Myricetin forbedrer Ox LDL-indusert HUVEC-apoptose og betennelse via LncRNA GAS5 som oppregulerer uttrykket av MiR 29a 3p
Mar 12, 2022
Vær så snill og kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mer informasjon
Aterosklerose (AS) er en betydelig årsak til sykelighet og dødelighet blant kardiovaskulære sykdommer, som i utgangspunktet utløses av endotelial dysfunksjon og preget av en tilstrømning av aterogene lipoproteinkomponenter. Det er den viktigste potensielle faktoren for de fleste dødelige sykdommer, som hjerteinfarkt, ustabil angina, plutselig hjertedød og hjerneslag. Selv om etiologien er involvert, er skaderesponsteorien om at vaskulær endotelcelle (EC) skade er den initierende mekanismen til AS, fortsatt bredt adoptert3,4.Oksiderendelavdensitetslipoprotein (okse-LDL) har vist seg å være involvert i dannelsen av aterosklerose, og dets induserte vaskulære endotelskade er en av de tidlige patogenesene av aterosklerose. Så langt er det fortsatt en stor utfordring å kontrollere utviklingen av AS fordi de molekylære mekanismene til AS ikke er fullt ut forstått. Derfor kan det å redusere okse-LDL-indusert EC-skade og ytterligere forklare dens mekanisme være en potensiell strategi for forebygging og behandling av AS. Myricetin (Myr) er en vanlig naturlig flavonoid som finnes i mange frukter, grønnsaker og urter. Myr spiller en betydelig rolle i å behandle og forebygge enkelte sykdommer, inkludert diabetisk osteoporose, hepatocellulært karsinom8, alkoholisk lever³,og hudkreft9,på grunn av dens kraftige jern-chelaterende evne,antioksidanter og frie radikaler fjernende aktiviteter. Nylig harkardiobeskyttenderollen til Myr har vakt oppmerksomhet fra forskningsmiljøet. Myr viste en beskyttende effekt på lipopolysakkarid (LPS) indusertinflammatorisk myokardskade, hjertehypertrofi, og iskemi/reperfusjon(I/R)-indusert myokardskade3. Effekten av Myr på lipidmetabolisme og åreforkalkning er imidlertid ikke fullt ut forstått.
Materialer og metoder
Cellekultur, okse-LDL-indusert skademodell og spredning.
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) fra Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina) ble dyrket i DMEM supplert med 10 prosent FBS undernormoksiskforhold ved 37 grader. HUVEC-ene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner（50,100,200 ug/ml）av okse-LDL（Union-Bio-teknologi,Kina）og ble samlet inn ved 24 timer for ytterligere målinger. I henhold til produsentens instruksjoner ble proliferasjonshastigheten til cellene målt med en CCK8-analyse (Solarbio, Kina).
Cistanche kan forbedre immuniteten
Flowcytometrianalyse av apoptose med PI og annexin V dobbel farging.
Celleapoptose ble evaluert ved flowcytometri ved bruk av PI og annexin V dobbeltfarging av apoptoseanalysesett (Solarbio, Kina) etter produsentens instruksjoner.
Måling av reaktive oksygenarter (ROS). Den intracellulære ROS ble bestemt ved å bruke ROS-analysesettet（Beyotime,Kina）. Kort,celler ble inkubert med 10 μM DCHF-DA i 20 minutter, og deretter ble fluorescensintensiteten vurdert under en mikroplateleser.
RNA-immunutfellings(RIP)-analyse.
RIP ble utført ved bruk av Magna RIP Kit (Millipore, USA) i henhold til produsentens protokoll18. Kort fortalt ble HUVEC-celler samlet og lysert i en komplett RIP-lysebuffer. Helcelleproteinekstraktet ble deretter inkubert med RIP-buffer inneholdende magnetiske kuler konjugert med humant anti-AGO2-antistoff eller negativ kontroll normal muse-IgG. Det hentede RNA ble deretter detektert ved qRT-PCR.
RNA Fluorescent in Situ Hybridization (FISH) analyse. Spesifikke prober til GAS5-sekvensen og miR-29a-3p ble designet og syntetisert av RiboBio. Et FISH Kit (RiboBio) ble brukt til å oppdage probesignaler i henhold til produsentens instruksjoner. Kjerner ble farget med DAPI.
Dual-luciferase reporteranalyse. Dual-luciferase reporter-analyse ble brukt for å oppdage interaksjonen mellom GAS5 og miR-29a-3p-promoterregion.
Villtype- og mutasjonssekvensene til bindingsstedene (WT-GAS5 og MUT-GAS5) ble designet og syntetisert. HUVEC-celler ble transfektert i kombinasjon med WT(Mut)GAS5-vektor og miR-NC eller miR-29a-3p ved bruk av Lipofectamine 2000 Transfection Reagent(Invitrogen). Etter 48 timers transfeksjon ble et Dual-Luciferase reporter-analysesystem (Promega) brukt til å utføre luciferase-analysen.
Bestemmelse av VCAM-1, IL-6 og MCP-1.
Nivåene av supernatant monocytt kjemo-attraherende protein-1(MCP-1),interleukin-6 (IL-6) og vaskulært celleadhesjonsmolekyl 1(VCAM{{6} }) ble bestemt av ELISA-sett. IL-6 ELISA-sett (ab178013), MCP-1 ELISA-sett (ab179886) og VCAM-1 ELISA-sett (ab223591) ble brukt i henhold til produsentens bruksanvisning.
Sanntids kvantifisert PCR(gRT-PCR).
Totalt RNA ble isolert ved bruk av Trizol-reagens (Takara Bio Inc., Japan）i henhold til produsentens protokoll. cDNA ble generert fra det totale RNA（2 ug）med et cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, USA), og SYBR-basert sanntids-PCR ble utført for å oppdage de totale mRNA-transkripsjonene på et Applied Biosystems(ABI)7300 hurtig sanntids-PCR-system. Primersekvensene ble oppført nedenfor.
Western blot-analyse.
Proteinekspresjon av Bax, Bcl-2, caspase3, CD31, SM22a, p-p65, p65, p-IkBa, IkBa og TLR4, ble målt ved Western blotting. Proteinprøver isolert fra HUVEC-celler (25 ug)) ble løst ved bruk av SDS-PAGE og deretter flyttet til polyvinylidenfluorid(PVDF)-membran (Millipore, USA) med probet med GAPDH (#2118,1:5000, cellesignalering), Bax (#2772S,1:1000, Cellesignalering), Bcl-2 (#15071S,1:1000, Cellesignalering),caspase3(#9662S,1:1000, Cellesignalering), CD31 (ab9498,1:1000 , Abcam), SM22a (ab14106,1:1000,Abcam),p-p65 (10745-1-AP 1:1000, Proteintech), p65 (66535-1-Ig,1:1000,Protein-tech), p-IkBa(10268-1-AP,1:1000, Proteintech),IkBa(66418-1-Ig,1:1000, Proteintech) og TLR4(66350-1-Ig, 1:1000, Proteintech) antistoff etterfulgt av passende sekundært antistoff. Alle Western blots ble gjentatt minst tre ganger. Til slutt ble proteinuttrykket visualisert med forbedret kjemiluminescens (ECL) system.
Immunfluorescensanalyse.
Celler dyrket på objektglass ble fiksert, permeabilisert, blokkert og immunfarget over natten med antistoffer av CD31 (ab9498, 1:200, Abcam) og SM22a (ab14106, 1:200, Abcam). Etter vasking ble spesifikke andre FITC-merkede IgG-antistoffer inkubert med celler kontinuerlig. Til slutt ble bildene tatt under et mikroskop (Olympus, Japan) med passende forstørrelse.
Statistisk analyse. Alle resultatene er vist som gjennomsnitt ± standardfeil for gjennomsnittet (SEM). Statistisk signifikante resultater ble bestemt ved å bruke enveis ANOVA, etterfulgt av Student-Newman-Keuls(SNK)q-testen. En p-verdi<0.05 was="" considered="" to="" be="">
Resultater
Myricetin demper okse-LDL-indusert apoptose og ROS i HUVEC-er.
Først av alt førte 100 ug/ml okse-LDL-inkubasjon i 24 timer til en signifikant doseavhengig reduksjon i cellelevedyktighet. Forbehandling med l uM Myr i 2 timer hadde ingen signifikant innvirkning på cellelevedyktighet. men,2,5 og 5 μM Myr forårsaket en betydelig reduksjon i cellelevedyktighet (fig. 1A og B). I tillegg la vi merke til at økningen av ROS indusert av okse-LDL i HUVEC ble redusert med Myr (fig. 1C). Vi undersøkte også effekten av Myr på apoptose. Dessuten viste flowcytometri og apoptose-relatert proteinresultat også at den 100 ug/ml okse-LDL-indusert HUVEC-apoptose var dramatisk doseavhengig reverserte MYR-forbehandlede celler (fig. 1D og E).
Myricetin hemmer den inflammatoriske responsen og EndMT i okse-LDL-induserte HUVEC-celler. Immunofluorescensfarging viste at inkubasjon av HUVEC-er med okse-LDL reduserte uttrykket av endotelmarkøren CD31, og økte uttrykket av den mesenkymale markøren SM22a, noe som indikerer at okse-LDL-tilstanden utløser EndMT. Men disse effektene dempes av MYR. Konsekvent viste western blot at Myr svekket det oppregulerte SM22a-proteinnivået i HUVEC-er indusert av ox-LDL (Fig, 2A og B). I nærvær av ox-LDL, mRNA-nivåene av IL-6, MCP{{ 11}}, VCAM-1 ble åpenbart oppregulert i HUVEC-er, mens Myr-behandling reverserte disse avvikende endringene (fig.2C). Likeledes ble lignende resultater ytterligere bekreftet ved ELISA (fig. 2D).
GAS5-overekspresjon demper myricetin-beskyttende effekter mot okse-LDL-mediert HUVEC-iniur.
Vi oppdaget videre uttrykket av GAS5 i HUVEC-er med gRT-PCR. Som vist i fig. 3A ble et signifikant høyere nivå av GAS5 observert i okse-LDL-gruppen enn i kontrollen. I kontrast ble mRNA-nivået til GAS5 redusert i den Myr-behandlede gruppen på en doseavhengig måte. Disse dataene indikerte at GAS5 kan involvere i effekten av Myr på endotelceller. For å forstå mekanismene som GAS5 kan involvere i den beskyttende effekten av Myr, brukte vi pcDNA-GAS5 for å overuttrykke uttrykket av GAS5 i HUVEC-er. Ekspresjonen av GAS5 ble forsterket av pcDNA-GAS5, som opprinnelig ble redusert av Myr i okse-LDL-induserte HUVEC-er (fig. 3B). Ytterligere eksperimenter viste at levedyktigheten til HUVEC-celler med GAS5-overekspresjon ble betydelig redusert, og apoptose ble markert forhøyet under behandling av Myr (fig. 3C og D). I tillegg viste overekspresjon av GAS5 i okse-LDL-behandlede HUVEC høyere innhold av ROS sammenlignet med matchet kontroll (fig. 3E). Disse dataene tyder på at oppregulering av uttrykket av GAS5 demper Myrs beskyttende effekter mot okse-LDL-mediert HUVEC-skade.
miR-29a-3p er et mål for GAS5 i HUVEC.
Målet GAS5 ble identifisert via RegRNA 2.0 og star-Base, søkeresultatene ble vist i Fig. 4A. Blant disse miRNAene var miR-29a-3p den mest signifikante reduksjonen i okse-LDL-mediert HUVEC-skade (fig. 4B). Bioinformatikkanalyser ble utført for å forutsi bindingsområdene mellom GAS5 og miR-29a-3p (fig.4C). For å validere denne bioinformatikkprediksjonen, indikerte dual-luciferase-reportergenanalyser at GAS5-WIpresenterte lavere luciferaseaktivitet enn den tilsvarende MUT-gruppen, og bekreftet bindingsforholdet til GAS5 og miR-29a-3p (Fig. 4D). I mellomtiden var nivået av GAS5 anriket av Ago2 RIP høyere i cellene transfektert med miR-29a-3p enn i miR-NC-gruppen (fig.4E). I mellomtiden viste FISH-analyse i HUVECceller at GAS5 ble samlokalisert med miR-29a-3p hovedsakelig i kjernen (fig. 4F). Disse funnene antydet at GAS5 målrettet mot miR-29a-3s.
miR-29a-3p etterligninger reddet effekten av GAS5 i okse-LDL-indusert HUVEC behandlet med Myricetin.
Som vist i fig. 5A var uttrykket av miR-29a-3p signifikant økt i ox-LDL pluss Myr pluss pcDNA-GAS5 pluss miR-29a-3 p etterligner gruppe sammenlignet med okse-LDL pluss Myr pluss pcDNA-GAS5 pluss etterligner kontrollgruppen (fig. 5A). Dessuten økte oppregulert GAS5 signifikant levedyktigheten til okse-LDL-induserte HUVEC-er behandlet av Myr, mens cotransfeksjon pcDNA-GAS5andmiR-29a-3p-etterligninger til HUVEC-er opphevet disse effektene (fig.5B). I tillegg er ROS-produksjonen og apoptose i okse-LDL-induserte HUVEC-er behandlet av Myr etter overekspresjon av GAS5, mens miR-29a-3p etterligner disse effektene (fig.5C og D).
sh-GAS5 eller miR-29a-3p etterligninger kan akselerere den beskyttende rollen til Myricetin i okse-LDL-indusert HUVECs-celle.
For å undersøke om GAS5 og miR-29a-3p var involvert i Myr-mediert reguleringsmekanisme, ble HUVEC-er transfektert med NC, sh-GAS5-mimic control, miR-29a{{7} }p etterligner. Ekspresjonen av GAS5 ble signifikant redusert i sh-GAS5-gruppen sammenlignet med NC-gruppen (Fig.6A). Etter transfeksjonen økte okse-LDL pluss Myr levedyktigheten sammenlignet med okse-LDL-gruppen, og hemming av GAS5 eller oppregulert miR-29a-3p økte levedyktigheten til okse-LDL-induserte HUVEC-er behandlet med Myr(fig.6B). I tillegg begrenset Myr celleapoptose forårsaket av okse-LDL, som senere ble endret av sh-GAS5- og miR-29a-3p-etterligninger (fig.6C). Dessuten ble proteinnivået til CD31 og SM22a økt
Myricetin inaktiverte TLR4/NF-KB-signalveien i okse-LDL-behandlet HUVEC ved å nedregulere GAS5 eller oppregulere miR-29a-3s. TLR4/NF-KB-signalveien er tett involvert i AS-prosessen. For å undersøke om Myr undertrykte TLR4/NF-B-signalveien, ble TLR4 og flere pivotale nedstrømsproteiner, f.eks. p-p65, p65, p-IkBa, IkBa og TLR4, identifisert i HUVEC-celler via western blot analyse. Figur 6 viser at Myr nedregulerte uttrykket av p-p65, p-IkBa og TLR4 sammenlignet med okse-LDL-gruppen, mens proteinnivået til p-p65, p-IkBa. og TLR4 ble redusert i ox-LDL pluss Myr pluss sh-GAS5 og ox-LDL pluss Myr plus miR-29a-3p etterligner grupper sammenlignet med ox-LDL pluss Myr-gruppen(fig.7) . Til sammen antyder disse resultatene at GAS5/miR-29a-3p/TLR4/NF-KB-vei kan være en av de underliggende mekanismene som Myr reduserte HUVEC-celleinflammatorisk og EndMT gjennom. Diskusjon
AS er en vedvarende betennelsestilstand som startes av avsetning så vel som akkumulering av lipoproteiner med lav tetthet i arterieveggen19. Til tross for enorme fremskritt i både grunnleggende og vitenskapelige studier, er den fortsatt blant de ledende dødsårsakene i verden2. I denne studien utforsket vi den molekylære mekanismen til Myr på okse-LDL-indusert skade på HUVEC-er, og avslørte den avgjørende rollen til lncRNA GAS5 i denne hendelsen. Resultatene våre antydet at Myr regulerer HUVECs cellelevedyktighet, ROS, apoptose, betennelse og EndMT gjennom GAS5/miR-29a-3p/TLR4/NF-KB-veien, noe som tydeliggjør en ny mekanisme for Myr på beskytte mot AS.
Ox-LDL har vist seg å indusere en forbedret generasjon av ROS, som spiller en kritisk rolle i utviklingen av AS. Betydelige bevis tyder på at økt oksidativt stress spiller en fremtredende rolle i patogenesen av vaskulær endotel dysfunksjon sammen med endotelcelle EndMT, betennelse og apoptose. Vi brukte okse-LDL-stimulerte HUVEC-er for å simulere forekomsten av tidlig aterosklerose, og den inflammatoriske responsen og EndMT av HUVEC-er ble økt, og Myr hemmet signifikant inflammatorisk respons og EndMT på HUVEC-er stimulert med okse-LDL. Myr er kjent for å utøve antioksidative cytobeskyttende effekter i forskjellige celler, inkludert en HUVEC-cellelinje21. En tidligere studie fant at Myr viste pro-proliferative og anti-apoptotiske effekter i LPS-induserte kardiomyocytter H9c2-celleskade2. I denne forskningsstudien sjekket vi resultatet av Myr på okse-LDL-indusert aterosklerotisk celleversjon. Resultatene våre antydet at 5 μM Myr-forbehandling betraktelig kan snu den okse-LDL-induserte nedreguleringen av cellelevedyktighet i HUVEC-er. Resultatene våre viste at okse-LDL-terapi kunne annonsere betennelsen og EndMT av HUVECs gjennom å regulere CD31, SM22a og inflammatoriske cytokiner (IL-6, MCP-1, VCAM-1), som kan reverseres ved Myr forbehandling. Flere elementer fastslo at betennelse og EndMT følger med aterosklerose23. En tidligere studie fant at hemming av uttrykket av VCAM-1 og ICAM-1 har blitt anerkjent som en viktig strategi mot aterosklerose24. Dessuten undertrykte vaksinen okse-LDL-indusert endotelial EndMT gjennom nedregulerende endotelmarkør CD31 og oppregulerende mesenkymal markør SM22a25. Våre funn er i vesentlig overensstemmelse med disse undersøkelsene.
Uttrykket av GAS5 var sterkt uttrykt i både menneskelige og dyremodeller26,27. I denne studien fant vi at GAS5 var oppregulert og miR-29a-3p ble nedregulert i okse-LDL-indusert HUVEC-skade . Myr behandling kan reversere disse effektene. En tidligere studie viste at Mvr hemmet HMGB1-, TLR4- og MyD88-uttrykkene i nevronene, og den gjenopprettet nevronal skade og betennelse forårsaket av aktivering av NF-KB- og MAPK-signalveier*8. I denne studien oppregulering av lncRNA GAS5 og nedregulering av miR-29a-3p førte til en reduksjon av celleapoptose, inflammasjon og EndMT, samt reduksjon av aktiviteten til TLR4/NF-KB-signalveien. I følge funnene våre reduserer Myr p-p65, p-IkBa og TLR4 i HUVECs ved å regulere GAS5/miR-29a-3p som demper den inflammatoriske responsen og EndMT i okse-LDL-indusert HUVEC-skade. Til slutt avslørte forskningsstudien vår at Myr er i stand til å forbedre celleapoptose, cellebetennelse og EndMT via GAS5/miR-29a-3p/TLR4/NF-KB-vei (fig.8), noe som tyder på Myr som et potensielt terapeutisk middel for AS. I tillegg ble GAS5 foreslått å være et lovende målmolekyl som involverer de patofysiologiske prosessene til AS.
Referanser
1. Kondapalli, L., Bottinor, W. & Lenneman, C. Ved å slippe bremsene med immunterapi, akselererer vi åreforkalkning?.
Opplag 142(24), 2312-2315(2020).
2. Libby, P.Ridker, PM& Hansson, GKFremgang og utfordringer i å oversette biologien til aterosklerose. Nature 473(7347),
317-325 (2011).
3. Couto, NF et al. OxLDL-endringer i endotelcellemembrandynamikk fører til endringer i vesikkeltrafikk og økning
cellefølsomhet for skade.Biochim.Biophys.Acta Biomembranes 1862,183139 (2019).
4. Yamagata, K. Beskyttende effekt av epigallocatechin gallate på endotellidelser i aterosklerose. J. Cardiovasc. Pharmacol.75,
292-298(2019).
5. Gao, S. & Liu, J. Sammenheng mellom sirkulerende oksidert lavdensitetslipoprotein og aterosklerotisk hjerte- og karsykdom.
Kronisk Dis. Overs. Med. 3(2),89-94 (2017).
6. Torisu,K. et al. Intakt endotelial autofagi er nødvendig for å opprettholde vaskulær lipidhomeostase.Aging Cell15(1),187-191 (2016).
7. Pan,X. et al. Aktivering av Nrf2/HO-1-signal med Myricetin for å dempe ECM-nedbrytning i humane kondrocytter og ame-meliorering av murin artrose. Int. Immunopharmacol. 75,105742 (2019).
8. Li, M. et al. Myricetin undertrykker forplantningen av hepatocellulært karsinom via nedregulerende uttrykk av YAP. Celler 8(4),
358(2019).
9. Guo, C. et al. Myricetin forbedrer etanolindusert lipidakkumulering i leverceller ved å redusere fettsyrebiosyntesen. Mol
Nutr. Mat Res. 63(14), e1801393 (2019).
