Mitokondriell membranstabilisering av Angelica Sinensis polysakkarid i murin aplastisk anemi

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Abstrakt

For å undersøke mekanismen for mitokondriell membranstabilisering av Angelica Sinensis polysakkarid (ASP) i murin aplastisk anemi (AA) ICR ble mus tilfeldig delt inn i kontroll. AA- og ASP-behandlede grupper AA-gruppemusene ble behandlet med 60Co Y og intraperitoneale injeksjoner av cyklofosfamid og kloramfenikol. Kontrolldyrene ble behandlet med blyskjermende bestråling og saltvannsinjeksjon. De behandlede AA-musene ble matet med ASP i 2 uker. Mitokondriell ultrastruktur av benmargen ble observert ved transmisjonselektronmikroskopi, og transmembranpotensialet til benmargskjerneholdige celler (BMNC) ble undersøkt ved fluorescensspektrofotometri. Cox- og MDH-innholdet i mediet ble også studert i de tre gruppene. Mitokondrienummeret og transmembranpotensialet til BMNC i benmargen sank i AA-gruppen sammenlignet med kontrollgruppen, men ble forbedret i den ASP-behandlede gruppen sammenlignet med AA-gruppen. Fullstendig mitokondriell spaltning i den ASP-behandlede gruppen ble betydelig forsinket (P< 0.05)="" as="" compared="" to="" the="" aa="" group.="" we="" conclude="" that="" asp="" might="" improve="" mitochondrial="" membrane="" stabilization,="" and="" suppress="" the="" downregulation="" of="" transmembrane="" potential="" and="" apoptosis="" of="" bmnc="" in="">

Nøkkelord: aplastisk anemi, Angelica Sinensis polysakkarid, mitokondrier, membranpotensial, ICR-mus

cistanche-ekstrakt: øker beindannelsen og øker bentettheten

Bakgrunn

Aplastisk anemi (AA) er en blodsykdom der benmargen og de tilhørende blodstamcellene er skadet og forårsaker mangel på røde blodceller, hvite blodceller og blodplater. Disse manglene er individuelt kjent som henholdsvis anemi, leukopeni og trombocytopeni, og samlet kjent som pancytopeni. Eksponering for kjemikalier, medikamenter, stråling, radioaktive materialer, strålingsproduserende enheter, infeksjon. immunsykdommer, arv (i 50 prosent av tilfellene) og ukjent etiologi kan også føre til utvikling av AA.

Mitokondrier anses å være "cellens kraftverk" fordi de produserer adenosintrifosfat (ATP) ved systematisk å trekke ut energi fra næringsmolekyler (substrater)[1]. Dessuten replikeres mtDNA med høy mutasjonshastighet siden den mangler beskyttende histoner og et effektivt DNA-reparasjonssystem. Mutasjoner i mtDNA er assosiert med hematologiske sykdommer som ervervet sideroblastisk anemi, myelodysplastiske syndromer og ervervet AA [2-4]. Vår forrige studie 5] viste at funksjonell svekkelse av den mitokondrielle respirasjonskjeden indusert av mutasjoner kan være involvert i hematopoietisk svikt hos AA-pasienter. Uavhengig av de morfologiske trekk ved celledød i sluttstadiet (apoptotisk, nekrotisk, autofagisk eller mitotisk), er mitokondriell membranpermeabilisering (MMP) ofte den avgjørende hendelsen mellom overlevelse og død [6]

I følge tradisjonell kinesisk medisin hjelper Angelica Sinensis med å forene blodet og fremme dets sirkulasjon [7]. Nyere studier har vist at ekstrakter av Angelica Sinensis har antioksidative og nevrobeskyttende effekter [8,9]. Imidlertid er den antioksidative funksjonen til ASP fortsatt uklar. Denne studien undersøkte den tidlige celleskaden ved å bruke den mitokondrielle lyseringstidskurven og den mitokondrielle membranstabiliserende effekten av ASP i AA.

cistanche-tilskudd øker bentettheten og øker beindannelsen

Materialer og metoder

Gruppering av dyr

Friske ICR-hannmus som veide 18-22 g, i alderen 6-8 uker, ble levert av Experimental Animal Center ved Shandong University (Kina). Dyrene ble holdt i et varmt, rolig miljø med fri tilgang til mat og vann. og akklimatiserte seg i en uke før forsøkene startet.

Musene ble tilfeldig delt inn i tre grupper: henholdsvis normal gruppe, AA-gruppe og behandlet gruppe. Den aplastiske anemimodellen ble generert som tidligere beskrevet [10].

Kort fortalt ble musene bestrålt med 2.0Gy 60Coy og deretter behandlet med daglige intraperitoneale injeksjoner av 40 mg/kg/dag cyklofosfamid og 50 mg/kg/dag kloramfenikol i de neste tre dagene. Den behandlede gruppen ble intragastrisk matet med ASP (200 mg/kg/d, ifølge Chinese Medical Dictionary). Kontrollgruppen og AA-gruppemusene ble intragastrisk matet med fysiologisk saltvann (10 ml/kg/d) kosttilskudd. Videre fikk alle mus en standard diett under studien. Etter behandling med ASP eller fysiologisk saltvann i 2 uker, ble musene ofret ved cervikal dislokasjon.

Hematologisk undersøkelse

Haleblodprøvene fra de tre gruppene ble samlet på henholdsvis den første og fjortende dagen. WBC og blodplater ble talt i de perifere blodprøvene, og Hb-nivåer ble bestemt. Etter fullføring av eksperimentene ble musene ofret og lårbensutstryk ble forberedt for differensiell telling av benmargskjerneholdige celler (BMNCs) (Figur 1).

Transmisjonselektronmikroskopi

Lårmargen ble smurt ut og skåret i ultratynne snitt. Mitokondrier av hematopoietiske celler i lårmargen ble analysert og talt ved transmisjonselektronmikroskopi (JEM-2000EX, Japan) under 50 synsfelt.

Mitokondriell lyseringstidskurve

Mitokondrier ble ekstrahert fra murine BMNCs i henhold til produsentens protokoll for mitokondrierisolasjonssettet (Pierce Biotechnology Inc., USA). Konsentrasjonen av monoaminoksidase (MAO) indikerer konsentrasjonen av mitokondrier og ble bestemt ved bruk av 200U/ml mitokondriesuspensjoner fra 20 serumkulturer, innen 12 timer på forskjellige tidspunkter (30 minutters intervaller). Innholdet av cytokromoksidase (Cox) og malatdehydrogenase (MDH) i mediet ble også bestemt. Topptidsanalysen av mitokondriell membran og matrisespesifikke enzymkonsentrasjon-tidskurver viste omfanget av mitokondriell membranlyse.

Mitokondriell membranpotensial

Etter pre-inkubering med MAO eller ASP ble de isolerte mitokondriene fra de tre gruppene resuspendert i 0,5 ml fosfatbufret saltvann (Wuhan Boster Biotechnology, Ltd., Kina) og 10 ul rhodamine 123 arbeidsløsning ( Sigma-Aldrich, USA) ble tilsatt og inkubert ved 37 grader C i 5 prosent CO2 i 15 min. Mitokondriell membranpotensial ble analysert ved flowcytometri ved bruk av en eksitasjonsbølgelengde på 490 nm og en emisjonsbølgelengde på 520 nm.

Statistisk analyse

Statistisk analyse ble utført med SPSS 19.0-programvare. Data er uttrykt som gjennomsnitt og standardavvik. Elevens t-test ble brukt for å sammenligne de ulike gruppene. P < 0.05="" ble="" ansett="" for="" å="" være="" statistisk="">

cistanche urt: for bedre beinkvalitet

Resultater

Perifert blod og BMC-teller

Ved å bruke en helautomatisk blodcelleanalysator ble antallet perifere blodceller og BMC i AA-musene funnet å være betydelig redusert (P<0.05), indicating="" that="" the="" aa="" mouse="" model="" was="" successfully="" established="" (table="">

Mitokondriell ultrastruktur hos aplastisk anemimus

Transmisjonselektronmikroskopi av benmargen til AA-mus viste at den mitokondrielle ultrastrukturen ble betydelig forbedret med ASP i den behandlede gruppen (tabell 2 og figur 1), noe som indikerer at ASP stabiliserer mitokondriene i AA-mus. Størrelsen og formen på mitokondriene til kontrollgruppen var normal. I motsetning. mitokondriene til AA-gruppen hadde forstørrede kulestrukturer, sammen med avbrudd eller forsvinning av cristae (figur 1A-C).

Mitokondriell membranpotensial (MMP) i aplastisk anemi-mus

Ettersom transmisjonselektronmikroskopi avslørte mitokondriell skade, bestemte vi effekten av ASP på MMP i AA-mus ved å måle de relative forskjellene i fluorescensen til Rh 123 blant de tre gruppene ved å bruke et fluorescensspektrofotometer.

Resultatene viste at Rh 123-fluorescensen til benmargsceller i AA-gruppen (19,6±3,03) var lavere enn i kontrollgruppen (31,7±2,59, P<0.0). however,="" the="" rh="" 123="" fluorescence="" of="" the="" asp-treated="" aa="" group="" was="" higher="" than="" that="" in="" the="" aa="" group=""><0.0i)(table 2="" and="" figure="" 2),="" indicating="" that="" asp="" facilitated="" the="" recovery="" of="" the="" mmp="" in="" aa="">

Tidskurve for tidlig celleskade mitokondriell lysis

I kontrollgruppen tok innholdet i mitokondriell in vitro-kultur Cox og MDH 3,5 timer å nå toppen. MAO-innholdet i kulturen endret seg ikke nevneverdig over tid, men innholdet av COX og MDH økte gradvis med tiden, nådde en topp og avtok deretter gradvis. Dermed tok det fullstendige mitokondrieinnholdet frigjort av celler omtrent 3,5 timer å nå spaltningstoppen.

COX- og MDH-toppene i AA-gruppen viste seg ved henholdsvis 1,5 timer, 1,375 U/, 36,732 U/l. COX- og MDH-toppene i den behandlede gruppen viste seg ved henholdsvis 5,5 timer, 6,5 timer, 1,341 U/l, 33,994 U/. To sett med data på hvert tidspunkt ble brukt til statistisk analyse. Etter 1,5 time var COX- og MDH-nivåene i AA-gruppen signifikant høyere enn i den behandlede gruppen (P < 0.05).="" derfor="" ble="" fullstendig="" mitokondriell="" spaltning="" i="" serumet="" betydelig="" forsinket="" etter="" tilsetning="" av="" asp="" (p="">< 0,05),="" med="" en="" liten="" reduksjon="" i="" toppen="" (figur="">

Diskusjon

Aplastisk anemi (AA) er et benmargssviktsyndrom preget av perifer pancytopeni og marghypoplasi. Mutasjoner og ustabilitet av mtDNA er påvist ved flere sykdommer. Mitokondriell dysfunksjon og en reduksjon i antall mitokondrier kan føre til reduksjon av mtDNA. Ervervede delesjoner av mtDNA i det hematopoietiske avdelingen har vist seg å forekomme ved alvorlig pancytopeni og retikulocytopeni [11]. Basert på vår tidligere forskning [5], undersøkte vi om ASP kan stabilisere mitokondriemembranen til AA-mus.

Angelica Sinensis polysaccharide-iron complex (APIC) har ikke bare en overlegen terapeutisk effekt på IDA, men også på å supplere blod og fremme blodsirkulasjonen [12]. ASP kan være nyttig for behandling av sykdommer indusert av hepcidin-overekspresjon ved å forhindre Janus-kinase (JAK), sønn av mødre mot ekstracellulær decapentaplegi (SMAD) og 1signalregulert kinase (ERK)-veier for å nedregulere hepcidin-ekspresjon i IDA-rotter [13 ]. Qin J fant at ASP kan forbedre proteoglykansyntese (PG) av kondrocytter i rotte OA-modell in vivo og IL-1B-stimulerte kondrocytter in vitro ved å fremme ekspresjonen av aggrecan og GTs involvert i PG-syntese [14].

I vår studie ble AA-musemodellen indusert av en kombinasjon av acetylfenylhydrazin, røntgenstråler og cyklofosfamid. AA-musene viste statistisk signifikante reduksjoner i perifere blodleukocytter, Hb og blodplater (tabell 1), og alvorlige reduksjoner i humerusmargceller og margforpliktede stamceller, som er kliniske kjennetegn ved AA. AA-musene behandlet med ASP viste en progressiv økning i BM-celler sammenlignet med AA-gruppen. I tillegg ble antallet mitokondrier i de hematopoietiske cellene også påvirket. ASP resulterte i et betydelig høyere antall mitokondrier i den behandlede gruppen sammenlignet med AA-gruppen (figur 1). Disse resultatene viste at ASP kunne fremme spredning av margkjernede celler, øke antallet mitokondrier og stabilisere mitokondriell membran i AA-mus.

Mitokondriell skade gjenspeiles av mtDNA-skade og en nedgang i nivåene av mtRNA-transkripsjoner, proteinsyntese og mitokondriell funksjon, noe som kan resultere i redusert cellulær energi, forstyrrelse av cellesignalering og interferens med cellulær differensiering og apoptose. Videre kan mangelfull mitokondriell ATP-produksjon fremme kromosomal ustabilitet [15]. Siden mtDNA koder for komponenter i fire av fem mitokondrielle respiratoriske komplekser, resulterer endringer i mtDNA i mitokondriell sykdom [16-18]. Bortsett fra mitokondriell sykdom, er mutasjoner i mtDNA knyttet til kreft, diabetes. hjerte- og karsykdommer. nevrodegenerative lidelser, hematologiske sykdommer som leukemi samt den normale aldringsprosessen [19]. Viktigere er at mtDNA-mutasjoner, så vel som en reduksjon i mtDNA-kopiantall, kan være patogene [20, 21]. Å forstå cellulære mekanismer for vedlikehold av mtDNA-integritet og kopiantall er av største betydning siden det kan gi mål for kliniske intervensjoner rettet mot forebygging og behandling av hematologiske sykdommer som AA. Disse faktorene kan også resultere i redusert energimetabolisme, noe som vil påvirke selvfornyelsen og differensieringen av de hematopoietiske stamcellene.

Funnene i denne studien viser at ASP kan forbedre mitokondriell ultrastruktur, og undertrykke nedreguleringen av transmembranpotensial og apoptose av myeloide elementer for å kurere benmargssvikt.

Cistanche- og cistancheekstrakt: passer til bein

Referanser

1 Chinnery PF, Schon EA. Mitokondrier. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2003, 74: 1188-1199.

2. Gattermann N. Mitokondrielle DNA-mutasjoner i det hematopoietiske systemet. Leukemi 2004,18:18-22.

3. Gattermann N, Retzlaff S, Wang YL, et al. Heteroplasmatiske punktmutasjoner av mitokondrielt DNA som påvirker subenhet I av cytokrom c-oksidase hos to pasienter med ervervet idiopatisk sideroblastisk anemi.Blood 1997,90:4961-4972.

Kim HR, Shin MG, Kim MJ, et al. Mitokondrie

4. DNA-aberrasjoner av benmargsceller fra pasienter med aplastisk anemi. Korean Med Sci 2008, 23:1062-1067. X Cui, JO Wang, ZG Cai, et al. Komplett sekvens

5. analyse av mitokondrielt DNA og telomerlengde ved aplastisk anemi.Int J Mol Med 2014.34:1309-1314.

6. Chiu TL, Su CC. Tanshinone IA induserer apoptose i humane lungekreft A549-celler gjennom induksjon av reaktive oksygenarter og redusere mitokondriemembranpotensialet. Int J Mol Med 2010,25:231-236.

7. Liu PJ. Hsieh WT. Huang SH, et al. Hematopoietisk effekt av vannløselige polysakkarider fra Angelica Sinensis på mus med akutt blodtap. Exp Hematol 2010, 38: 437-445.

8. Kuang X, Yao Y, Du JR, et al. Nevroprotektiv rolle 8F av Z-ligutilide mot iskemisk skade i forhjerne hos ICR-mus. Brain Res 2006,1102:145-153.

9. Xin J.Zhang J. Yang Y, et al. Radi Angelica Sinensis som inneholder komponenten Z-ligutilide fremmer nevrogenese hos voksne for å mediere utvinning fra kognitiv svikt Curr Neurovasc Res 203, 10:304-315.

10. Chen YF, Wu ZM, Xie C, et al. Uttrykksnivå av IL-6 utskilt av benmargsstromaceller i mus med aplastisk anemi.ISRN Hematol 2013:986219.

11. Hatfill SJ, LaCock CJ, Laubscher R, et al. Arole for mitochondrial DNA in the pathogenesis of radiation-indused myelodysplasia and secondary leukemia.Leuk Res 1993,17:907-913.

12. Wang PP, Zhang Y, Dai LQ, et al. Effekt av Angelica Sinensis polysakkarid-jernkompleks på jernmangelanemi hos rotter. Chin J Integr Med 2007, 13:297-300.

13. Zhang Y, Cheng Y, Wang N, et al. Virkningen av JAK, SMAD og ERK signalveier på hepcidinundertrykkelse av polysakkarider fra Angelica Sinensis hos rotter med jernmangelanemi. Matfunksjon2014.5: 1381-1388.

14. Qin J, Liu YS, Liu J, et al. Effekt av Angelica Sinensis polysakkarider på slitasjegikt in vivo og in vitro: en mulig mekanisme for å fremme proteoglykansyntese. Evid-basert komplement Alternat Med 2013,79476.

15. Gattermann N. Mitokondrielle DNA-mutasjoner i det hematopoietiske systemet. Leukemi 2004,18:18-22.

16. Holt IJ, Harding AE, Morgan-Hughes JA. Sletting av muskelmitokondrielt DNA hos pasienter med mitokondrielle myopatier. Nature 1988, 331:717-719.

17. Lestienne P, Ponsot G Kearns-Sayre syndrom med muskelmitokondriell DNA-sletting. Lancet 1988, 1:885.

18. Wallace DC, Singh G, Lott MT, et al. Mitokondriell DNA-mutasjon assosiert med Lebers arvelige optiske neuropati.Science 1988,242:1427-1430.

19. Wallace DC. Et mitokondrielt paradigme av metabolske og degenerative sykdommer, aldring og kreft: en daggry for evolusjonsmedisin. Annu Rev Genet 2005, 39: 359-407.

20. Clay Montier LL, Deng JJ, Bai Y. Antall har betydning: kontroll av pattedyrmitokondriell DNA-kopinummer. J Genet Genomics 2009,36:125-131.

21. Rötig A, Poulton J. Genetiske årsaker til uttømming av mitokondriell DNA hos mennesker. Biochim Biophys Acta 2009,1792:1103-1108.

cistanche-ekstrakt: øker beindannelsen og øker bentettheten