Multifaktoriell seroproiling dissekerer bidraget fra allerede eksisterende menneskelige koronavirusresponser på SARS-CoV-2-immunitet (del 2)

Ta kontakt for mer infodavid.wan@wecistanche.com

Vedtak av tidsmessig antistoff dynamikk av ABCORA ser-oprofiling.  Kryss-seksjonertanalyse av antistoffreaktivitet etter SARS-CoV-2diagnose ved RT-PCR (N = 369) ogetter debut avsymptomer (N = 333) understreket de kapasitet av ABCORA ser- oprofiforsøke å dissekere utbruddet, toppen og avtakelsen av SARS-CoV-2 antistoff svar (Fig. 5a, b, tilleggsfigur 11). Hos enkeltpersoner med a kjent Dato av fiførst SARS-CoV-2 RT-PCR-diagnose eller begynnelse av symptomer, oppdager ABCORA 2.3utg tidlig serokonverter-sjon i 98 prosent (48av 49) og100 prosent (9av 9) av enkeltpersoner innenfor7 dager henholdsvis post-RT-PCR og symptomdebut. I tillegg IgM og IgA-reaktivitet, IgG-responser var lett påviselige i ABCORA 2.0 etter noen dager med infeksjon (tilleggntærFig. 11a).

Langsgående vurdering av et årskullav rekonvalesent pasienter opptil  11  måneder etter infeksjon (251 målinger på 120 pasienter)  fremhevetdetidsmessigdynamikkav SARS-CoV-2 bindende antistoffer. Vi estimerte forfallet of bindende reaktivitet ansette akraft lov blandet modell og identifisert en betydelig reduaksjon i RBD, S1, og N i alle Ig undertyper (Fig. 5b) medhalveringstider varierer fra 67 til 404 dager, med IgG N-titere som forfaller raskest,ilinjemedtidligere   rapporter10.   Halv-boravde nøytralisasjon relevant IgG svar til RBD og S1 var 125 og 404 dager, henholdsvis. Interessant, kinetikken til nøytralisering antistoffer gjorde ikke speil de forfall priser observert for binding antistoffer. Nøytraliseringsaktiviteten avtok overall på a langsommerevurdere, med a halv-levetid på 991 dager (fig.5c). Dette var delvis på grunn av enblandetreaktivitetmønstermednoenenkeltpersonerviseranøke i nøytralisering aktivitet post positivt SARS-CoV-2 RT- PCR5, mens nøytraliseringsaktiviteten i andre falt raskt (Supplerende Fig. 11c).

Effekter av HCV immunitet på SARS-CoV-2 oppkjøp. Til

muliggjøre en undersøkelse av gjensidig avhengighet mellom pre-existing immenhet til HCoV og SARS-CoV-2 infeksjon, vi utvidet deABCORA perle antigen array til inkludere S1 proteiner av alle fire sirkulerer  HCoVs  (HCV-NL63,  HCV-229E, HCV-HKU1,HCV-OC43) (suutfyllende Fig. 12a). I henhold til det erkapasitet til Observere antistoffer til five koronavirus, vi kalt analysen ABCORA 5.0 og trent og validert den på de sammekohorter som ABCORA 2.0 (Fig. 1). For å tillate direkte sammenligning med ABCORA 2.0 ogdebruk av nøytraliseringsprediksjonsmodellene, vibrukt de terskel-/SOC-baserte analyseinnstillinger for ABCORA 2.0 også til ABCORA 5.0. Basert på ABCORA 5.0 målinger av opplæring kohorter I–III, vi utviklet to tilfeldig skog-basert analyse modeller. ANCORA 5.4 inkludert utelukkende de 12 SARS-CoV-2 parametere, og ABCORA 5.5 inkludererd iaddisjon de  S1  HCoV målinger legger til opptil 24 parametere totalt. I analogi medABCORA 2.3, innlemmelse av HCV reaktivitet inn i de modellvar fordelaktig. ANCORA 5.5 ga den høyeste følsomheten ogspesfiby blant de analyse algoritmer sondert ABCORA 5.0 (Supplerende Fig. 12b, tilleggstabell 10).

Gjensidige avhengigheter mellomantistoff  reaktivitet  til  de  fire HCoV og SARS-CoV-2 speilet hva vi tidligere observert

til HKU1 med a særlig høy sammenheng av IgM reaktivitet av

SARS-CoV-2 og HCoVs i pre-pandemi enkeltpersoner, spesielt idemednylig  HCV  infeksjon  (SupplerendeFig. 13). HCV-infeksjoner er hyppige, men underlagt sesongvariasjonerogdeutbredelse av individuell HCV infeksjoner luktuerer41,42. På linje med dette, prevalensen av HCV-responser målt av ABCORA 5.0 i lokale blod givere i januar 2019 (N = 285), Kan  2019   (N=288) og januar 2020 (N=252) variertemye  (Fig. 6). Til muliggjøre a tid-kontrollert sammenligning av HCV reaktivitet mellom SARS-CoV-2-smittet og sunne givere, vi skjermet blod givere fra Kan 2020  (N = 672), når SARS-CoV-2 utbredelse var anslått under 2 prosent i Zürich, Sveits43, av ABCORA 2.{{0}}/5.0 og ekskluderte alle prøver med SARS-CoV-2 reaktivitet. De gjenværende Kan 2020kohort (N=653)formet a pandemi, sunn giver styre gruppe. Interessant nok,HCV-reaktivitetsmønstre i 2019 og 2020 forskjelligered vesentlig som vurdert av en-vei ANOVA, med januar 2020 som viserforholdsvis lavest og Kan 2020 de høyest IgA og IgGreaktivity, hvilken kan indikerer a seinere begynnelse av an HCV epidemi i 2020 sammenlignet med 2019 (t-tester fra mai 2020 versus andre grupper shvordan i Fig. 6).

Mest spennende er en tidstilpasset analyse comparing Kan2020 friske givere med SARS-CoV-2-positive pasientprøverlutgi enpril, Kan, og juni 2020 (N = 65) avslørt signifiskrått NedreHCV reaktivitet i SARS-CoV-2 positivt pasienter (Fig. 7a). Dette mønster var også tydelig når vi utvidet analysen til å omfatte defullkohortav SARS-CoV-2  infiserte individer måltmed  ABCORA  5.0 (N=389, samplet fra mars 2020 tilfebruar  2021,  Supplerende  Fig. 14). Samlet sett disse resultatene idicated at pre-eksisterende immun svar til HCoVs kan til a en viss grad beskytte mot SARS-CoV-2-infeksjonipå.

Klikk her for å lære mer om Cistanche

Fig. 5 Overvåkning tidsmessig utvikling av antistoff svar. an ABCORA 2.3 definisjon av seropositivitet i givere med positivt RT-PCR bekreftet SARS- CoV-2-infeksjon og kjent RT-PCR-dato (N = 369). Seropositivitet vurderingOm plasma prøvetaking tid punktetter diagnose er avbildet. Grå skyggelagt område høydepunkter de først syv dager siden positivt RT-PCR gjenkjenning. bKraft lov modell, med tid siden RT-PCR som fikset effekt og individuell som en tilfeldig effekt, estimerer de forfall av antistoffbindingsaktivitet basert på ABCORA 2.0 målinger ved 1–4 longitudinelle tidspunkter hos 120 individer totalt251 målnts. Lilla linjer tilsvare til de modellens anslag oglilla-skygget områder til de95 prosentselvtillit intervaller. Antistoff halv-bor (t1/2 på dager) fra betydelige modeller er avbildet. Betydning var vurdert ved hjelp av Satterthwaite tilnærming til a to-sidestilt t-test på de skråningen parametere. c Makt-lov modell, med tid siden RT-PCR som fikset effekt og individuell som a tilfeldig effekt, estimerer de forfall av nøytraliserende kapasitet på 251målinger fra 120 enkeltpersoner. Bare enkeltpersoner med NT50 > 100på deres først mål var brukt til anslag de halv-liv. De lilla linje tilsvarer til de modell anslag og de lilla skyggelagt område til de95 prosentselvtillit intervaller. Betydning var vurdert ved hjelp av Satterthwaite tilnærming til a to-sidestilt t-test på de skråningen parametere.

Fig. 6 Sesongbestemt og årlig fluktuasjon i HCV reaktivitet. Reaktivitet til menneskelig koronavirus (HCV-NL63, HCV-229E, HCV-HKU1, HCV-OC43)var sammenlignet av ABCORA 5.0. Reaktivitet i sunn blod givere fra 2019 og 2020 var sammenlignet. Pre-pandemi prøver inkludert: januar 2019 (N = 285), Kan 2019 (N = 288), januar 2020 (N = 252). Prøver fra Kan 2020 (N = 672) var samlet inn under de pandemi i Sveits. Kun prøver uten SARS-CoV-2 spesifikk reaktivitet som definert av ABCORA var inkludert (N = 653). Stjerner tilsvare til nivåer av betydning av to-sidet t-tester sammenligne de angitt grupper. Nivåer av betydning er rettet opp av de Bonferroni metode til flere testing og angitt som følger:        *p< 0.05/36, **p < 0.01/36,="">p< 0.001/36.Boxplots representere de følgende: median med de midten linje, øverste og Nedre kvartiler med de eske grenser, 1.5x interkvartil områder med de værhår, og uteliggere med poeng.

Effekter av  HCV  immunitet i  SARS-CoV-2  infeksjon.  Til

utforske gjensidige avhengigheter med HCV-immunitet videre, vi nextundersøkt om HCV svar er koblet til evolusjonenav SARS-CoV-2 antistoffer. Til dette til slutt analyserte vi antistoffresponser i plasma fra 204 individer som ble tatt prøver medi 60 dager etter SARS-CoV-2diagnose ved hjelp av en lineær regresjonsmodell justert for alder, kjønn og tid siden positiv RT-PCR og HCVreaktivitet. Til stratifisere HCoV reaktivitet inn i høy og lav HCoV-aktivitet, medianlogg MFI-FOE var defined til Hver HCV ogantistoffklasse. LogMFI-FOE høyere enn tilsvarendemedian for minstt tre HCoVs (HKU1, OC43, NL63, eller 229E) i en spesifikasjonc Ig klasse var rangert som å ha høy HCV aktivitetinnenfor denne klassen. For det første bare reaktivitet blant samme antibodyklasse were utforsket i de modell (i.e., HCV IgG høy på SARS- CoV-2 IgG). Vi observerte unntakllysterkgjensidige avhengigheter til IgA og IgM svar til SARS-CoV-2, somallevarsignifiskråtthøyereienkeltpersonermedhøy HCVreaktivitet (Fig. 7b). Dette antyder sterkt at allerede eksisterende HCV immunitet kan gie an fordel i montering SARS-CoV-2 svar.Gjensidige avhengigheter mellom HCV IgG og SARS- CoV-2  spesifikk IgG ble bare observert for S2-responsen. Spennende, støtter dette funnet, HCV S2 helper svarvar nylig funnet til øke SARS-CoV-2 immunitet, ibestemt S2 antistoffaktivitet31. For å undersøke om SARS-CoV-2 IgG kanbygge på nylig HCV IgA og IgM svar vi neste sondertom HCV IgM og IgA er knyttet til elevated SARS-CoV-2 spesfic  IgGnivåer.Selv om ingen effekt var tydelig for IgM, vi observerte et tegnifikan ikke assosiasjon av høy HCV IgA aktivitet påallefiremålt  SARS-CoV-2  svar  (Fig.  7c,  d). Dette foreslår sterktatnylig  HCV  infeksjon hara beneficial effekt på montering av SARS-CoV-2 antistoffresponsses.

I de neste analyse, vi sondert hvis pre-eksisterende HCV immunitethar an innvirkning på sykdommens alvorlighetsgrad i covid- 19. Til dette formål, visondert HCoV immunitet i 80 innlagt på sykehus og ikke-innlagtenkeltpersoner smittet til mindre enn 30 dager (fig.8en). Kontrollere for alder og kjønn, fant vi at personer med high pre-eksisterende HCV-reaktivitet hadde signifikantantlyNedre  DDStilkreversykehusinnleggelse  (logistikkregresjon  ELLER = 0.16, 95 prosent CI (0.04, 0.67), fig.8b, Supplerende Fig. 15). En ytterligere stratifikation avppasienter av om de nødvendig behandling på an ICU viste a redusert sannsynlighet for at pasientents med høy HCoV respons priser som kreves sykehusinnleggelse med intensiv omsorg (ordinær regresjonELLER {{0}}.36, 95 prosent CI (0. 13, 0.96), fig.8b, SupplerendeFig. 15). Og dermed, enkeltpersoner med høy HCoV nivåer hadde a 64 prosent senket odds av å kreve sykehusinnleggelse ihtdinal rang regresjonsanalyse sammenligne innlagt på sykehus i regelmessig avdelinger, i ICU, ogikke-innlegged enkeltpersoner   (Fig.  8a,  b).   Samlet sett,  disse observasjoner tyder sterkt på en kryssbeskyttende effektof HCVimmunitet for å forme immunforsvaret mot SARS-CoV-2.

Fig. 7 Effekter av pre-eksisterende HCV immunitet under SARS-CoV-2 oppkjøp. a Tid-matchet sammenligning av ABCORA 5.0 reaktivitet til SARS-CoV-2og HCoVs i sunn og SARS-CoV-2 smittet enkeltpersoner. Sunn givere var samplet i Kan 2020 (N = 653; blå). Plasma fra SARS-CoV-2     infisert individs var samlet inn mellom april–juni 2020 (N = 65; rød). Se Supplerende Fig. 14 tilananalyse av de full SARS-CoV-2 positivt kohort(N = 389). Grå esker indikerer verdier ovenfor de individuell MFI-FOE skjære-offs til SARS-CoV-2 spesifikk svar til Hver antigen. Stjerner tilsvare til nivåer av betydning av to-sidestilt t-tester sammenligne negativ mot positivt pasienter. Nivåer av betydning er rettet opp av de Bonferroni metode for flere testing og angitt som følger: *p< 0.05/12, **p< 0.01/12, ***p< 0.001/12 (IgG HKU1: p = 0.66, IgG OC43: p = 0.45, IgG NL63: p=3.3 × 10−04, IgG 229E: p = 1.6 × 10−05, IgA HKU1: p=1.8 × 10−03, IgA OC43: p=1.3 × 10−05, IgA NL63: p=1.4 × 10−07, IgA 229E: p=3.0 × 10−05, IgM HKU1: s = 3.3 × 10−08, IgM OC43: p = 4.3 × 10−03, IgM NL63: p = 1.1 × 10−07, IgM 229E: p = 2.7 × 10−02). Boxplots representere de følgende: median med midten linje, øverste og Nedre kvartiler med de eske grenser, 1.5x interkvartil områder med de værhår, og uteliggere med poeng. b Lineær regresjon modeller som viser de assosiasjon mellom SARS-CoV-2 og HCV signaler i 204 SARS-CoV-2 positivt pasienter med kjent datoer av først positivt RT-PCR-deteksjon. påvirkninger innenfor de samme antistoff klasse er undersøkt. De modeller var justert på alder (spline med 3 grader av frihet), kjønn, tid siden positivt RT-PCR (spline med 3 grader av frihet), og nivå av HCoV reaktivitet. Prøver er designet til havn høy HCV reaktivitet hvis de vis ABCORA 5.0 HCVlogg MFI-FOE verdier høyere enn de tilsvarende median i på minst 3 HCoV målinger (HKU1, OC43, NL63, eller 229E). Kurver samsvarer til de modellens anslag og skyggelagt områder til de95 prosentselvtillit intervaller. p-verdier var oppnådd av løping a to-sidestilt Student t-test på parameter assosiert med HCV reaktivitet i de lineær regresjon. c Lineær regresjon modell viser de assosiasjon mellom SARS-CoV-2 IgG og HCV IgA signaler. Kurver tilsvare til de modellens anslag og skyggelagt områder til de95 prosentselvtillit intervaller. p-verdier var oppnådd av løping en to-sidestilt Student t-test på de parameter assosiert med HCV reaktivitet i de lineær regresjon. d Lineær regresjon modell viser de assosiasjonmellom SARS-CoV-2 IgG- og HCV IgM-signaler. Kurver tilsvarer modellens estimering og skyggelagte områder til 95 prosent konfidensintervaller. p-verdis var oppnådd av løping a to-sidestilt Student t-test på de parameter assosiert med HCV reaktivitet i de lineær regresjon.

Diskutereion

Definisjon av  SARS-CoV-2  immunitet etter vaksinasjon oginfeksjon er av umiddelbar betydning44–46. Dechiffrerer antikroppkorrelererav SARS-CoV-2  beskyttelseogovervåkning vaksine lydhørhet er utfordrende oppgaver fremover. Størrelsen aog lang levetid av beskyttende antistoff svar til naturlig infeksjon og forskjellig vaksiner trenge til være undersøkte til forståparametere at form beskyttende svar og veilede beslutninger om revaksinering hos ikke-respondere og immunisering igjennstroman oppstår SARS-CoV-2-varianter47. Likeledes betyr skape å serologisk skille mellom de novo infeksjon, vedrinfeksjon,og vaksine svar, deres varighet og feil vil forblicritisk til klinisk diagnose.

Her vi demonstrere de høy nytte av multi-parameter ser- oprofilering i å ta opp sentrale spørsmål i defining  SARS-CoV-2 immunitet.  Samtidiggjenkjenningav antistoffresponser på en områdeav SARS-CoV-2  antigenerogforskjellig  Igklassermed ABCORA  seroprofilinggitt et helhetlig bilde av SARS-CoV-2 serologisk status i en enkelt undersøkelse, som can være nyttig for klinisk diagnose for å bestemme e-tilstedeværelseof reinfeksjon,  definereinfeksjon,  ogsvartilvaksinasjon. Beregningsmessigmodelleringogsåtillattforutsi plasma neu-realisering kapasitet fra ABCORA resultater, aktiverer aomfattende evaluering av SARS-CoV-2 antistoff dynamikk og deres samspill medHCV svar. Vi studert to ABCORA analyseversjoner thpå både målt HCV reaktivitet ved siden av de  12 SARS-CoV-2 parametere.ANCORA 2 inkluderte S1-antigenet tilHKU1. ANCORA 5 inkludert S1 av alle fire sirkulerer HCV.Spesielt, beregningsmessig modeller at inkludert de HCVmålinger tillatt a høyere presisjon i bestemmende SARS-CoV- 2 seropositivitet, høybelysning gjensidige avhengigheter mellom HCoVog SARS-CoV-2-svar som må løses.

Innspilling reaktivitet imot alle fire HCoVs i SARS-CoV-2uinfisert ogsmittetenkeltpersonerviobservertfascinerendeforeninger. Uinfisertenkeltpersonerviseshøyere  HCVreaktivitet sammenlignet med infiserte individer som tyder påabidrag av HCV immunitet til tidlig forsvar imot SARS-CoV- 2. HCV-immunitet kan også ha positive effekter på SARS-CoV-2infeksjon. I avtale med annen rapporter, vi bemerket akryssfôring av SARS-CoV-2 og HCV-responser ved SARS-CoV-2-infeksjon31,48 med enkeltpersoner med høy HCV reaktivitet utvikle-åpning høyere SARS-CoV-2 antistoff nivåer. Mest spesielt, eksisterende HCV immunitet hadde an innvirkning på sykdom alvorlighetsgrad i vår kohort. SARS-CoV-2 smittet enkeltpersoner med lav HCV-reaktivitet hadde a høyere sannsynlighet av krever sykehusinnleggelse.

Samtidig somvårestudereutelukkende målte antistoffresponser, apotensiellbeskyttendeeffektav HCoVimmunitet mot SARS-CoV-2 oppkjøp bør ikke være Vistsombegrenset til antistoffaktivitet. Antistoffer og cellulær immunitet kan begge være relevanteog aktiv på konsert31,49–51. Alternativt reagerer antistoffsesmlettet i de tilstede studere kan utelukkende dokument nylig HCV infeksjonn og levere a surrogat mål av annen beskyttendeHCV svar. De link mellom høyere HCV  og SARS-CoV-2 reaktivitet hos infiserte individer er spesielt spennende. Den sterkeste effekter var sett til IgM og IgA HCoV svar, suggesting at nylig HCV immunitet gir an tidlig øke til SARS-CoV-2 antistoffutviklingent.  Omdetteerforfallertil kryssreaktive B-celleresponser på hvilkede  SARS-CoV-2immunitet bygger på og modnes eller om kryss-reaktive T hjelperaktiviteterspilleen dominerende rolle som foreslått31  vil være viktig til Løse i frem-kommer studier. De eksakt rolle og timing av HCoVsvarpåvirke  SARS-CoV-2  antistoffsvar også forbli til være defined. Tidlig lav-affinity HCoV-svar kan ha a positivt innvirkning på de utvikling av SARS-CoV-2 immunitet ved å danne et immunminne som til bygge, mens amplifikation av ikke-beskyttendekryssreaktiveHCV antibodies i henhold til de antigenisk synd prinsipp kan ha negative effekter30.

Selv omassosiasjonstudier som vår kan ikke formelt define kausalitet, de implikasjoner av våre funn er tydelige: Tidligereimmunitet til HCV kan beskytte til noen utstrekning imot SARS-CoV-2 oppkjøp, ogkan gi a øke til de utvikling av SARS-CoV-2 spesfic immunitet og med dette Nedre de Fare tilalvorligsykehusinnleggelse.  A  beskjedenbeskyttende effekt av HCoVimmunitet ville være a plausible forklaring til de høyproporsjonav asymptomatisk og mild SARS-CoV-2 infeksjoner52,53. Til og med mer spennende er fremtidsperspektiver. Som andre og viha vist, SARS-CoV-2 og HCV immunitet til infeksjon erofte ikke lang-varig (Fig. 5, Supplerende Fig. 11)5,54, en begrensningat  SARS-CoV-2  vaksinerhåptilovervinne. Bør SARS-CoV-2  svarisvinggien grad av forsvar mot HCV infeksjon, bred beskyttelse imot koronavirus kan være i rHver.

Fig. 8 innvirkning av HCoV immunitet på COVID-19 alvorlighetsgrad. a assosiasjon av sykehusinnleggelse status (ikke innlagt på sykehus (N = 16); innlagt på sykehus ikke i ICU(N = 42); innlagt på sykehus i ICU (N = 22)) og høy eller lav IgG HCoV reaktivitet. Rektangel størrelser tilsvare til de proporsjon av inkludert pasienter. b Påvirkning av HCoV reaktivitet (lav/høy) på de sykehusinnleggelse status i a delmengde av N = 80 pasienter, som estimert med odds forholdstall, i an ordinær regresjon (med nivåer = ikke innlagt på sykehus (N = 16); innlagt på sykehus ikke i ICU (N = 42); innlagt på sykehus i ICU (N = 22)) og a logistikk regresjon (referanse = ikke innlagt på sykehus(N = 16); mot alle innlagt på sykehus (N = 64)). Data er presentert som parameter anslag og det er95 prosentselvtillit intervall. Nivå av betydning av parameteren er oppnådd med a to-sidestilt t-test (p-verdi er vises hvis <>ellers angitt som n.s.).

Megthods

Menneskelig eksemplar. Serum og plasmaprøver ble samlet før og etter oppkomst av

SARS-CoV-2 inSveits (pre ogetter februar 2020, hhv) varinkludert. Nei tålmodig registrering var gjennomført til de tilstede studere. Alleeksperimenter involverende prøver fra menneskelig givere var gjennomført med godkjenning av responsenible lokale etikk komité (Kantonale Etikkommisjon) Zürich,

Sveits (BASEC Nrs 2020-01327, 2020-00363; 2021-00437; 2020-00787), av de bestemmelser av de Erklæring av Helsinki og de Bra klinisk Øve på retningslinjer av den internasjonale konferansen om harmonisering. Prøver var oppnådd fra følgende kilder: (i) bloddonasjon fra Zürichservicees (ZHBDS): Anonymisert sunn voksen plasma fra pre-pandemi tidpoeng (januar 2019, Kan 2019,og januar 2020) og fra den første bølgen av pandemi i Zürich, Sveits (Kan 2020) var sørget for av de ZHBDS innvendig serumlager og ulemperent til dette studere var frafalt av de etikk komité(BASEC 2021-00437). (ii) Anonymisert gjenværende prøver fra rutinediagnostikk på de Institutt av Medisinsk Virologi, universitet av Zürich, de Universitetsbarn Sykehus Zürich, og de Kantonal Sykehus Winterthur (BASEC Nrs2020-01327, 2021-00437). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakernehvis prøve was tatt under de pandemi på de universitet SykehusZürich (BASEC 2020-01327). For pandemiprøver fra andre sykehus end prepandemi prøver samtykke var frafalt av de etikk komité. (iii) Helsetjenesterarbeidere med RT-PCR bekreftet SARS-CoV-2 infisertion deltar i a studere på universitet Sykehus Zürich (BASEC 2020-00363). Skrevet informert samtykke var oppnådd fra alle deltakere. (iv) Mann plasma givere deltar i en SARS-CoV-2 plasma terapi studere utført ved Universitetssykehuset Zürich(CPT-ZHP, Sveitsisk 2020TpP1004; GRUNNLEGGENDE 2020-00787). Skriftlig informertsamtykke til forskning ble innhentet fra alle deltakerne. Than rapportering av alle menneskelig og patient dataoverholder meddeSTROBE uttalelse. Pre-pandemi (SARS- CoV-2 negative, N = 825) og lurefirmed SARS-CoV-2 positivt prøver (N = 389)var delt inn i opplæring og validering kohorter (Supplerende Bord 3).          Tilgjengelig demografi data på kjønn, alder, tid siden positivt RT-PCR ogsymptom begynnelse, og sykehusinnleggelse status er rapportert i Supplerende Bord 11.De SARS-CoV-2 opplæring kohort (N = 175) inkludert plasma samlet underinfeksjon (N=114) og rekonvalesens (N=61). Per donor bare en prøvetaking tidpunkt ble inkludert, longitudinal prøver av givere inkludert i de opplæring kohort var ikke inkludert i de validering kohort for å fastslå uavhengighet nårvurderer de følsomhet og spesifisiteten til de forskjellige diagnosemetodene. De   SARS-CoV-2 validering kohort (N = 214), omfattet plasma samlet inn under infeksjon (N = 90, ett prøvetakingstidspunkt per donor) og rekonvalesens

(N = 124, 79 rekonvalesent pasienter med 1–4 langsgående prøver). Flere gangerpoeng av rekonvalesent pasienter var inkludert i de valideringsdatasett for å fange opp en bredt spekter av waning antistoff titere. Et tverrsnitt analyse var basert påprøver med kjent tid siden positivt RT-PCR (N = 369) eller kjent tid siden symptom begynnelse (N = 333), begge inkludert longitudinelle analyseobservasjoner.Både tid siden positiv RT-PCR og tidsiden begynnelse var kjent til330 prøver, med en mediantid på tre days mellom symptom begynnelse og RT-PCR(1st–3rdkvartil: 1–7 dager). Longitudinell analyse av antistoffreaktivitet var basert på 251 observasjoner fra 120 rekonvalercent pasienter med kjent tid siden positivt RT-PCR og tid siden symptomdebut. Nøytralisering was målt på 467 SARS-CoV-2 RT-PCRpositivt prøver (N = 369 med kjent tid siden positiv RT-PCR, N = 333 med kjent tid siden symptom begynnelse).

Vi evaluerte videre kryssreaktivitet ABCORA 2.0 og 5.0 til venstret-over plasmafra rutinediagnostikk i en prepandemisk kontrollgruppe with dokumentert, nylig HCV infeksjon (Opplæring II, N = 75; OC43 (N = 27), HKU1 (N = 17), NL63      (N = 22), 229E (N = 9)). Sirkulerer HCV er vanlig bare skjermet til iinnlagt på sykehus, alvorlige luftveisinfeksjoner og nedsatt immunforsvar enkeltpersonersom rutinemessig gjennomgår en brorannonse screening til luftveiene infeksjoner. Derfor, i denne pasienten gruppe, både redusert antistoff reaktivitet forfaller til immun kompromisser ellerforhøyet HCV antikropp reaktivitet forfaller til nylig eller tilbakevendende HCV infeksjon kanskje. Siden denne gruppen er diagnostisertstisk relevant vi ansett den forsvarlig til inkludere dette kohort som Opplæring II data sett til bekrefte hvis kryss-reaktivitet med SARS-CoV-2 iABCORA inntreffer i denne innstillingen. Trenings II-data var ikke inkludert i terskelen definisjon til ikke over-representere enkeltpersoner med alvorlig sykdom. Denne HCV-infisertegruppe vises alt i alt Nedre reaktivitet med SARS-CoV-2 enn plasma frasunn voksne men viktigst viste Nei indikasjon av kryssreaktivitet (fig.1a, b). Pandemiprøveles fra anonym blod givere med ukjent SARS-CoV-2status samlet inn i Kan 2020 (N = 672) var ikke inkludert i opplæring og validering kohorter.

Reagenser og cellelinjer. Hans-tagged SARS-CoV-2-avledet antigener (reseptor

bindende domene (RBD), underenhet S1 (S1), underenhet S2 (S2), nukleokapsid protein (N)) og S1 av than fire sirkulerer HCoVs (HKU1, OC43, NL63, 229E) var kjøpt fra Sino Biological Europe GmbH, Eschborn, Tyskland (SupplerendeBord 12). Kilder, spesifikasjoner og konsentrasjon av deteksjons- og kontrollantistoffer og sera brukt til ABCORA og nøytraliseringstesterts er oppført i Tilleggstabell 13. 293-T-celler ble hentet fra American Type Culture Collection(ATCC CRL- 11268)55. HT1080/ESS2cl. 14 celler33 var Vennligst levert av P.Bieniasz, Rockefeller universitet, NY. Både celle linjer var kultiverte i DMEMcontaining10 prosentFCS.

Design av multipleks perle analyse ABCORA 2.0. Vi etablert to perle-basertmultiplekset SARS-CoV-2 immunoassays (ABCORA 2.0 og ABCORA 5.0) atinkludert en rekke SARS-CoV-2 og HCoV antigener (Sino Biologisk EuropaGmbH, Eschborn, Tyskland, tilleggstabell 12). Fire SARS-CoV-2-antigerns- RBD, S1, S2, og N - var inkludert i både ABCORA 2.0 og ABCORA 5.0.ANCORA 2.0 inkludert i addisjon S1 av HCV-HKU1, ogABCORA 5.0 inkludert S1av alle sirkulerer HCoVs (HCV-NL63, HCV-229E, HCV-HKU1, HCV-OC43). I kort, individuell MagPlex perler (Luminex Selskap, Austin, TX)    med unique fluorescerende perle regioner var valgt ut til Hver antigen, perler varkoblet og blandinger av antigenkoblede perlersvarinkubert med tålmodig plasma i a 96-vi vil tallerken sett-opp. DeMedian Fluorescerende Intensitet (MFI) av perlebundet plasmaantibodies var målt utnytte a FlexMap 3D leser (Luminex Selskap,Austin, TX). Vi designet de analyse til fulfill de følgende kriterier: (i) høy hastighet-cifiby, følsomhet, og reproduserbarhet, (ii) fleksibel multipleks design at tillater grei addisjon og/eller forandring av antigener; (iii) bred dynamisk område;  (iv) valgfri kvantifikation av antistoff svar; (v) valgfri innspilling avantikroppsvar på HCoV og (vi) bruk i rutinene diagnostikk og undersøkelser.

Vi valgte en sterisk orientering fange via anti-Hans antistoffer til sørge for a homogen antigenvisning. Derfor karboksylert MagPlex perler (Luminex

Selskap, Austin, TX) var koblet sammen med anti-Hans antistoff (Sino Biologisk

Europa GmbH, Eschborn,Tyskland, tilleggstabell 13) og deretter koblet med His-taggetantigener ved hjelp av Bio-Plex Amin kobling (Bio-Rad LaboratorierAG, Cressier, Sveits) i henhold til produsentens iinstruksjoner og sombeskrevet56.

Serum/plasmatitrering anses generelt som den mest nøyaktige strategy tilretrikveld kvantitativ informasjon på antistoff reaktivitet. men, i diagnostisk bruktester ideelt sett bør levere (semi)-kvantitativ informasjon fra a enkelt serumfortynning til tillate en tilstrekkelig gjennomstrømning. De finaliserte analysebetingelsene dekket a 2-log MFI-område på tvers av alle sonderte antigen-Ig-kombinasjoner (Supplerende Fig. 1).Ratifisere de gyldighet av ved hjelp av a enkelt plasma fortynning, vi lurefirmed at plasmafra SARS-CoV-2 positivt pasienter og pre-pandemi SARS-CoV-2negativplasmaprøver viser optimal dose-respons kurver over a bred plasma fortynningområde (Supplerende Fig. 1f). Viktigere, a 1/100 fortynning av plasma var i allesaker Lukk til det maksimale signalet, og understreker det økende plasmaetkonsentrasjon vil ikke øke signalintensiteten, men snarere endangeh minkendesignaler forfaller til prozon effekter (Supplerende Fig. 1f).

Maksimal anti-Hans antistoff lasting var oppnådd på 5 µg antistoff per millionperler (Supplemoppføring Fig. 1c) og brukt som a standard kobling tilstand. I de finalprotokoll,Fem millioner anti-His antistoff-koblede magnetiske perler ble inkubert med Hans-merket antigener fortynnet i PBS ved en konsentrasjon på 320 nM.Phycoerythrin (PE)-merkede sekundære antistoffer spesifikke for IgG, IgA, eller IgM varbrukes som detektorantistoffer (SupplerendeBord 13). Kvalitet styre av deantigen loading var utført av inkubering de perler med monoklonalantistoffer rettet mot den tilsvarende CoV-derivert antigen som detaljert iSupplerende tabell 12. Analyse ble utført medh de FlexMap 3D leser(Luminex Corporation, Austin, TX) med de oppkjøp av på minst 50 perler perperleregion. Resultater are innspilt som MFI per perle region.

Flere kontrolltiltak ble installed til fastslåinter-og intra-analyseopptreden. For å fastslå en lav analyse-til-analyse variasjon, stor partier avindividuelt antigenbelastet beads var forberedt og frossen i alikvoter før brukt på-20 gradC til omgådeforfall av de antigen-koblet sammen perler (Supplerende Fig. 1). Individuelle koblede perler ble blandet på testdagen til yield de nødvendig antigenperle cocktail. Cocktailer inneholdt 60 perler seh perle region per µl. I addisjon tilSARS-CoV-2- og HCV-perleregionene, inkluderte hver cocktail en tomy perleregion (Nei antigen koblet sammen) til styre til uspesifisertfic bindende. Kvalitet kontroll og validering prosedyrer til de FlexMap 3D instrument var ferdig på Hver dag aveksperiment ihtbestilling tildeprodusent's bruksanvisning. De variasjon av de analysevar analysert som følger56: plasma prøver fra 20 RT-PCR lurefirmed SARS-CoV- 2 infiserte pasienter ble samlet og testet over a område av syv fortynninger i 31  forskjellig titrasjoner utført på 10 forskjellig dager (Supplerende Fig. 2). På tversalle antigener og Ig klasser, signaler var beholdt over de test periode av 25dager post perlekobling. Variasjonskoeffisienter (CV) til bindingssignalet over titrasjonerav 12 antigen-Ig klasse kombinasjoner bevist lav (område: 0.010–0. 128, median  0.059, tilleggsfigur 3c, d, tilleggstabeller 1, 2). Samme dag og dag til dagvariasjon sroved lav og sammenlignbare (Supplerende Fig. 3e, f). Under a 1/ 100 plasma konsentrasjon, CV økt markant (Supplerende Fig. 3d),         definerer 1/100 som høyeste konsentrasjonpå (lavest plasma fortynning) til være testet i de analyse. En 1/100 plasmafortynning ble dermed definert som den grunnleggendefortynning til screening plasma i ABCORA 2.0 når a kvalitativ (dvs. tilstedeværelse eller fravær av SARS-CoV- 2spesifikke antistoffer) eller semi-kvantitativ (dvs. MFI-signalintensitet) avlesning errpåkrevd.

Alle ABCORA-målinger var derivet fra enkelt målinger med mindreanført noe annet. For å måle SARS-CoV-2 spesific antistoffer i tålmodig plasma,varmeinaktivert plasma (1 h på56 graderC) var fortynnet 1/100 i PBS-BSA1 prosentmed mindreannet oppgitt. 50 ul fortynnetutg plasma var inkubert med 50 µl av de ABCORAantigen perle cocktail til 30 minutter på rom temperatur i 96-brønnplater, vasket tre ganger med PBS-BSA 1 prosent, og inkubert i separate reaksjoner wifykoerytrin (PE)-merket detektor antistoffer til IgG, IgA eller IgM på a final konsentrasjon av 1/500 i PBS-BSA 1 prosent . Denne fortynningen ble tidligere definert avtitrering av detektorantistoffene for å gi optimale MFI-signaler. Etter 45 minutes avinkubering ved romtemperatur, perler ble vasket tre ganger med PBS-BSA1 prosentog analysert i 96-vi vil plater på FlexMap 3D-leseren (Luminex Corporation, Austin, TX). A minimum av 50 perle leser per antigen var ervervet.

For å kontrollere for ekte kryssreaktivt antistoffies, Hver plasma prøve varvurdert med beads uten antigen (tømme perle styre) i kombinasjon hvilkenhver detektor antibody. Til analyse, rå MFI verdier var transformert til MFI-FOE til riktig til bakgrunn bindende.Vi etablerte gjennomsnittlig tom perle MFI-FOE for IgG, IgA og IgM fra pre-pandemiske friske donorer (N=1016) og set gjennomsnittet MFI-FOEi tillegg til4x standardavvik som terskel for den tomme perlekontrollen.I absolutt nivåer, disse terskler utgjorde til MFI-FOE 41,58 (IgG), 55,91 (IgA), og 269,47 (IgM).Mutmålinger til hvilken de tømme perle styre innspilt verdier above dette terskel var ansett ugyldig og gjentatt.

Hver Luminex-analyse-96-brønnplate ble satt opp til å inneholdei de samme sett avstyre prøver, nemlig 7 serie 4-brette fortynninger av en SARS-CoV-2 positiv kontrollgiver basseng (N = 20 givere, starter fortynning 1/100, Supplerende Fig. 1f) og en pre-pandemi sunn giver basseng (fortynning 1/100, N =20 givere, SupplerendeFig. 1f). Disse positive og negative kontrollene gjør det mulig å kontrollere analyseytelsenncepå tvers av uavhengige målinger og i tillegg muliggjøreretrospektivtstandardisering mot eksterne kontroller ved behovded.

Definisjon av SARS-CoV-2 seropositivitet i ABCORA 2.0 og ABCORA 5.0. Tilskille SARS-CoV-2-spesifikt fra kryssreaktive antistoffer,efined MFI- FOE-terskler for hver av de 12 SARS-CoV-2-antigenene og Ig-klassekombinasjonens basert på plasma antistoff reaktivitet i opplæring kohorter (Supplerende Tabeller 3 og 4). Disse inkluderte pre-pandemisk sunn donor slasma (Opplæring I, N = 573),givere med nylig HCV infeksjon (Opplæring II, N = 75; OC43 (N = 27), HKU1 (N = 17), NL63 (N = 22), 229E (N=9)) og donorer med bekreftet SARS-CoV-2-infeksjon (Opplæring III, N = 175). Terskler var sett til minimerefalske positiversamtidig som sikre følsomhet til SARS-CoV-2antistoffdeteksjon og å nå ensamlet spesifisitet ovenfore99 prosentog inkludert nivåer til grense-linje reaktivitet til IgGRBD,IgG S1, og IgG N til tillate også beskjeden antistoff reaktivitet til disse antigener to være undersøkte. MFI-FOE leser av individuell prøver var transformert inn isignal-over cut-off (SOC) verdier (MFI-FOE/terskel). SOC valuer er brukt tilrumpersynge positivt reaktivitet til Hver individuell antigen-antistoff klasse kombinasjon, med SOC > 1 angir positiv reaktivitet, og SOC < 1 angir negativ reaktivitet.Når omgivelser individuell terskler, den må være ansett at til Hver av de 12 sondert aktiviteter kryssreaktivitet kan forekomme. Med 12 individuelle SOC-parametere registrert, samlet specifiby vil avta hvis noen positivt SOC uavhengig suffices til vurdere a prøve alt i alt som SARS-CoV-2 antistoff positivt. Til eksemplifisere:Forutsatt uavhengige responser, selv en høy 99 prosent spesifisitet for hvert antigen vil summere to en samlet lav 88 prosent spesifisitet over hele analysen. Vi krevde dermed for SARS-CoV-2 positivt ringer i ABCORA 2.0 a minimum av to spesfibyer til å nåaktivitet ovenfordeterskel. De kombinerte SOC-verdiene som brukes til å definere totalenserostatus for en gitt prøve er beskrevet i tilleggstabell 5. For IgG RBD, S1, og N,som vi også registrerte border-line SOC-aktivitet for, tillot vi enkombinasjon av 1 antigen reaktivitet SOC > 1, den andre reaktivitet SOC > borderline. De final terskel og positivt anrop kriterier tillatt til differensiering av delvis (tidlig serokonversjon med bare IgM og IgA svar) til full ser-          konvertering (inklluding IgG svar) (Supplerende Bord 5). I addisjon, kriteriene betegne prøver med svak reaktivitet og/eller ubestemt reaktivitet(Tilleggstabell 5).

For å lette sammenligningen mellomeen ABCORA 2.0 og ABCORA 5.0 de sammeterskel cut-offs ble brukt for ABCORA 5.0. Vi valgte å ikke lage et spesifikt cut-offterskler for HCV-antistoffreaktivitet som enn korrekt definisjon av a negativresponsen er kompleks på grunn av den utbredte eksponeringen for HCoVs og considerableantistoffkryssreakaktivitet mellom dem. HCV svar var men inkludert i statistikkencal analyser som MFI-FOE verdier.

Definisjon av SARS-CoV-2 seropositivitet ved hjelp av logistikk regresjon klassifisering.

Classifikation av seropositiv mot seronegativ prøver i ABCORA 2. 1 ble realisertved hjelp avlogistikk regresjon. De identisk opplæring og validering data brukt til de etablering av ABCORA 2.0 var brukt. Som de ABCORA 2.0 bindende reaktiviteter var sterkt korrelert, inkluderte vi følgende variabler i modellen (Supplerende Fig. 6a): de mener verdi av alle IgG MFI-FOE-svar (RBD, S1, S2, N), den mener verdi av IgA MFI-FOE-responsene mot RBD, S1 og S2, og gjennomsnittet verdien av IgM MFI FOE-responsene mot RBD, S1 og S2. IgA- og IgM-responss til N ble ekskludert da de ikke klynget seg sammen med de andre svarene til samme Ig klasse (Supplerende Fig. 6a). Den logistiske regresjonen ble brukt til å estimere og forutsi sannsynligheten for et gitt utvalge til være positivt (p) som beskrevet i ligning (1).

Parameter  0, G, A, og  M var estimert på de opplæring datasett. A prøve ble deretter definert som positiv hvis den forutsagte sannsynligheten for å være positiv var overa terskel c/. Denne terskelen ble definert for å oppnå en spesifisitet på minst 0.99 og maksimal følsomhet på treningsdatasettet (tilsvarende to c til de tilfeldig skog). Isammendrag, i ABCORA 2. 1, er enhver ny prøve definert som seropositiv hvis den er sannsynlig av å være seropositiv som estimert ved den logistiske regresjonen er over c/. Analyserer vire utført i R-versjonn 3.6.3. Definisjon av SARS-CoV-2 seropositivitet ved hjelp av tilfeldig skog klassifisering.  Klassifisering av seropositiv versus seronegativ prøver idekontekst av ANCORA 2.0 og ABCORA 5.0 var realized ved hjelp av a tilfeldig skog nærme seg følgende degrunnleggende oppsett av random skoger som beskrevet i57. De tilfeldig skog seg selv var bygget av et ensemble av 1000 klassifiseringstrær ved bruk av MFI-FOE-svar (IgA, IgG,ogIgM mot RBD, S1, S2,N). De sannsynlighet av a prøve å være positivt som pre-  diktert av den tilfeldige skogen er gjennomsnittet av pran over alle 1000 trær. Til slutt er en prøve defined som positivt hvis det er sannsynlighet av å være positivt er ovenfor a threshold c, hvilken er defined som til skaffe seg a spesfiby av på minst 0.99 og a maksimalt følsomhet på togeting datasett. I sammendrag, noen ny prøve er defined somseropositiv hvis jegts sannsynlighet av å være seropositiv som estimert av de tilfeldigskogen er over threshold c. Vi gjennomført a serie av tilfeldig skog analyser som vurderte enten bare SARS-CoV-2-svar eller SARS-CoV-2 og HCV   svar i ABCORA 2.0 og ABCORA 5.0: ABCORA 2.2 og ABCORA 2.3 vartrent og brukt til forutsigelse på ABCORA 2.0 data og inkludert bare SARS-  CoV-2 svar eller SARS-CoV-2- og HKU1-svar, henholdsvis. ANCORA 5.4 (bare SARS-CoV-2-svar) og ABCORA 5.5 (SARS-CoV-2 og HCVsvar) var trent på ABCORA 5.0 data. Detaljer om datainkludering for respektive modeller er oppført i Supplerende Bord 3 og Supplerende Bord 10. Analyser ble utført i R versjon 3.6.3 ved bruk av packages randomForest og     ranger58–61.

For å sikre robustheten til våre funn, utførte vi en sensitivitet analyse ved å randomisere opplærings- og valideringsdatasettene ved hjelp av en 5-fold kryssvalideringmetode. Begge setteneav positivt og negative prøver var delt inn i five likdeler og vi defined at vei five validering settene (bestående av de i-th sett avpositive ogde i-th sett av negative, i = 1.5). De hvile av de data var brukt tilopplæring de ABCORA 2.3 tilfeldig skog. For hvert valideringssett, spesifisiteten ogfølsomhet av de tilfeldig skog var beregnet på de opplæring, validering, og treningi tillegg tilvalidering settene (Supplerende Tabell 6).

Validering og bekreftelse ved hjelp av utvendig kontroller. Vi brukt de Anti-SARS-  CoV-2 verifikasjonspanel for serologiske analyser (NIBSC kode: 20/B770, NIBSC) tilverifiser ytelsen til ABCORA 2.0- og ABCORA 2.3-testen. Serumsrikeligav de verifikation panel målt av ABCORA 2.0/2.3 som beskrevet og resultatersammenlignet med resultatene av kommersielt tilgjengelige analyser rapportert av NIBSC (32 og tilleggstabell 7). Vi furterhenne verifiutg de følsomhet av de ABCORA 2 test i oppdager SARS-CoV-2 infeksjon i en direkte sammenligning med kommersielltester. Antibody status av plasma fra SARS-CoV-2 positivt enkeltpersoner (N = 171) ble analysertd med de følgende test systemer: Inkludert test systemer målrettet de N protein (Elecsys® Anti-SARS-CoV-2 (Roche Diagnostics GmbH)), RBD-regionen av de S protein (Elecsys® Anti-SARS-CoV-2 S-analyse (Roche Diagnostics GmbH)),og de S1 underenhet (EUROIMMUN Anti-SARS-CoV-2 ELISA (IgG)) (SupplerendeTabell 8). Alle analyser ble utført ihtde produsent's instruksjoner i de diagnostikk enhet av de Institutt av Medisinsk Virologi, Universitetet i Zürich, Sveits.