 1 pasient serumprøve. Positive peptidtall og fordelingen av responser på tvers av forskjellige åpne leserammer (ORF) av SARS-CoV-2 var relativt stabile blant forskjellige prøvetakingsgrupper, med en trend med en svak nedgang i positive peptidtall over tid (fig 3, EN). Den mest reaktiviteten ble identifisert i replikasepolyproteinet ORF1ab, som er den største ORF, som omfatter mer enn to tredjedeler av hele genomet (fig 3, A). Interessant nok observerte vi moderate til sterke grader av korrelasjon mellom positive peptidbindende responser og serumcytokinnivåer tidlig etter SARS-CoV-2-infeksjon (dager 10-60 etter sykdomsdebut; se Fig E10 i Online Repository på www.jacionline.org). Antall positive bindingspeptider for IgM ble vist å være assosiert med serumnivåer av IL-6 og IL-10; likeledes ga den gjennomsnittlige signalintensiteten til totale reaktive peptider og den til ORF1ab-bindende peptider for IgM positive assosiasjoner med IL-6- og IFN-g-produksjon i serumprøver. Disse dataene tyder på at endringer i cytokinnivåer etter SARS-CoV-2-infeksjon kan påvirke omfanget og bredden av epitoper gjenkjent av antigenspesifikke humorale responser. Basert på å identifisere positive epitoper, valgte vi videre de vanligste epitopene som konsekvent forble reaktive i mer enn 80 % av COVID-19-prøvene blant hver av de 3 prøvetakingsgruppene (kalt dominante og vedvarende epitoper). Resultatene avslørte at disse svært dominerende epitopene som er i stand til å mediere langsiktige humorale immunresponser, var lokalisert ved SARS-CoV-2 ORF1ab-polyproteinet og S-proteinet, med flere epitoper gjenkjent av IgM-antistoffer (n 5 33) enn IgG-antistoffer (n 5 10) (Fig 3, B og Tabell II; se Fig E11 og Fig E12 i Online Repository på www.jacionline.org). ORF1ab-polyproteinet hadde det maksimale antallet dominante epitoper som medierte langsiktige responser, og epitoper var bredt fordelt på regionene til ikke-strukturelle proteiner (nbsp) 2-5, nbsp 8-10, nbsp 12-14, og nbsp 16 (tabell II). Spesielt identifiserte vi én immundominant epitop, 2073 (ORF1ab, aa 5801-5815), som kunne gjenkjennes av IgG- og IgM-antistoffer fra 100 % av COVID-19-pasientene, uavhengig av tidspunkt for serumprøvetaking (fig. 3, B og Tabell II; se Fig E13 og Fig E14 i Online Repository). Dette svært reaktive peptidet er lokalisert innenfor helikase-regionen (nsp 13) til ORF1ab-polyproteinet, som er essensielt for å avvikle dobbelttrådete RNA-templates under SARS-CoV-2-replikasjon.41 Blant utvalgte peptider av ORF1ab, 2 immundominante peptider med de høyeste gjennomsnittlige signalintensitetene gjenkjent av IgG-antistoffer, nummer 1985 (ORF1ab, aa 5449-5463) og nummer 2073 (ORF1ab, aa 5801-5815), er begge lokalisert på nsp 13. For IgM-responser, peptid 685 (ORF1ab, aa 249-263) på nsp 2 og peptid 1985 (ORF1ab, aa 5449-5463) på nsp 13 presenterte de mest robuste bindingsintensitetene (fig 3, B). Tatt i betraktning variasjonen i baseline-signaler (samlet sera fra friske givere) for forskjellige peptider (fig 3, B), beregnet vi videre ganger endringer av signalintensiteter angående hvert nøkkelpeptid, i forhold til den friske kontrollgruppen. Resultatene viste at peptid 2073 (IgG-binding) og peptid 1985 (IgM-binding) lokalisert på nsp 13-regionen opprettholdt de øverste peptidbindingsintensitetene (foldendring) blant pasientsera samlet opp til 180 til 220 dager (Fig E13 og Fig E14).
FIG 2. Kinetikk for cytokinproduksjon hos COVID-19-pasienter. A, Cytokinproduksjonsnivåene i 55 serumprøver samlet inn fra 16 COVID-19-pasienter under den akutte fasen og et tidlig stadie av rekonvalesens ble oppdaget ved hjelp av protein-mikroarray-basert ELISA (dager 1-15, n) 5 11; dager 16-30, n 5 26; dager 31-61, n 5 18; friske givere, n 5 20). Hver prikk representerer en individuell serumprøve; stiplede linjer angir grensen for deteksjon. Statistisk signifikans ble bestemt ved 1-måte ANOVA med Tukey multiple sammenligninger. *P <.05, **P <.01 og ****P <.0001. B, fold endring av hvert cytokinproduksjonsnivå hos COVID-19-pasienter vist i (A) sammenlignet med gjennomsnittsverdiene for 20 prøver fra friske givere. Hver kolonne indikerer en distinkt serumprøve samlet fra angitte tidspunkter etter symptomdebut; hver rad representerer 1 individuelt testet cytokin.
TABELL I. Kjennetegn på COVID-19-pasienter og prøvekohorter i epitopkartlegging
FIG 3. IgM- og IgG-gjenkjenning av dominante epitoper som bidrar til langsiktige antistoffresponser hos SARS-CoV-2-infiserte individer. Longitudinell analyse av serumgjenkjenning av epitoper hos 19 individer med COVID-19 ved bruk av en peptidmikroarray som dekker proteomet til SARS-CoV-2. Cutoff-verdien for den positive responsen av peptidbinding i pasientprøver (n 5 51) ble satt til to ganger signalintensiteten til de sammenslåtte seraene fra 20 friske givere. A, Peptidtall og distribusjon av positive bindende peptider som var påvisbare i 1 eller flere prøver samlet etter 10-60 dager (n 5 18), 100-150 dager (n 5 18), og 180- 220 dager (n 5 15) etter sykdomsdebut. Tall indikerer de totale identifiserte IgG- og IgM-epitoper fra hver ORF. B, Signalintensiteter av dominerende og vedvarende IgG- og IgM-epitoper (x-aksen) som var bærekraftig reaktive i mer enn 80 % av prøvene innenfor alle 3 prøvetakingstidspunkter. Hver prikk indikerer sammenslått sera fra friske donorer (øverst) eller en distinkt pasientserumprøve samlet fra angitte tidspunkter etter symptomdebut. E, konvoluttprotein.
TABLE II. Epitopes with >80 % positiv rate ved alle 3 prøvetakingstidspunkter
Dominante og vedvarende epitoper av SARS-CoV-2 S-protein er lokalisert ved NTD- og S2-underenheter
Totalt 4 dominante og vedvarende epitoper fra SARSCoV-2 S-proteinet ble identifisert: peptid 318 (S, aa 45-59) og peptid 356 (S, aa 197-211), som er lokalisert innenfor NTD-regionen; peptid 510 (S, aa 813-827), som dekker S2'-spaltingsstedet og deler av FP-en til S2-underenheten, og peptid 530 (S, aa 893-907), som er lokalisert i forbindelsesområdet mellom FP og den første heptad-repetisjonsregionen til S2-underenheten (fig 3, B og tabell II). Blant disse nøkkelpeptidene av S-protein som vi valgte, hadde peptid 318, lokalisert ved NTD-en til S-proteinet, den mest robuste bindingsintensiteten (foldendring i forhold til kontrollen; Fig E13 og Fig E14). Strukturelle analyser viste at disse epitopene er fullstendig eksponert på overflaten av monomert S-protein; noen rester av epitoper for peptidene 318, 356 og 530 er imidlertid skjult under overflaten av det trimere S-proteinet (fig 4, A og B), noe som tyder på at både S-monomer- og trimerstrukturer gjenkjennes effektivt av vertens immunsystem under visse omstendigheter. For å være spesifikk eksponeres 2 sløyfesegmenter av peptid 318 (aa 45-46 og aa 56-59) på det trimere S-proteinet, med den sentrale b-strengen begravd på innsiden; og de fleste restene av peptid 356 er tilgjengelige på overflaten, inkludert en kjerne b-streng (aa 203-209) og et løkkesegment (aa 210-211). Peptid 510 inneholder et S2'-spaltningssted og en sentral helix av FP, som begge er fullstendig presentert på overflaten av S-protein; rester av peptid 530 er for det meste kryptiske, med bare en liten del av løkken (aa 893-895) eksponert på det trimeriske S-proteinet (fig 4, C). Sekvenshomologianalyse blant 7 vanlige humane koronavirus avslørte at 2 epitoper lokalisert ved S2-underenheten (peptidene 510 og 530) deler høy sekvensidentitet med andre koronavirus, noe som tyder på serologisk kryssreaktivitet rettet mot disse epitopene blant humane koronavirus (fig 4, D). Sekvensen til peptid 318 viste høy likhet med SARSCoV, mens et lavt nivå av sekvenshomologi for peptid 356 ble vist blant koronavirus, noe som tyder på SARS-CoV-2-spesifikke antistoffresponser rettet mot denne regionen (fig 4, D). Ved å vurdere nye fremvoksende og sirkulerende SARS-CoV-2-varianter globalt, utførte vi videre sekvensjustering med hensyn til nøkkelepitoper av S-proteinet mellom den tidlige SARS-CoV-2-stammen (Wuhan-Hu{{52} }) og 5 varianter av bekymring (Alfa, Beta, Gamma, Delta og Omicron), samt 2 varianter av interesse (Lambda og Mu), i henhold til Verdens helseorganisasjons klassifisering av variantvirus (oppdatert 30. november 2021) ). Resultatene viste at sekvenser av disse dominerende og vedvarende epitopene er nesten identiske blant varianter som ble analysert, bortsett fra en enkelt N211I-mutasjon identifisert i den nye Omicron-varianten (fig 4, E). Disse dataene indikerer at antistoffer generert av tidlige SARS-CoV-2-stammer konsekvent kan gjenkjenne gjeldende sirkulerende varianter, og at disse dominante epitopene kan være i stand til å formidle vedvarende langsiktige antistoffresponser ved infeksjon av SARS-CoV-2 varianter. For ytterligere å bestemme de immunologiske egenskapene til identifiserte epitoper på S-proteinet, og for å ytterligere undersøke den potensielle verdien av disse S-proteinepitopene som peptidvaksinkandidater, utførte vi en museimmuniseringsstudie ved bruk av utvalgte peptider. BALB/c-mus ble inokulert 3 ganger med hvert peptid i nærvær av alun og CpG-adjuvanser (fig 4, F). Blant de 4 peptidene som ble valgt, fremkalte vaksinasjon med peptid 356 antigenspesifikke antistoffer etter den andre og tredje dosen (fig 4, G). Resultatene av serumnøytraliseringsanalysen avslørte at immunisering med lineære peptider ikke genererte signifikante nivåer av nøytraliserende antistoffer mot SARS-CoV-2 (Fig 4, H), noe som tyder på at disse lineære peptidene fungerer dårlig i å indusere robuste nøytraliserende antistoffresponser.
N-protein av SARS-CoV-2 mangler de fleste reaktive epitoper som medierer varige antistoffresponser etter virusinfeksjon
En rekke studier har belyst den potente antigenisiteten til SARS-CoV-2 N-proteinet.4,11,12 Vi klarte imidlertid ikke å identifisere dominante og vedvarende epitoper lokalisert ved N-proteinet på grunnlag av gjeldende seleksjonskriterier (over 80 % positiv rate ved alle 3 prøvetakingstidspunkter). For longitudinell evaluering av epitopprofiler av N-proteinet hos individer med COVID-19, utførte vi en andre runde med epitopscreening som var basert på data hentet fra peptidmikroarrayen for valg av subdominante epitoper som konsekvent forble positiv reaktivitet i mer enn 60 % av COVID-19-prøvene for hvert av de 3 prøvetidspunktene (kalt subdominante og vedvarende epitoper). Totalt 4 subdominante og vedvarende epitoper av SARS-CoV-2 N-proteinet ble identifisert, hvorav peptid 2455 (N, aa 213-227) viste reaktivitet mot både IgG- og IgM-antistoffer i COVID{{16 }} pasienter, med relativt høyere nivåer av signalintensitet (Fig 5, A og B, og se Tabell E4 i Online Repository på www.jacionline.org). De 2 overlappende peptidene, peptid 2455 (N, aa 213-227) og peptid 2456 (N, aa 217-231), er lokalisert i den Ser/Arg-rike linkerregionen mellom det N-terminale RNA-bindingsdomenet og C-terminalt dimeriseringsdomene til N-proteinet. Peptid 2482 (N, aa 321-335) og peptid 2491 (N, aa 357-371) er helt eller delvis lokalisert innenfor dimeriseringsdomenet til N-proteinet (tabell E4). På grunn av mangelen på 3-D-strukturer angående den intakte konformasjonen av N-proteinet, utførte vi bare strukturelle analyser av 2 identifiserte epitoper på den dimere strukturen til det C-terminale dimeriseringsdomenet. Rester av peptid 2482 danner 2 b-tråder som er arrangert på en antiparallell måte i dimeriseringsgrensesnittene, mens aa 357-364 av peptid 2491 danner helix-baserte strukturer som er lokalisert i motsatte ender av dimeren (fig 5, C) . Sekvensjustering mellom tidlig SARS-CoV-2 (stamme Wuhan-Hu-1) og 7 nye varianter avslørte videre at sekvenser av disse subdominante og vedvarende epitopene i N-protein er nesten identiske blant gjeldende sirkulerende varianter, med en enkelt G215C-substitusjon av peptid 2455 som forekommer i Delta-varianten og en enkelt G214C-mutasjon av peptid 2455 identifisert i Lambda-varianten, noe som antyder at antistoffer som retter seg mot disse peptidene potensielt gjenkjenner antigen fra fremvoksende SARS-CoV-2-varianter (fig 5, D) ).
FIG 4. Dominante epitoper av SARS-CoV-2 spikeprotein når det gjelder å formidle varige humorale immunresponser. A og B, Plasseringer av de dominerende og vedvarende epitopene på 3-D-strukturene til det monomere (A) og trimere (B) S-proteinet (PDB ID: 6VXX). Epitoper er uthevet i grønt (peptid 356, aa 197-211), rødt (peptid 318, aa 45-59), blått (peptid 510, aa 813-827) og lilla (peptid 530, aa 893-907), henholdsvis. De tre S-monomerene i lukket konformasjon er avbildet i henholdsvis grått, rosa og cyan. C, Detaljert strukturanalyse av dominante epitoper i SARS-CoV-2 S-protein på den lukkede tilstanden til S-trimeren (PDB ID: 6VXX). D, Sekvensjustering av identifiserte epitoper blant vanlige menneskelige koronavirus. Epitoprester som er bevart mellom SARS-CoV-2 og andre humane koronavirus er gråtonet. E, epitopkonserveringsanalyse av den tidlige SARS-CoV-2 (stamme Wuhan-Hu-1) og 7 nye varianter. Svarte prikker representerer identiske rester mellom Wuhan-Hu-1-stammen og den angitte.
FIG 5. Subdominante epitoper lokalisert ved SARS-CoV-2 nukleokapsidproteinet er i stand til å mediere vedvarende antistoffresponser. A-, IgG- og IgM-gjenkjenningsfrekvenser for subdominante peptider (varig reaktive i mer enn 60 % prøver) blant pasientserumprøver samlet inn på flere tidspunkter etter sykdomsdebut. B, Signalintensitetskinetikk til identifiserte subdominante epitoper over tid. Hver prikk representerer en distinkt pasientserumprøve hentet fra COVID-19-pasienter på angitte tidspunkter etter symptomdebut. Stiplede horisontale linjer indikerer grenseverdier for positiv respons for hvert peptid. C, Detaljert strukturanalyse av epitoper på det C-terminale dimeriseringsdomenet til N-proteinet (PDB ID: 6YUN). Epitoper er merket med blått (peptid 2482, aa 321-335) og brunt (peptid 2491, aa 357-364). De 2 monomere strukturene er avbildet i henholdsvis grått og cyan. D, Sekvensjusteringsanalyse av de identifiserte N-proteinepitopene mellom den tidlige SARS-CoV-2 (stamme Wuhan-Hu-1) og 7 nye varianter. Svarte prikker angir identiske sekvenser mellom Wuhan-Hu-1-stammen og den angitte varianten. Endringer i aminosyresekvens er uthevet i rødt.
FIG 6. Liner-epitoper med høy bindingsintensitet og synkende reaktive frekvenser over tid, gjenkjent av SARS-CoV-2-infiserte individer. A og B, Longitudinell analyse og distribusjon av identifiserte peptider som viser høy bindingssignalintensitet (over gjennomsnittlig 1 SD for signalintensiteter for alle testede prøver), men avtagende positiv rate over tid. Gjenkjennelsesfrekvensen (A) og signalintensiteten (B) til epitoper ble plottet med 3 prøvetakingstidspunkter etter symptomdebut. Hver prikk i (B) står for en individuell pasientserumprøve samlet på angitte tidspunkter etter symptomdebut; Stiplede horisontale linjer indikerer cutoff-verdier for positivitet for hvert peptid. Statistisk signifikansanalyse ble utført basert på Limma of R v3.6.3-programvaren. *P <.05 og **P <.01. C, Plassering og sekvenssammenligninger av 2 tilstøtende epitoper, peptid 510 (dominant og vedvarende) og peptid 511 (høy signalintensitet og avtagende positivitet over tid), på SARS-CoV-2 S-proteinstruktur (PDB ID: 6ZGI) . De overlappende områdene mellom de 2 epitopene er uthevet i grønt; unike sekvenser er merket med rødt og blått.
Longitudinell serologisk analyse identifiserer epitoper med høy signalintensitet, men avtagende reaktivitet over tid
I tillegg til de utvalgte svært reaktive epitopene som er ansvarlige for vedvarende humorale immunresponser nevnt ovenfor, identifiserte og karakteriserte vi videre et panel med 9 positive peptider som viste robuste bindingsintensiteter (over gjennomsnittet 1 SD for signalintensiteter for alle testede prøver) med en trend med avtagende reaktivitet (positive rateendringer over 20 %) blant serumprøver fra COVID-19-pasienter over tid, i samsvar med en generell trend med avtagende humorale immunresponser. Disse epitopene er plassert innenfor de tre dominerende antigenene: ORF1ab, S og N-proteiner (Fig 6, A; og se Tabell E5 i Online Repository på www.jacionline.org). I tillegg ble det observert betydelige reduksjoner i signalintensiteten til 4 peptider fra ORF1ab (peptider 784-IgG, 1617-IgM og 1986-IgM) og N (peptid 2457-IgG) proteiner mellom prøver fra en tidlig periode med prøvetakingstidspunkter (dager 10-60 etter sykdomsdebut) og den senere fasen av prøvetakingstidspunkter (dager 100-150 eller dager 180-220 etter symptomdebut) (fig 6 , B). Spesielt, til tross for i stor grad overlappende med hverandre, viste 2 peptider av S-proteinet peptid 510 (dominant og vedvarende; Fig. 3, B) og peptid 511 (høy signalintensitet og avtagende positiv hastighet over tid; Fig. 6, A) forskjellige mønstre av reaktivitet blant pasientserumprøver over tid. Sekvens- og lokaliseringsanalyse indikerte at peptid 510 inneholder et S2'-spaltingssete og ytterligere aminosyrer av 813-SKRS-816, mens peptid 511 er fullstendig innenfor FP med utvidet 828-LADA{{29 }} rester som er fullstendig eksponert på overflaten av trimert S-protein (fig 6, C). Disse resultatene avslørte nye trekk ved epitoper som til slutt kan bidra til lengre varig og sterkere humoral immunitet mot SARS-CoV-2.
DISKUSJON
En systematisk karakterisering av langsiktige immunresponser på SARS-CoV-2-infeksjon er avgjørende for utviklingen av forbedret diagnostikk, effektive terapeutiske intervensjoner og vaksiner. I den nåværende studien utførte vi en omfattende longitudinell analyse av COVID-19-pasienter over 180 til 220 dagers oppfølging, og viste vedvarende humorale immunresponser og aktivert cytokinproduksjon etter virusinfeksjon.
Ved å dra nytte av det peptidbaserte mikroarrayet som spenner over proteomet til SARS-CoV-2, avslørte vi ytterligere kinetikken til epitopgjenkjenning og identifiserte et panel av dominante epitoper som er i stand til å mediere langsiktig humoral immunitet. Funnene vi rapporterer her om levetiden til humorale immunresponser etter SARS-CoV-2-infeksjon bekrefter noen tidligere publiserte data5,10,12,13,42, men utvider dem ved å utføre dyp serologisk profilering og epitopscreening ved bruk av longitudinelle serumprøver fra individer med COVID-19 gjennom den proteomomfattende mikroarray-tilnærmingen. I denne studien identifiserte vi 4 dominante epitoper (peptider 318, 356, 510 og 530) i SARS-CoV-2 S-proteinet som var i stand til vedvarende å reagere med mer enn 80 % COVID-19-pasienter prøver testet, opptil 180 til 220 dager etter symptomdebut. Peptid 510 (S, aa 813-827), som omfatter S2-spaltningsstedet og FP-en til S2-underenheten, er ofte identifisert i tidligere studier av andre grupper.26,28,32-34 Funksjonelle analyser indikerte antistoffer rettet mot denne regionen kan vise begrenset nøytraliseringsstyrke mot SARS-CoV-226,33 til tross for at den er sterkt eksponert på overflaten av S-proteinet (fig 4, AC). Når det gjelder peptid 530 (S, aa 893-907), som er plassert mellom FP og den første heptad-repetisjonsregionen til S2-underenheten, er rester vanligvis begravet inne i den trimeriske strukturen til S-proteinet, noe som gjør det vanskelig tilgjengelig via robuste nøytraliserende antistoffer mot SARS-CoV-2 (fig 4, AC). I tillegg ble 2 S1-NTD-rettede peptider som kunne mediere langsiktige antistoffresponser av SARS-CoV-2 også valgt. Analyser angående peptidsekvensen og plasseringen indikerte at rester av disse 2 peptidene – peptid 318 (S, aa 45-59) og peptid 356 (S, aa 197-211) – er i umiddelbar nærhet til de rapporterte epitopene som er gjenkjent ved infeksjonsforsterkende antistoffer23,25, men bortsett fra nøkkelstedene til svært potente nøytraliserende antistoffer rettet mot NTD av S1-underenheten, 16,19,43, noe som antyder muligheten for epitopgjenkjenning av ikke-nøytraliserende antistoffer mot disse 2 identifiserte peptidene. I tillegg til detaljene nevnt ovenfor, indikerte museimmunisering med utvalgte peptider ytterligere den lave effekten av disse lineære peptidene i ikke-reseptorbindende domene til å indusere robuste nøytraliserende antistoffresponser (fig 4, G). Samlet antyder disse dataene at dominerende lineære epitoper som medierer langsiktige humorale immunresponser på SARS-CoV-2-infeksjon sannsynligvis induserer antistoffer med ingen eller begrenset nøytraliserende styrke. En fyldigere forståelse av epitoplandskapet til SARS-CoV-2-antistoffer, spesielt S-protein-rettede epitoper, gir ny innsikt i funksjonell disseksjon av antistoffer, noe som ytterligere letter nyskapende og rasjonell vaksinedesign. Nøytraliserende antistoffer gir beskyttelse for å eliminere virusinfeksjoner, mens ikke-nøytraliserende antistoffer kan spille en fordelaktig, nøytral eller til og med skadelig rolle under virusutskillelse. Ikke-nøytraliserende antistoffer gir ytterligere beskyttelse in vivo via en rekke Fc-medierte effektorfunksjoner i sammenheng med antistoffavhengig fagocytose og antistoffavhengig cytotoksisitet. I motsetning til dette har noen studier foreslått muligheten for en patogen rolle av ikke-nøytraliserende antistoffer i koronavirusinfeksjon. Tidligere studier med flere typer vaksinekandidater for SARS-CoV og MERS-CoV observerte forbedret immunopatologi hos vaksinerte smådyr og ikke-menneskelige primater etter virusutfordringen.24,44-50 Nylig har studier av 2 grupper rapportert at ikke-nøytraliserende antistoffer rettet mot NTD av SARS-CoV-2 S-protein var i stand til å forsterke virusinfeksjon in vitro gjennom Fcg-reseptoruavhengige mekanismer,23,25, selv om passivt administrerte infeksjonsforbedrende antistoffer i dyremodeller har vist seg å være beskyttende mot SARS -CoV-2-infeksjon in vivo. Med tanke på de kontroversielle rollene til antistoffer under koronavirusinfeksjon, er ytterligere undersøkelser nødvendig for å validere den potensielle rollen til antistoffer i å gjenkjenne disse dominerende og vedvarende epitopene i bekjempelse av virusinfeksjon in vivo. Det neste stadiet av rasjonell vaksinedesign for SARS-CoV-2 kan tenkes ved å fremkalle svært potente nøytraliserende antistoffer og beskyttende ikke-nøytraliserende antistoffer, sammen med en reduksjon av presentasjonen av infeksjonsforsterkende epitoper eller immundominante epitoper som ikke har noen gunstige effekter. Selv om en rekke tidligere studier kun har fokusert på S-proteinet til SARS-CoV-2 med sikte på å avgrense antistofffunksjoner angående nøytralisering, utførte vi en omfattende proteomomfattende epitopkartlegging og identifiserte et panel av epitoper i ORF1ab-polyproteinet som ble konsekvent gjenkjent av en høy andel pasientserumprøver over tid. Selv om disse ORF1ab-rettede peptidene distribuert på de flere ikke-strukturelle proteinene kanskje ikke fremkaller funksjonelle antistoffer rettet mot SARS-CoV-2-virion, kan de være anvendelige som et diagnostisk verktøy for å hjelpe til med å skille naturlig infeksjon fra vaksinasjon. Med det økende antallet vaksinemottakere over hele verden, står nåværende serologiske tester basert på S-proteinet og N-proteinet overfor utfordringer som en effektiv tilnærming for å hjelpe molekylære tester for påvisning av SARS-CoV-2-infeksjon, og også for bestemmelse av immunstatus etter virusinfeksjon. Ved å dra nytte av de vanligste og vedvarende reaktive peptidene i ORF1ab blant COVID-19-infiserte individer, vil serologisk diagnose av naturlig infeksjon bli utført uten å ta hensyn til vaksinasjonsstatus som involverer reseptorbindende domenebasert, S-protein- baserte og inaktiverte virusbaserte vaksinetilnærminger. Fremtidige studier er nødvendig for å vurdere reaktiviteten, sensitiviteten og spesifisiteten til identifiserte ORF1ab-peptider i større kohorter som omfatter både SARSCoV-2-infiserte individer og vaksinemottakere. I tillegg vil ytterligere evaluering av deteksjonseffektiviteten gjennom flere peptidkombinasjonsstrategier være nødvendig for å overvinne den lavere sensitiviteten til peptider sammenlignet med proteinet i full lengde og den mulige kryssreaktiviteten blant vanlige humane koronavirus. De største begrensningene i studien vår er de relativt få prøvene som er hentet fra en liten pasientkohortstørrelse, og flertallet av deltakerne opplevde ikke-alvorlige covid-sykdommer. Disse kan begrense noen av våre konklusjoner med hensyn til den positive responsfrekvensen og omfanget av immunresponser, som kan variere i henhold til sykdommens alvorlighetsgrad. Ikke desto mindre gir dataene som presenteres i denne studien verdifull innsikt i kinetikken til immunresponser over tid etter SARS-CoV-2-infeksjon og trekk ved dominante epitoper som er i stand til å formidle vedvarende humoral immunitet hos individer med COVID{109}}. Sammen gir disse funnene en dypere forståelse av levetiden til naturlig immunitet indusert av en virusinfeksjon og har brede implikasjoner for innovative vaksinasjonsstrategier og forbedrede diagnostiske tilnærminger.
REFERANSER
1. Lu R, Zhao X, Li J, Niu P, Yang B, Wu H, et al. Genomisk karakterisering og epidemiologi av 2019 nytt koronavirus: implikasjoner for virusopprinnelse og reseptorbinding. Lancet 2020;395:565-74.
2. Verdens helseorganisasjon (WHO). Dashboard for WHO coronavirus (COVID-19), 2021. Tilgjengelig på: https://COVID19.who.int/. Åpnet 30. november 2021.
3. Wu Z, McGoogan JM. Kjennetegn på og viktige lærdommer fra utbruddet av koronavirussykdommen 2019 (COVID-19) i Kina: sammendrag av en rapport med 72314 tilfeller fra det kinesiske senteret for sykdomskontroll og forebygging. JAMA 2020;323:1239-42.
4. Rydyznski Moderbacher C, Ramirez SI, Dan JM, Grifoni A, Hastie KM, Weiskopf D, et al. Antigenspesifikk adaptiv immunitet mot SARS-CoV-2 ved akutt COVID-19 og assosiasjoner til alder og sykdomsgrad. Cell 2020;183:996-1012.e19.
5. Wu J, Liang B, Chen C, Wang H, Fang Y, Shen S, et al. SARS-CoV-2-infeksjon induserer vedvarende humorale immunresponser hos rekonvalesenterende pasienter etter symptomatisk COVID-19. Nat Commun 2021;12:1813.
6. Long QX, Liu BZ, Deng HJ, Wu GC, Deng K, Chen YK, et al. Antistoffresponser mot SARS-CoV-2 hos pasienter med COVID-19. Nat Med 2020;26:845-8.
7. Sterlin D, Mathian A, Miyara M, Mohr A, Anna F, Claer L, et al. IgA dominerer den tidlige nøytraliserende antistoffresponsen mot SARS-CoV-2. Sci Transl Med 2021;13: eabd2223.
8. Zhang J, Wu Q, Liu Z, Wang Q, Wu J, Hu Y, et al. Spike-spesifikke sirkulerende T-follikulær hjelpecelle og kryssnøytraliserende antistoffresponser hos COVID-19– rekonvalescente individer. Nat Microbiol 2021;6:51-8.
9. Wang P, Liu L, Nair MS, Yin MT, Luo Y, Wang Q, et al. SARS-CoV-2 nøytraliserende antistoffresponser er mer robuste hos pasienter med alvorlig sykdom. Emerg Microbes Infect 2020;9:2091-3.
10. Vanshylla K, Di Cristanziano V, Kleipass F, Dewald F, Schommers P, Gieselmann L, et al. Kinetikk og korrelater av den nøytraliserende antistoffresponsen på SARSCoV-2-infeksjon hos mennesker. Cell Host Microbe 2021;29:917-29.e4.
11. Xiang T, Liang B, Fang Y, Lu S, Li S, Wang H, et al. Fallende nivåer av nøytraliserende antistoffer mot SARS-CoV-2 hos rekonvalesent Covid-19-pasienter ett år etter symptomdebut. Front Immunol 2021;12:708523.
12. Wang Z, Muecksch F, Schaefer-Babajew D, Finkin S, Viant C, Gaebler C, et al. Naturlig forbedret nøytraliserende bredde mot SARS-CoV-2 ett år etter infeksjon. Nature 2021;595:426-31.
13. Dan JM, Mateus J, Kato Y, Hastie KM, Yu ED, Faliti CE, et al. Immunologisk minne mot SARS-CoV-2 vurdert i opptil 8 måneder etter infeksjon. Science 2021;371:eabf4063.
14. Sokal A, Chappert P, Barba-Spaeth G, Roeser A, Fourati S, Azzaoui I, et al. Modning og persistens av anti-SARS-CoV-2 minne B-cellerespons. Cell 2021; 184:1201-13.e14. 15. Ju B, Zhang Q, Ge J, Wang R, Sun J, Ge X, et al. Menneskelige nøytraliserende antistoffer fremkalt av SARS-CoV-2-infeksjon. Nature 2020;584:115-9.
16. Liu L, Wang P, Nair MS, Yu J, Rapp M, Wang Q, et al. Potente nøytraliserende antistoffer mot flere epitoper på SARS-CoV-2 spike. Nature 2020;584:450-6.
17. Zost SJ, Gilchuk P, Case JB, Binshtein E, Chen RE, Nkolola JP, et al. Potensielt nøytraliserende og beskyttende humane antistoffer mot SARS-CoV-2. Natur 2020; 584:443-9.
18. Xu C, Wang Y, Liu C, Zhang C, Han W, Hong X, et al. Konformasjonsdynamikk av SARS-CoV-2 trimert piggglykoprotein i kompleks med reseptor ACE2 avslørt av cryo-EM. Sci Adv 2021;7:eabe5575.
19. McCallum M, De Marco A, Lempp FA, Tortorici MA, Pinto D, Walls AC, et al. N-terminal domene antigen kartlegging avslører et nettsted med sårbarhet for SARSCoV-2. Cell 2021;184:2332-47.e16.
20. Sauer MM, Tortorici MA, Park YJ, Walls AC, Homad L, Acton OJ, et al. Strukturelt grunnlag for bred koronavirusnøytralisering. Nat Struct Mol Biol 2021;28:478-86.
21. Tortorici MA, Beltramello M, Lempp FA, Pinto D, Dang HV, Rosen LE, et al. Ultrapotente humane antistoffer beskytter mot SARS-CoV-2-utfordring via flere mekanismer. Science 2020;370:950-7.
22. Pinto D, Park YJ, Beltramello M, Walls AC, Tortorici MA, Bianchi S, et al. Krysnøytralisering av SARS-CoV-2 av et humant monoklonalt SARS-CoV-antistoff. Nature 2020;583:290-5.
23. Liu Y, Soh WT, Kishikawa JI, Hirose M, Nakayama EE, Li S, et al. Et infeksjonsforbedrende nettsted på SARS-CoV-2 spikeproteinet målrettet av antistoffer. Cell 2021; 184:3452-66.e18.
24. Liu L, Wei Q, Lin Q, Fang J, Wang H, Kwok H, et al. Anti-spike IgG forårsaker alvorlig akutt lungeskade ved å skjeve makrofagresponser under akutt SARS-CoV-infeksjon. JCI Insight 2019;4:e123158.
25. Li D, Edwards RJ, Manne K, Martinez DR, Sch€afer A, Alam SM, et al. In vitro og in vivo funksjoner av SARS-CoV-2 infeksjonsforsterkende og nøytraliserende antistoffer. Cell 2021;184:4203-19.e32. 26. Poh CM, Carissimo G, Wang B, Amrun SN, Lee CY, Chee RS, et al. To lineære epitoper på SARS-CoV-2 spikeproteinet fremkaller nøytraliserende antistoffer hos COVID{10}}-pasienter. Nat Commun 2020;11:2806.
27. Zhang BZ, Hu YF, Chen LL, Yau T, Tong YG, Hu JC, et al. Utvinning av epitoper på spikeprotein av SARS-CoV-2 fra COVID-19-pasienter. Cell Res 2020;30:702-4.
28. Stoddard CI, Galloway J, Chu HY, Shipley MM, Sung K, Itell HL, et al. Epitopprofilering avslører bindende signaturer av SARS-CoV-2-immunrespons ved naturlig infeksjon og kryssreaktivitet med endemiske humane CoVs. Cell Rep 2021;35: 109164.
29. Shrock E, Fujimura E, Kula T, Timms RT, Lee IH, Leng Y, et al. Viral epitopprofilering av COVID-19-pasienter avslører kryssreaktivitet og korrelerer med alvorlighetsgrad. Science 2020;370:eabd4250.
30. Zamecnik CR, Rajan JV, Yamauchi KA, Mann SA, Loudermilk RP, Sowa GM, et al. ReScan, en multipleks diagnostisk pipeline, panorerer humant sera for SARS-CoV-2- 2-antigener. Cell Rep Med 2020;1:100123.
31. Haynes WA, Kamath K, Bozekowski J, Baum-Jones E, Campbell M, Casanovas Massana A, et al. Høyoppløselig epitopkartlegging og karakterisering av SARS-CoV-2-antistoffer i store kohorter av individer med COVID-19. Commun Biol 2021;4:1317.
32. Li Y, Lai DY, Lei Q, Xu ZW, Wang F, Hou H, et al. Systematisk evaluering av IgG-responser på SARS-CoV-2 piggproteinavledede peptider for overvåking av COVID-19-pasienter. Cell Mol Immunol 2021;18:621-31.
33. Li Y, Ma ML, Lei Q, Wang F, Hong W, Lai DY, et al. Lineært epitoplandskap av SARS-CoV-2 piggproteinet konstruert fra 1051 COVID-19-pasienter. Cell Rep 2021;34:108915.
34. Wang H, Wu X, Zhang X, Hou X, Liang T, Wang D, et al. SARS-CoV-2 Proteome Microarray for kartlegging av COVID-19-antistoffinteraksjoner ved aminosyreoppløsning. ACS Cent Sci 2020;6:2238-49.
35. Yi Z, Ling Y, Zhang X, Chen J, Hu K, Wang Y, et al. Funksjonell kartlegging av B-celle lineære epitoper av SARS-CoV-2 i COVID-19 rekonvalesentpopulasjon. Emerg Microbes Infect 2020;9:1988-96.
36. Nasjonal helsekommisjon og nasjonal administrasjon av tradisjonell kinesisk medisin. Diagnose og behandlingsprotokoll for ny koronavirus-lungebetennelse (prøveversjon 7). Chin Med J (Engl) 2020;133:1087-95; https://doi.org/10.1097/ CM9.0000000000000819.
37. Li Y, Li CQ, Guo SJ, Guo W, Jiang HW, Li HC, et al. Longitudinell serum-autoantistoffrepertoarprofilering identifiserer kirurgi-assosierte biomarkører i lungeadenokarsinom. EBioMedicine 2020;53:102674.
38. Zhao J, Yuan Q, Wang H, Liu W, Liao X, Su Y, et al. Antistoffresponser mot SARSCoV-2 hos pasienter med ny koronavirussykdom 2019. Clin Infect Dis 2020;71: 2027-34.
39. Lucas C, Wong P, Klein J, Castro TBR, Silva J, Sundaram M, et al. Longitudinelle analyser avdekker immunologisk feiltenning ved alvorlig covid-19. Nature 2020;584: 463-9.
40. Moore JB, juni CH. Cytokinfrigjøringssyndrom ved alvorlig COVID-19. Science 2020;368:473-4.
41. Chen J, Malone B, Llewellyn E, Grasso M, Shelton PMM, Olinares PDB, et al. Strukturelt grunnlag for Helicase-Polymerase-kobling i SARS-CoV-2-replikasjons-transkripsjonskomplekset. Cell 2020;182:1560-73.e13.
42. Wajnberg A, Amanat F, Firpo A, Altman DR, Bailey MJ, Mansour M, et al. Sterke nøytraliserende antistoffer mot SARS-CoV-2-infeksjon vedvarer i flere måneder. Vitenskap 2020; 370:1227-30.
43. Chi X, Yan R, Zhang J, Zhang G, Zhang Y, Hao M, et al. Et nøytraliserende humant antistoff binder seg til det N-terminale domenet til spikeproteinet til SARS-CoV-2. Science 2020;369:650-5.
44. Tseng CT, Sbrana E, Iwata-Yoshikawa N, Newman PC, Garron T, Atmar RL, et al. Vaksinasjon med SARS-koronavirusvaksiner fører til pulmonal immunopatologi ved utfordring med SARS-viruset. PLoS One 2012;7:e35421.
45. Bolles M, Deming D, Long K, Agnihothram S, Whitmore A, Ferris M, et al. En dobbeltinaktivert koronavirusvaksine for alvorlig akutt respiratorisk syndrom gir ufullstendig beskyttelse hos mus og induserer økt eosinofil proinflammatorisk lungerespons ved utfordring. J Virol 2011;85:12201-15.
46. Weingartl H, Czub M, Czub S, Neufeld J, Marszal P, Gren J, et al. Vaksinasjon med modifisert vacciniavirus Ankara-basert rekombinant vaksine mot alvorlig akutt respiratorisk syndrom er assosiert med forsterket hepatitt hos ildere. J Virol 2004;78:12672-6.
47. Yasui F, Kai C, Kitabatake M, Inoue S, Yoneda M, Yokochi S, et al. Tidligere immunisering med alvorlig akutt respiratorisk syndrom (SARS)-assosiert coronavirus (SARS-CoV) nukleokapsidprotein forårsaker alvorlig lungebetennelse hos mus infisert med SARS-CoV. J Immunol 2008;181:6337-48.
48. Deming D, Sheahan T, Heise M, Yount B, Davis N, Sims A, et al. Vaksineeffektivitet hos eldre mus utfordret med rekombinante SARS-CoV-bærende epidemiske og zoonotiske piggvarianter. PLoS Med 2006;3:e525.
49. Wang Q, Zhang L, Kuwahara K, Li L, Liu Z, Li T, et al. Immundominante SARS-koronavirusepitoper hos mennesker fremkalte både forsterkende og nøytraliserende effekter på infeksjon hos ikke-menneskelige primater. ACS Infect Dis 2016;2: 361-76.
50. Agrawal AS, Tao X, Algaissi A, Garron T, Narayanan K, Peng BH, et al. Vaksine med inaktivert Midtøsten respiratorisk syndrom koronavirusvaksine fører til lungeimmunopatologi ved utfordring med levende virus. Hum Vaccin Immunother 2016;12:2351-6.
