Tap av JAK1 driver medfødt immunsvikt

Janus kinase-signaltransdusere og aktivatorer av transkripsjon (JAK-STAT) signalveien er avgjørende for å justere immunresponser, og dens dysregulering er tett assosiert med kreft og immunforstyrrelser. Forstyrrelse av interleukin (IL)-15/STAT5-signalveien på grunn av tap av IL-15-reseptorkjeder, JAK3 eller STAT5 fører til immundefekter med abnormiteter i naturlige drepeceller (NK). JAK1, sammen med JAK3 sender signaler nedstrøms for IL-15, men det nøyaktige bidraget til JAK1 til NK-cellebiologi gjenstår å belyse. For å studere konsekvensene av JAK1-mangel i NK-celler, genererte vi mus med betinget sletting av JAK1 i NKp46+-celler (Jak1fl/flNcr1Cre). Vi viser her at sletting av NK-celle-intrinsic JAK1 signifikant reduserte NK-celletall i benmargen og svekket deres utvikling. På linje observerte vi nesten et fullstendig tap av NK-celler i milten, blodet og leveren, noe som beviser den avgjørende rollen til JAK1 i perifere NK-celler. På linje viste Jak1fl/+Ncr1Cre-mus signifikant svekket NK-cellemediert tumorovervåking. Våre data tyder på at JAK2 ikke er i stand til å kompensere for tapet av JAK1 i NK-celler. Det er viktig at betinget sletting av JAK2 i NKp46+-celler ikke hadde noen effekt på perifere NK-celler, noe som avslører at NK-celle-iboende JAK2 er nødvendig for overlevelse av NK-celler. Oppsummert identifiserte vi at tap av JAK1 i NK-celler driver medfødt immunsvikt, mens JAK2-mangel etterlater NK-celletall og modning uendret. Vi foreslår derfor at i motsetning til for tiden brukte JAK1/JAK2-hemmere, vil bruk av JAK2-spesifikke hemmere være fordelaktig for pasientene ved å la NK-celler være intakte.

Nøkkelord: JAK-STAT, naturlige morderceller, JAK1, JAK2, tumorovervåking

Fordeler med cistanche tubulosa-Antitumor

INTRODUKSJON

Natural killer (NK) celler er medfødte lymfocytter som gjenkjenner og dreper viralt infiserte eller transformerte celler (1). Mangel på NK-celler er en sjelden, men stadig mer verdsatt undertype av primær immunsvikt (PID). Klassisk NK-cellemangel er karakterisert ved fravær av NK-celler i det perifere blodet og resulterer i økt mottakelighet for virusinfeksjoner (2). Janus kinase (JAK) – signaltransduser og aktivator av transkripsjon (STAT) signalveien virker nedstrøms for flere cytokiner, vekstfaktorer og hormoner og regulerer dermed immunresponser kritisk (3, 4). Ved binding av en spesifikk ligand til dens beslektede reseptor, fører konformasjonsendringer til reseptoroligomerisering og aktivering av de reseptorassosierte JAK-ene. JAK-er auto- og trans-fosforylerer hverandre og fosforylerer reseptorkjeder, og gir dokkingstedene for STAT-molekyler. STAT-er gjennomgår deretter JAK-mediert fosforylering, dimeriserer og translokerer til kjernen, hvor de regulerer transkripsjonen av målgener (5). JAK3 og STAT5 er avgjørende aktører for å transdusere signalet nedstrøms for cytokiner som utnytter c-reseptoren (6). "Loss-of-function" (LOF)-mutasjoner i gener som koder for JAK3 (7) eller STAT5B (8) fører til PID-er med en NK-celleabnormitet som understreker viktigheten av banen for medfødte lymfocytter. Immunsvikten til disse pasientene har blitt forklart med svekket IL-7- og IL-15-respons (6). Viktigere er at JAK1 har en dominerende rolle over JAK3 i aktivering av STAT5 nedstrøms for c-holdige cytokinreseptorer (9). Det er attraktivt å spekulere i at LOF-mutasjoner av JAK1 også kan resultere i PID. Til dags dato har bare én pasient med JAK1-kimlinjemutasjoner, hvor JAK1 var redusert, men ikke fraværende, blitt identifisert og faktisk presentert med immunsuppresjon (10). Hos mus fører fullstendig tap av JAK1 til perinatal dødelighet og nyfødte mus viser en sterk reduksjon av tymocytter og B-celler (11). Disse observasjonene ble bekreftet hos voksne mus: induserbar sletting av JAK1 fører til svekkelse av hematopoietiske stamceller (HSCs) homeostase og reduserer markant frekvensen av B-celler og B220+CD11c+NK1.1+ undergruppe av NK-celler (12). Men til dags dato har ingen studie direkte analysert effekten av tap av JAK1 på konvensjonelle NK-celler.

Cistanche deserticola ma- Vedlikeholde leveren

Den første innsikten i bidraget til JAK1 til NK-cellebiologi stammer fra studier som bruker JAK-hemmere – godkjente legemidler for behandling av kreft og autoimmune sykdommer (13). Både mus og pasienter behandlet med JAK1/JAK2-hemmeren Ruxolitinib viste reduserte NK-celletall, svekket modning og funksjon (14, 15). Siden JAK2 også har vært involvert i å drive NK-celledifferensiering (14, 16), gjenstår det å belyse hvilken av de to kinasene som er ansvarlig for de observerte effektene av Ruxolitinib-behandling. Ved å bruke mus med knockout av Jak1 eller Jak2 i NKp46+-celler viser vi her at JAK2 er unødvendig for NK-celleoverlevelse. I motsetning til dette fører sletting av JAK1 i modne NK-celler til NK-cellemangel, og tap av ett allel av Jak1 er tilstrekkelig til å svekke svulstvekstkontroll. Dermed identifiserte vi JAK1 som en nøkkelfaktor for modne NK-celler og genererte en musemodell av klassisk NK-cellemangel.

MATERIALER OG METODER

Mus og cellelinjer

Jak1fl/fl (C57BL/6N-Jak1tm1c(EUCOMM)Hmgu/H; ble vennlig levert av Dr. Alexander Dohnal (CCRI, Wien, Østerrike). Jak1tm1c-allelen til mutanten ble generert fra mus med Jak1tm1a knockout første allel (beskrevet) av International Mouse Phenotyping Consortium https://www.mousephenotype.org) ved utskjæring av lacZ-neo-kassetten via Flp-rekombinasjon.

Det betingede potensialet til Jak1fl/fl-mus ble aktivert ved Cre-rekombinasjon og eksisjon av det loxP-flankerte ekson 3 av Jak1. Vevsspesifikk rekombinasjon ble indusert ved kryssavl av Jak1fl/fl eller Jak2fl/fl [Jak2tm1Kuw; (17)] med B6NTg(NcrlCre); (18) mus. Stat5fl/fl (19) og Stat5fl/flNcr1Cre (18) mus ble beskrevet tidligere. Jak1fl/fl , Ncr1Cre, Stat5fl/fl , Stat5fl/flNcr1Cre mus var på C57B6/N bakgrunn og Jak2fl/fl var på blandet bakgrunn. Forsøksdyrene ble alderstilpasset (8–12 uker) og holdt under spesifikke patogenfrie forhold ved University of Veterinary Medicine, Wien i henhold til retningslinjer fra Federation for Laboratory Animal Science Associations (FELASA) (2014). Dyreforsøkene ble godkjent av Ethics and Animal Welfare Committee ved University of Veterinary Medicine Wien og den nasjonale myndigheten (Østerrikske føderale vitenskaps- og forskningsdepartement) i henhold til §§ 26ff. of Animal Experiments Act, Tierversuchsgesetz 2012—TVG 2012, under lisenser BMWF-68.205/0218-II/3b/2012 og BMBWF-68.205/0174-V/3b /2018 og ble utført i henhold til retningslinjene til FELASA og ARRIVE. Gjennom hele artikkelen refererer Jak1WT til sammenslåtte data fra Jak1fl/+ og Jak1fl/fl mus. Muse-lymfomcellelinjene RMA-Rae1 [vennligst levert av prof. A. Cerwenka; (20)] og YAC-1 ble dyrket i RPMI1640 (Sigma) komplett medium inneholdende 10 % FCS (Bio & Sell), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin (Sigma) og 50 µM {{58 }}merkaptoetanol (Sigma).

cistanche tubulosa-forbedre immunsystemet

In vivo tumormodell

Jak1fl/+ og Jak1fl/+Ncr1Cre mus ble injisert sc med 106 RMA-Rae1 celler i begge flankene og tumorveksten ble overvåket annenhver dag. Ti dager etter injeksjon ble musene avlivet og tumorvekten ble bestemt. For flowcytometrisk analyse av tumorinfiltrerende NK-celler ble svulster kuttet i ~5 mm2 stykker, og enkeltcellesuspensjonen ble oppnådd ved bruk av gentleMACSTM Octo Dissociator (Miltenyi Biotec) med fordøyelsesbuffer inneholdende kollagenase D (1 mg/ml; Sigma Aldrich) og DNAse I (20 mg/ml; Roche).

NK-celleisolering, ekspansjon og stimulering

NK-celler ble isolert fra milt-enkeltcellesuspensjoner ved bruk av DX5-merkede MACS-kuler i henhold til produsentens instruksjoner (Miltenyi Biotec). NK-celler ble utvidet i RPMI1640 komplett medium supplert med 5,000 U/mL rhIL-2 (Proleukin, Novartis) i 7 dager. Antallet CD3−NK1.1+-celler ble vurdert ved flowcytometri på dag 0, 3, 5 og 7. På dag 7 ble celler lysert for Western blot-analyse. For pSTAT5-analyse ble 106 splenocytter stimulert med 50 ng/ml rmIL-15 (PeproTech) i 15 minutter og cellene ble fiksert i 2% PFA etterfulgt av metanolpermeabilisering og rehydrering.

NK-celle cytotoksisitetsanalyse

For in vitro cytotoksisitetsanalyser ble DX5-MACS-sorterte NK-celler utvidet i 7 dager i IL-2 som beskrevet ovenfor og blandet ved angitte effektor:målforhold med karboksyfluoresceindiacetatsuccinimidylester (CFSE, Molecular Probes) , CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit) merkede målceller. Etter 4 timers inkubering ved 37◦C ble cellene farget med Sytox Blue Dead Cell Stain (Thermo Fischer), og den spesifikke målcellelyset ble vurdert ved hjelp av flowcytometri.

Flowcytometri

Enkeltcellesuspensjoner ble fremstilt fra milten, benmargen eller leveren. Leveren ble perfusert via portvenen med 5–10 ml steril PBS. Separasjon av lymfocytter ble utført ved bruk av 37,5 % av personlig (GE Healthcare). For blodanalyse ble erytrocyttene lysert ved bruk av BD FACS Lysing Solution i henhold til produsentens protokoll (BD Bioscience). Antistoffene (klonene) rettet mot følgende proteiner ble kjøpt fra eBioscience: CD3 (17A2), CD3e (145-2C11), CD11b (M1/70), CD16/CD32 (93), CD19 (eBio1D3) CD27 (LG. 7F9), CD49b (DX5), CD122 (5H4), CD226 (10E5), Gr-1 (RB6-8C5), KLRG1 (2F1), Ly49A (A1), Ly49G2 (eBio4D11), NKG2A /C/E (20d5), NKG2D (CX5), NKp46 (29A1.4), NK1.1 (PK136) og Ter119 (TER-119). CD49a (Ha31/8) og pSTAT5 [47/Stat5(pY694)] antistoffer ble kjøpt fra BD Pharminogen og pan-Rae1 (186107) ble kjøpt fra R&D Systems. Totalt celletall ble vurdert ved hjelp av flowcytometri ved å bruke tellekuler Count Bright Beads (Invitrogen). Flowcytometrieksperimenter ble utført på en BD FACSCanto II (BD Bioscience) eller Cytoflex (Beckman Coulter) og analysert ved bruk av BD FACSDiva V8.0 (BD Bioscience), CytExpert (Beckman Coulter) eller FlowJo V10 (FlowJo, LLC).

FIGUR 1|Tap av JAK1 i NKp46+-celler fører til nesten fullstendig fravær av perifere NK-celler. (A) Frekvens (venstre panel) og totalt antall (høyre panel) av Lin−(CD3−CD19−Ly-6G−Ter119−) CD122+ NK-celler i benmargen ble vurdert ved flyt cytometri. (B) Benmargs Lin−CD122+-celler ble videre delt inn i NK-forløpere (NKPs: NKp46−NK1.1−), umodne NK-celler (iNKs: NKp46−NK1.1+), og modne NK-celler (mNKs: NKp46+NK1.1+). (C) Frekvensen av CD3−NKp46+ NK-celler i milten ble vurdert ved hjelp av flowcytometri og representative plott er vist. (D, E) Frekvens (venstre panel) og totalt antall (høyre panel) av CD3−NKp46+ NK-celler i (D) milten og (E) blodet ble vurdert ved hjelp av flowcytometri. (F) Frekvensen av konvensjonelle NK-celler (CD3−NK1.1+NKp46+CD49b+, venstre panel) og ILC1-celler (CD3−NK1.1+NKp46+CD49a+ , høyre panel) ble analysert i leveren til Jak1WT-, Jak1fl/+Ncr1Cre- og Jak1fl/flNcr1Cre-mus ved hjelp av flowcytometri. (A, B,D–F) Søylediagrammer representerer gjennomsnitt ± SEM av 1–2 uavhengige eksperimenter; n=3–11. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.

FIGUR 2|De gjenværende Jak1fl/flNcr1Cre NK-cellene viser en umoden fenotype. (A, B) Milt-CD3−NKp46+ NK-celler ble analysert for ekspresjon av CD27 og CD11b ved flowcytometri. (A) Frekvensen av celler i hvert modningstrinn er vist: DN (CD27 −CD11b−), CD27 (CD{{10}}CD11b−), DP (CD27+CD11b+), CD11b (CD27-CD11b+). Det totale antallet celler i hvert modningstrinn er vist i figur S1C. (B) Representative tomter er vist. (C) pSTAT5(Y694)+-celler ble analysert innenfor CD3−NKp46+NK1.1+-populasjonen ex vivo etter 15 minutters stimulering med IL-15 ved flowcytometri. (D) Milt CD3−NKp{{30}} NK-celler ble analysert for ekspresjon av de indikerte aktiverende og hemmende reseptorene ved flowcytometri. Prosentandelen av NK-celler positive for hver reseptor er vist. Median fluorescensintensitetsdata er presentert i figur S1D. (A–D) Søylediagrammer og tall på plottene representerer gjennomsnitt ± SEM av 2 uavhengige eksperimenter; n=5–8. **p < 0,01, ***p < 0,001.

Western Blot

Cellelyse, SDS-PAGE og Western blots ble utført som beskrevet tidligere (21). Påvisningen av kjemiluminescens ble utført ved bruk av Clarity Western ECL-substrat (BioRad) og ChemiDocT XRS+ Molecular Imager (BioRad) og analysert av Image Lab-programvare (BioRad). Følgende antistoffer ble brukt: anti- -aktin (C4, sc-47778) fra Santa Cruz som lastingskontroll, anti-JAK2 (D2E12; #3230), antiPerforin (#3693) og anti-JAK1 (#3332 ) fra Cell Signaling Technology.

cistanche tubulosa-forbedre immunsystemet

Klikk her for å se Cistanche Enhance Immunity-produkter

【Be om mer】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Statistisk analyse

Uparrede t-tester eller enveis ANOVA med Tukey-posttester ble utført ved bruk av GraphPad Prism versjon 5.00 (GraphPad-programvare). Signifikansnivået er indikert for hvert eksperiment (∗p < 0.05; ∗∗p < 0.01; ∗∗∗p < 0.001).

RESULTATER

JAK1-sletting reduserer NK-celle- og ILC1-tall på en doseavhengig måte

JAK1/JAK2-hemmeren Ruxolitinib har vist seg å redusere NK-celletall, modning og funksjon (14, 15). For å sammenligne og adressere bidraget til JAK1 og JAK2 for NK-cellebiologi genererte vi mus med betinget sletting av enten JAK1 eller JAK2 i NKp46+-celler. Vi krysset dermed Ncr1Cre (18) mus med henholdsvis Jak1fl/fl eller Jak2fl/fl [se Materialer og Metoder og (17)] mus. NK-celler utvikles i benmargen fra NK-celleforløpere (NKP), som er definert som Lin−CD122+NK1.1−NKp46−. De utvikler seg til umodne NK-celler (iNKs) som blir NK1.1+ mens bare modne NK-celler (mNKs) er NK1.1+NKp46+ (22). Ettersom Cre-rekombinase-uttrykket i Ncr1Cre-mus drives av NKp46-promotoren, er Cre-mediert sletting begrenset til NK-celler. Vi observerte en signifikant reduksjon i prosentandelen og totalt antall benmargs-NK-celler i Jak1fl/flNcr1Cre-mus (figur 1A). Lin−CD122+ NK-cellene i Jak1fl/flNcr1Cre-mus viste berikede prosentandeler av NK-celleforløpere (NKPs) og umodne NK-celler, mens mNKs ble signifikant redusert i benmargen i tråd med en utviklingsblokk ved iNK-cellen stadium som forhindrer progresjon til mNK-cellestadiet (figur 1B). Sletting av en allel av Jak1 førte til mellomtall av benmargs-NK-celler (figur 1A). Konsekvent viste NK-celleutvikling en mellomliggende fenotype som antydet en Jak1-gendoseringseffekt på NK-celleutvikling (figur 1B). Blokken i utviklingen av benmargs-NK-celler ble oversatt til drastisk redusert antall NK-celler i periferien. Tap av JAK1 førte til en nesten fullstendig mangel på NK-celler i milt og blod (figur 1C–E). I tråd med en Jak1-gendoseringseffekt, viste Jak1fl/+Ncr1Cre-mus reduserte NK-celleprosenter og totale antall til 50 % sammenlignet med villtype kullkamerater i milten og blodet (figur 1C–E). Sletting av JAK1 nedstrøms effektor og transkripsjonsfaktor STAT5 i NKp46+-celler fører også til en reduksjon av modne NK-celler (18). En direkte sammenligning av Jak1fl/flNcr1Cre og Stat5fl/flNcr1Cre mus viste at sletting av JAK1 provoserte en enda mer uttalt NK-cellemangel i milten og blodet enn sletting av STAT5 (figurene S1A, B). Lever NKp46+ medfødte lymfocytter omfatter to grupper av distinkte avstamninger (23). Konvensjonelle NK-celler (cNK) er karakterisert ved ekspresjonen av CD49b og sirkulerer fritt, mens leverboende type 1 medfødte lymfocytter (ILC1) er karakterisert ved ekspresjonen av CD49a og er begrenset til leveren (24). På samme måte som milt og blod, ble cNK-er i leveren og vevsresidente ILC1-er nesten fullstendig fjernet ved tap av JAK1 (figur 1F). Igjen resulterte sletting av en allel av Jak1 i en mellomliggende overflod av lever medfødte lymfocytter (figur 1F). Oppsummert førte disse funnene oss til å konkludere med at JAK1-ekspresjon i NKp46+-celler er uunnværlig for NK-celleutvikling og vedlikehold i perifere organer på en doseavhengig måte.

JAK1 er avgjørende for NK-cellemodning

I periferien gjennomgår NK-celler modningstrinn som er karakterisert ved sekvensiell ekspresjon av CD27 og CD11b overflatemarkører (22). En allel av Jak1 var tilstrekkelig til å drive NK-cellemodning da vi ikke oppdaget noen forskjeller i prosentandelen av celler i hvert modningstrinn mellom Jak1WT og Jak1fl/+Ncr1Cre-celler (figur 2A, B). De gjenværende Jak1fl/flNcr1Cre NK-cellene viste en økning i den umodne populasjonen (CD27+CD11b-) og en nedgang i den modne CD27-CD11b+-populasjonen (figur 2A, B og figur S1C). Dette resultatet antyder at de gjenværende cellene kanskje bare har mistet JAK1 og ikke har mottatt tilstrekkelig IL-15-signalering til å modnes fullstendig. Faktisk viste de gjenværende Jak1fl/flNcr1Cre NK-cellene redusert fosforylering av STAT5 ex vivo ved kortvarig stimulering med IL-15 (figur 2C). NK-celleaktivitet styres av en balanse mellom aktiverende og hemmende reseptorer. Sletting av verken en eller begge alleler av Jak1 hadde en effekt på prosentandelen av NK-celler som uttrykker følgende aktiverende og hemmende reseptorer: KLRG1, NKG2D, NKG2A/C/E og Ly49A (Figur 2D). Den mest fremtredende forskjellen var en liten reduksjon i Ly49G2+ NK-celler og en økning i DNAM-1+ NK-celler i Jak1fl/flNcr1Cre-musene (figur 2D). Tilsvarende ble det ikke påvist noen grove forskjeller i ekspresjonsnivået (MFI) til hver reseptor, foruten en økning i MFI for DNAM1 og Ly49G2 (figur S1D). I tillegg til sin rolle som en aktiverende reseptor, markerer DNAM- 1-uttrykk et utviklingstrinn; DNAM-1+-celler gir opphav til DNAM-1-celler (25). Vi begrunnet at endringene i DNAM-1+ gjenspeiler modningsblokken til Jak1fl/flNcr1Cre NK-celler.

FIGUR 3|JAK2 er uunnværlig for overlevelse og modning av NK-celler. (A) Frekvens (venstre panel) og totalt antall (høyre panel) av CD3-NKp46+ NK-celler i milten til Jak2WT- og Jak2fl/flNcr1Cre-mus ble vurdert ved hjelp av flowcytometri. (B) Milt-CD3−NKp46+ NK-celler ble analysert for ekspresjon av CD27 og CD11b ved flowcytometri. Frekvensen av celler i hvert modningstrinn er vist: DN (CD27-CD11b-), CD27 (CD27+CD11b-), DP (CD27+CD11b+), CD11b (CD27-CD11b+). (C) Ekspresjonen av JAK2 og -aktin ble analysert ved Western blot i NK-celler etter 6 dagers ekspansjon i IL-2. Skanninger av fulle blotter er tilgjengelige i tilleggsmateriale. (A,B) Søylediagrammer representerer gjennomsnitt ± SEM av 2–3 uavhengige eksperimenter; n=5–12.

FIGUR 4|Tap av ett allel av Jak1 svekker NK-celleaktivitet. (A) NK-celler ble MACS-renset fra milter og dyrket i IL-2 i 7 dager. Antall levende CD3−NK1.1+NKp46+ celler ble vurdert hver 2.–3. dag. Symbolene og feilstrekene som er til stede, betyr ± SEM av 2–4 biologiske replikater. (B) Ekspresjonen av JAK1, Perforin og -aktin ble analysert i utvidede NK-celler fra to uavhengige eksperimenter med Western blot. Skanninger av fulle blotter er tilgjengelige i tilleggsmateriale. (C) Ekspanderte NK-celler fra Jak1WT- og Jak1fl/+Ncr1Cr-mus ble blandet med CFSE-fargede YAC{{20}} (venstre panel) eller RMA-Rae1 (høyre panel) målceller ved angitte effektormålforhold . Den spesifikke lyseringen ble vurdert ved flowcytometri. For YAC-1 vises en representativ graf for ett av to uavhengige eksperimenter. Symbolene og feilstrekene viser gjennomsnittet ± SEM av 2 tekniske replikater. For RMA-Rae1 vises et gjennomsnitt av to uavhengige eksperimenter. Symbolene og feilsøylene som finnes, betyr ± SEM av 2–3 biologiske replikater. *p < 0.05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

JAK2 er unødvendig for overlevelse og modning av NK-celler

Så langt har vi vist at NK-celle-intrinsisk JAK1-sletting fører til NK-cellemangel. For å belyse om JAK2 påvirker NK-celleoverlevelse og -modning, analyserte vi milt-NK-celler i Jak2fl/flNcr1Cre-mus og deres villtype kullkamerater. Vi klarte ikke å oppdage noen innvirkning av JAK2-sletting på frekvensen eller det totale antallet CD3−NKp46+-celler i milten (Figur 3A). Videre viste Jak2fl/flNcr1Cre-mus normal NK-cellemodning, da lignende prosentandeler av CD27-CD11b+-celler ble påvist i begge genotyper (figur 3B). Siden slettingen av JAK2-proteinet i NK-celler var veldig effektiv (Figur 3C), definerer disse dataene utvetydig at i motsetning til JAK1, er NK-celle-iboende JAK2 unødvendig for NK-celleoverlevelse og modning.

cistanche fordeler for menn styrker immunforsvaret

Tap av ett allel av Jak1 svekker NK-cellefunksjonalitet

For å få ytterligere innsikt i hvordan JAK1 regulerer NK-cellefunksjonalitet, analyserte vi veksten av MACS-rensede milt-NK-celler fra Jak1WT, Jak1fl/+Ncr1Cre og Jak1fl/flNcr1Cre. JAK1-mangelfulle NK-celler utvidet seg ikke, noe som viser at selv under en veldig høy dose IL-2 kan ikke andre JAK-er kompensere for tapet av JAK1 (Figur 4A). Tapet av ett allel av Jak1 resulterte i en mindre vekstmangel (figur 4A). Western blot-analyse bekreftet det reduserte JAK1-proteinekspresjonen i utvidede Jak1fl/+Ncr1Cre NK-celler som ble parallelt med reduserte nivåer av perforin (figur 4B). På linje viste Jak1fl/+Ncr1Cre NK-celler en svekket cytotoksisk aktivitet mot målcellelinjene YAC-1 og RMA-Rae1 (figur 4C). Disse resultatene viser at JAK1 ikke bare er uunnværlig for å opprettholde NK-celler i periferien, men også bidrar til deres cytotoksiske aktivitet.

Uttømming av NK-celler forårsaket av tap av ett allel av Jak1 svekker tumorovervåkingen

NK-celler er avgjørende for tidlig gjenkjennelse og eliminering av transformerte celler. For å undersøke om NK-cellereduksjon og deres svekkede funksjonalitet hos Jak1fl/+Ncr1Cre-mus resulterer i økt mottakelighet for tumorvekst og ikke kompenseres på andre måter, benyttet vi oss av RMA-Rae1-lymfomceller. Denne cellelinjen er et verktøy for å studere NK-celleavhengig tumorovervåking på en robust og effektiv måte (20). Vi transplanterte subkutant RMA-Rae1 lymfomceller i begge flankene til Jak1fl/+ og Jak1fl/+Ncr1Cre mus. Manglende en allel av Jak1 svekket evnen til NK-celler til å kontrollere tumorveksten som illustrert ved økt tumorstørrelse (figur 5A) og tumorvekt i Jak1fl/+Ncr1Cre (figur 5B). På linje viste disse svulstene betydelig redusert NK-celleinfiltrasjon (figur 5C, D). Vi klarte ikke å oppdage noen forskjell i frekvensen av NKG2D+ tumorinfiltrerende NK-celler (Figur 5E), som er avgjørende for gjenkjennelsen av RMA-Rae1-svulster. Oppsummert viser resultatene våre at de reduserte NK-celletallene kombinert med en svekket NK-cellefunksjonalitet i Jak1fl/+Ncr1Cre-mus er tilstrekkelig til å svekke svulstvekstkontrollen betydelig in vivo.

FIGUR 5|Tap av en allel av Jak1 svekker tumorovervåking. (A, B) Jak1fl/+ og Jak1fl/+Ncr1Cre mus ble injisert sc med 106 RMA-Rae1 celler og etter 10 dager ble tumorvekten vurdert. Vist er (A) representative tumorbilder og (B) punktplott med horisontale linjer som representerer gjennomsnittlig tumorvekt ± SEM fra 2 uavhengige eksperimenter; n=6–8 (C, D) Tumorinfiltrerende NK-celler ble analysert med flowcytometri. (C) Representative plott av tumorinfiltrerende CD3-NKp46+-celler og deres prosentandel blant Rae1-celler er vist. (D) Totalt antall tumorinfiltrerende CD3−NKp46+-celler per gram tumor og (E) prosentandeler av NKG2D+ NK-celler presenteres som søylediagrammer som viser gjennomsnitt ± SEM fra ett eksperiment n=4– 5. ***p < 0,001.

DISKUSJON

Dysregulering av JAK-STAT-signalveien er tett assosiert med kreftutvikling så vel som immunforstyrrelser (7). Den første JAK-koblede sykdommen som ble oppdaget var den alvorlige kombinerte immundefekten (SCID) som var preget av NK-celleabnormiteter forårsaket av LOF JAK3-mutasjoner (26, 27). Vi viser her at sletting av JAK1 i NKp46+-celler fører til medfødt immunsvikt med tap av NK- og ILC1-celler i perifere organer, mens JAK2 er redundant for overlevelse og modning av NK-celler. Vårt tidligere arbeid avdekket at tap av STAT5 i NK-celler fører til alvorlig reduksjon av NK-celletall i perifere organer (18). Tapet av NK-celler i Stat5fl/flNcr1Cre-mus ble reddet ved påtvunget ekspresjon av pro-overlevelsesmolekylet BCL2 (28). Denne studien definerte STAT5 som en avgjørende overlevelsesfaktor for NK-celler. STAT5B-mangelfulle mus mangler i stor grad NK-celler (29), i tråd med at STAT5 signaliserer nedstrøms cytokiner som er vitale for NK-cellebiologi, som IL-2 eller IL-15 (30). IL-15 er avgjørende for NK-celleutvikling og overlevelse da Il15−/− mus i stor grad er blottet for perifere NK-celler (31). IL-15-signaler via et reseptorkompleks av c-reseptorkjede, IL-2R og IL-15r (32). Knockout-mus fra hver reseptorkjede viser en absolutt kritisk rolle for signaler sendt nedstrøms for IL-15 for utvikling av NK-celler (33, 34). Til dags dato har bidraget fra c-assosiert JAK3 til utvikling av NK-celler vært godt etablert. Mus med JAK3-mangel viser en lignende SCID-fenotype som observert hos menneskelige pasienter, og NK-celleutvikling er blokkert i pre-NK-progenitorstadiet (35, 36). Nå plasserer vi tidligere undervurdert JAK1 som en avgjørende del av IL-15/STAT5-aksen i NK-celler. Jak1fl/flNcr1Cre NK-celler viser en utviklingsblokk på iNK-cellestadiet og et nesten fullstendig tap av NK-celler i perifere organer.

Interessant nok overskrider konsekvensene av JAK1-sletting for NK-celler effekten av STAT5-mangel. Svekkelse av kombinert STAT3- og STAT5-aktivering kan ligge til grunn for det mer uttalte tapet av NK-celler, da STAT3 har vist seg å indusere ekspresjon av det avgjørende NK-celleoverlevelsesgenet Mcl1 (37, 38). Alternativt kan JAK1 og STAT5 ha forskjellige halveringstider som står for forskjellige frekvenser av "bare deletere" - NK-celler som nettopp har mistet genet, men som fortsatt bærer proteinet, noe som kan forklare forskjeller. Gendoseringseffekten av JAK1-mangel gjenspeiles i NK-celletall, mens tapet av ett allel av JAK1 er unødvendig for NK-cellemodning. Dette antyder at aktivert STAT5 er hastighetsbegrensende for NK-celleoverlevelse, men ikke modning. Sletting av en allel av Jak1 er også tilstrekkelig til å betydelig svekke tumorovervåking basert på redusert antall NK-celler kombinert med redusert funksjonalitet til de gjenværende NK-cellene. I samsvar med våre data fører NK-cellespesifikk sletting av STAT5-målgenet Mcl1 til alvorlig NK-cellemangel som forårsaker en betydelig økning i metastatisk belastning (38).

cistanche tubulosa-forbedre immunsystemet

JAK-er kan vise overflødige funksjoner og kompensere for hverandre. Nedstrøms interferonreseptor JAK1 kan delvis kompensere for tap av JAK2-kinaseaktivitet (39). JAK2 har også vist seg å fosforylere STAT5 nedstrøms for IL-15 under in vitro-differensiering av NK-celler (16). På den annen side kan konstitutivt aktiv JAK2 bare beskjedent kompensere for tapet av JAK1 i stamceller, noe som antyder en ikke-overflødig rolle for JAK1 og 2 i HSCs. På linje observerer vi at i fravær av JAK1, klarer ikke JAK2 å kompensere ved å aktivere STAT5, selv under en høy dose IL-2 in vitro, for å tillate overlevelse av NK-celler. Det gjenstår å belyse om kompenserende effekter er oppnåelige ved å uttrykke en konstitutivt aktiv form for JAK2. Enda viktigere, vi viser at tap av JAK2 i NKp46+-celler er unødvendig for NK-celleoverlevelse. JAK2-mangelfulle NK-celler er fullt modne, noe som beviser at NK-celle-iboende JAK2 ikke driver NK-cellemodning. Dette indikerer også at den svekkede NK-cellemodningen i Jak2fl/flMx1Cre-mus (14) mest sannsynlig er forårsaket av NK-celleekstrinsiske funksjoner til JAK2. Man kan spekulere i at den konstitutive delesjonen av JAK2 endrer cytokinmiljøet.

REFERANSER

1. Abel AM, Yang C, Thakar MS, Malarkannan S. Naturlige drepeceller: utvikling, modning og klinisk utnyttelse. Front Immunol. (2018) 9:1869. doi: 10.3389/fimmu.2018.01869

2. Orange JS. Mangel på naturlige drepeceller. J Allergy Clin Immunol. (2013) 132:515–25. doi: 10.1016/j.jaci.2013.07.020

3. O'Shea JJ, Plenge R. JAK og STAT signalmolekyler i immunregulering og immunmediert sykdom. Immunitet (2012) 36:542–50. doi: 10.1016/j.immuni.2012.03.014

4. Stark GR, Darnell JE. JAK-STAT-veien ved tjue. Immunitet (2012) 36:503–14. doi: 10.1016/j.immuni.2012.03.013

5. Shuai K, Liu B. Regulering av JAK-STAT-signalering i immunsystemet. Nat Rev Immunol. (2003) 3:900–11. doi: 10.1038/nri1226

6. O'Shea JJ, Holland SM, Staudt LM. JAK-er og STAT-er innen immunitet, immunsvikt og kreft. N Engl J Med. (2013) 368:161–70. doi: 10.1056/NEJMra1202117

7. Hammarén HM, Virtanen AT, Raivola J, Silvennoinen O. Reguleringen av JAKs i cytokinsignalering og dens nedbrytning i sykdom. Cytokin (2018). doi 10.1016/j.cyto.2018.03.041. [Epub foran trykk].

8. Lorenzini T, Dotta L, Giacomelli M, Vairo D, Badolato R. STAT-mutasjoner som programbyttere: gjør primære immunsvikt til autoimmune sykdommer. J Leukoc Biol. (2017) 101:29–38. doi: 10.1189/jlb.5RI0516-237RR

9. Haan C, Rolvering C, Raulf F, Kapp M, Drückes P, Thoma G, et al. Jak1 har en dominerende rolle over Jak3 i signaltransduksjon gjennom c-holdige cytokinreseptorer. Chem Biol. (2011) 18:314–23. doi: 10.1016/j.chembiol.2011

10. Eletto D, Burns SO, Angulo I, Plagnol V, Gilmour KC, Henriquez F, et al. Bialleliske JAK1-mutasjoner hos immundefekt pasient med mykobakteriell infeksjon. Nat Commun. (2016) 7:13992. doi: 10.1038/ncomms13992

11. Rodig SJ, Meraz MA, White JM, Lampe PA, Riley JK, Arthur CD, et al. Forstyrrelse av Jak1-genet viser obligatoriske og ikke-redundante roller til Jaks i cytokininduserte biologiske responser. Cell (1998) 93:373-83.

12. Kleppe M, Spitzer MH, Li S, Hill CE, Dong L, Papalexi E, et al. Jak1 Integrerer cytokinføling for å regulere hematopoietisk stamcellefunksjon og stresshematopoiesis. Celle stamcelle (2018) 22:277. doi: 10.1016/j.stem.2017 13. Schwartz DM, Kanno Y, Villarino A, Ward M, Gadina M, O'Shea JJ. JAK-hemming som en terapeutisk strategi for immun- og inflammatoriske sykdommer. Nat Rev Drug Discov. (2017) 16:843–62. doi: 10.1038/nrd.2017.201

14. Bottos A, Gotthardt D, Gill JW, Gattelli A, Frei A, Tzankov A, et al. Redusert NK-celletumor-immunovervåking som følge av JAK-hemming forbedrer metastaser i brystkreftmodeller. Nat Commun. (2016) 7:12258. doi: 10.1038/ncomms12258

15. Schönberg K, Rudolph J, Vonnahme M, Parampalli Yajnanarayana S, Cornez I, Hejazi M, et al. JAK-hemming svekker NK-cellefunksjonen i myeloproliferative neoplasmer. Cancer Res. (2015) 75:2187–99. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-14-3198

16. Kim WS, Kim MJ, Kim DO, Byun JE, Huy H, Song HY, et al. Undertrykkeren av cytokinsignalering 2 regulerer negativt NK-celledifferensiering ved å hemme JAK2-aktivitet. Sci Rep. (2017) 7:46153. doi: 10.1038/srep46153

17. Krempler A, Qi Y, Triplett AA, Zhu J, Rui H, Wagner KU. Generering av en betinget knockout-allel for Janus kinase 2 (Jak2) genet i mus. 1. Mosebok (2004) 40:52–7. doi: 10.1002/gene.20063

18. Eckelhart E, Warsch W, Zebedin E, Simma O, Stoiber D, Kolbe T, et al. En ny Ncr1 -Cre-mus avslører den essensielle rollen til STAT5 for overlevelse og utvikling av NK-celler. Blood (2011) 117:1565–74. doi: 10.1182/blod-2010-06-291633

19. Cui Y, Riedlinger G, Miyoshi K, Tang W, Li C, Deng C, et al. Inaktivering av Stat5 i musebrystepitel under graviditet avslører distinkte funksjoner i celleproliferasjon, overlevelse og differensiering. Mol Cell Biol. (2004) 18:8037–47. doi: 10.1128/MCB.24.18.8037-8047.2004

20. Cerwenka A, Baron JL, Lanier LL. Ektopisk ekspresjon av retinsyre tidlig induserbart-1 gen (RAE-1) tillater naturlig drepercellemediert avvisning av en MHC klasse I-bærende tumor in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. (2001) 98:11521–6. doi: 10.1073/pnas.201238598

21. Putz E, Gotthardt D, Hoermann G, Csiszar A, Wirth S, Berger A, et al. CDK8-mediert STAT1-S727-fosforylering begrenser NK-celles cytotoksisitet og tumorovervåking. Cell Rep. (2013) 4:437–44. doi: 10.1016/j.celrep.2013.07.012

22. Geiger TL, Sun JC. Utvikling og modning av naturlige drepeceller. Curr Opin Immunol. (2016) 39:82–9. doi: 10.1016/j.coi.2016.01.007

23. Sojka DK, Plougastel-Douglas B, Yang L, Pak-Wittel M, Artyomov MN, Ivanova Y, et al. Vevsresidente naturlige drepeceller (NK) er cellelinjer som er forskjellige fra thymus og konvensjonelle milt-NK-celler. Elife (2014) 3:e01659. doi: 10.7554/eLife.01659

24. Peng H, Jiang X, Chen Y, Sojka DK, Wei H, Gao X, et al. Leverboende NK-celler gir adaptiv immunitet ved hudkontaktbetennelse. J Clin Invest. (2013) 123:1444–56. doi: 10.1172/JCI66381

25. Martinet L, Ferrari De Andrade L, Guillerey C, Lee JS, Liu J, Souza-Fonseca Guimaraes F, et al. DNAM-1-uttrykk markerer et alternativt program for NK-cellemodning. Cell Rep. (2015) 11:85–97. doi: 10.1016/j.celrep.2015. 03.006

26. Macchi P, Villa A, Giliani S, Sacco MG, Frattini A, Porta F, et al. Mutasjoner av Jak-3-genet hos pasienter med autosomal alvorlig kombinert immunsvikt (SCID). Nature (1995) 377(6544):65–8.

27. Russell SM, Tayebi N, Nakajima H, Riedy MC, Roberts JL, Aman MJ, et al. Mutasjon av Jak3 hos en pasient med SCID: essensiell rolle for Jak3 i lymfoid utvikling. Science (1995) 270:797-800.

28. Gotthardt D, Putz EM, Grundschober E, Prchal-Murphy M, Straka E, Kudweis P, et al. STAT5 er en nøkkelregulator i NK-celler og fungerer som den molekylære vekslingen fra tumorovervåking til tumorfremme. Kreft Oppdag. (2016) 4:414–29. doi: 10.1158/2159-8290.CD-15-0732

29. Villarino AV., Sciumè G, Davis FP, Iwata S, Zitti B, Robinson GW, et al. Undergruppe- og vevsdefinerte STAT5-terskler kontrollerer homeostase og funksjon av medfødte lymfoide celler. J Exp Med. (2017) 214:2999–3014. doi: 10.1084/jem.20150907

30. Marçais A, Viel S, Grau M, Henry T, Marvel J, Walzer T. Regulering av mus NK-celleutvikling og funksjon av cytokiner. Front Immunol. (2013) 4:450. doi: 10.3389/fimmu.2013.00450

31. Kennedy MK, Glaccum M, Brown SN, Butz EA, Viney JL, Embers M, et al. Reversible defekter i naturlig morder og CD8 T-cellelinjer i hukommelse i interleukin-15-mangelfulle mus. J Exp Med. (2000) 191:771–80. doi: 10.1084/jem.191.5.771

32. Ikemizu S, Chirifu M, Davis SJ. IL-2 og IL-15 signalkomplekser: forskjellige, men like. Nat Immunol. (2012) 13:1141–2. doi: 10.1038/ni.2472

33. Williams NS, Klem J, Puzanov IJ, Sivakumar PV, Schatzle JD, Bennett M, et al. Naturlig drepende celledifferensiering: innsikt fra knockout og transgene musemodeller og in vitro-systemer. Immunol Rev. (1998) 165:47-61.

34. Lodolce JP, Boone DL, Chai S, Swain RE, Dassopoulos T, Trettin S, et al. IL-15-reseptor opprettholder lymfoid homeostase ved å støtte lymfocyttsøking og proliferasjon. Immunity (1998) 9:669-76.

35. Park SY, Saijo K, Takahashi T, Osawa M, Arase H, Hirayama N, et al. Utviklingsdefekter av lymfoide celler i Jak3 kinase-mangelfulle mus. Immunity (1995) 3:771-82.

36. Robinette ML, Cella M, Telliez JB, Ulland TK, Barrow AD, Capuder K, et al. Jak3-mangel blokkerer medfødt lymfoid celleutvikling. Slimhinneimmunol. (2017) 1:50–60. doi: 10.1038/mi.2017.38 37. Abdulghani J, Allen JE, Dicker DT, Liu YY, Goldenberg D, Smith CD, et al. Sorafenib sensibiliserer solide svulster for Apo2L/TRAIL- og Apo2L/TRAIL-reseptoragonistantistoffer ved Jak2-Stat3-Mcl1-aksen. PLoS ONE (2013) 8:e75414. doi: 10.1371/journal.pone.0075414

38. Sathe P, Delconte RB, Souza-Fonseca-Guimaraes F, Seillet C, Chopin M, Vandenberg CJ, et al. Medfødt immunsvikt etter genetisk ablasjon av Mcl1 i naturlige drepeceller. Nat Commun. (2014) 5:4539. doi: 10.1038/ncomms5539

39. Keil E, Finkenstädt D, Wufka C, Trilling M, Liebfried P, Strobl B, et al. Viktig stillasfunksjon av Janus kinase 2 avdekket av en ny musemodell som inneholder en Jak2 aktiveringsløkkemutasjon. Blood (2014) 123:520–9. doi: 10.1182/blod-2013-03-492157