Plantebaserte dietter har vært assosiert med lavere risiko for å utvikle kroniske sykdommer som fedme
Oct 11, 2022
Vær så snill og kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mer informasjon
Abstrakt:Det har blitt antydet at spinat metanolisk ekstrakt (SME) hemmer dannelsen av avanserte glykeringssluttprodukter (AGEs), som økes under diabetesprogresjon, så det er viktig å vite om SMBer har gunstige effekter på diabetisk retina. I denne studien viste in vitro-analyser at SME hemmer glykering, karbonylgruppedannelse og redusert tiolgruppeutarming i bovint serumalbumin inkubert enten reduserende sukker eller metylglyoksal. SME-effekten i netthinnen til streptozotocin-induserte diabetiske rotter (STZ2) ble også studert (n=10) i den normoglykemiske gruppen, STZ, STZ-rotter behandlet med SME og STZ-rotter behandlet med aminoguanidin (anti-AGEs referanse gruppe) i 12 uker. Netthinnen ble seksjonert og immunfarget for Ne-karboksymetyllysin (CML), reseptor RAGE, NADPH-Nox4, induserbar nitrogenoksidsyntase (iNOS), 3-nitrotyrosin (NT), nukleær NF-kB, vaskulær endotelial vekstfaktor ( VEGF), gliafibrillært surt protein (GFAP), S100B-protein og TUNEL-analyse. Lipidperoksidasjon ble bestemt i hele netthinnen ved malondialdehyd (MDA) nivåer. Resultatene viste at i den diabetiske netthinnen reduserte SME CML-RAGE samlokalisering, oksidativt stress (NOX4,iNOS,NT,MDA), betennelse (NF-B,VEGF,S10B, GFAP) og apoptose (p<0.05).therefore, smes="" could="" attenuate="" retinal="" degeneration="" by="" inhibiting="" cml-rage="">
Nøkkelord:spinat; diabetisk retinopati; avanserte glycation sluttprodukter; oksidativt stress; betennelse; RASERI; karboksymetyl L-lysin
1. Introduksjon
Plantebaserte dietter har vært assosiert med lavere risiko for å utvikle kroniske sykdommer som fedme, type 2 diabetes og koronar hjertesykdom. Spinat (Spinacia oleracea L.) er en spiselig bladgrønnsak som konsumeres over hele verden på grunn av å gi en betydelig mengde fibre, vitaminer og mineraler [1,2]. Flere av fytokjemikaliene er identifisert, inkludert klorofyll, karotenoider (lutein og zeaxanthin) [3], og fenoliske forbindelser (flavoner, flavonoider, kumariner) [4-8] (se tillegg 1). Det er rapportert at spinat, når det inntas som mat, vannløselig ekstrakt eller i frysetørket form, og dens tylakoider har anti-kreft, anti-fedme og hypoglykemiske egenskaper [9]. Den antiinflammatoriske effekten av spinat har blitt demonstrert i dyreendotoksemimodeller, overvektige dyr og friske mennesker [9]. Dens antioksidanteffekt ble studert i humane prostatakarsinomceller, dyremodeller med fedme, UV-bestrålte mus og adenokarsinom i den transgene museprostata [9,10]. Antiglykerings- og antiinflammatoriske effekter av spinat-metanolisk ekstrakt (SME) har blitt studert i modellen for glukose-indusert diabetes i henholdsvis sebrafisk og isoproterenol-indusert myokardnekrose hos rotter [11,12]. SME reduserte nivåene av glykosylert hemoglobin og fruktosamin, inkludert nivåene av glykosylert protein, ved å redusere aldosereduktaseaktiviteten i linsens okular [11]. Funnene ovenfor antyder at SMB kan ha en forebyggende effekt på progresjonen av diabetes mellitus-komplikasjoner som diabetisk retinopati (DR).
DR fører gradvis til tap av synsskarphet eller blindhet som har vært relatert til betennelse, oksidativt stress og akkumulering av avanserte glykeringssluttprodukter (AGEs) [13,14]. AGE-ene induserer proteinkryssbinding, endrer struktur/funksjon og omsetning/clearning. AGE-er kan produseres av en ikke-enzymreaksjon mellom glukosen med en fri aminogruppe av proteiner, og danner reversible mellomprodukter som Schiffs baser og Amadori-produkter (fruktosamin)[15]. Andre mekanismer for AGE-dannelse inkluderer "karbonylstress"-veien, der oksidasjon av sukker og lipider skaper dikarbonyl-mellomforbindelser som glyoksal og metylglyoksal (MGO), som fører til AGE-dannelse som N:-karboksymetyllysin (CML)[ 16]. Økte CML-nivåer i serum og glasslegeme kan være en biokjemisk markør for både utseende og progresjon av DR [17,18]. I netthinnen induserer aktiveringen av reseptor RAGE av AGEs (AGEs-RAGE) overekspresjon av glialfibrillært surt protein (GFAP) og pro-inflammatoriske faktorer, regulert av nu-clear faktor kappa-lettkjede-forsterker av aktivert B celler (NF-kB)[19]. NF-kB regulerer RAGE-uttrykk positivt ved å fungere som en positiv tilbakemeldingsmekanisme [20].hva er cistanchePå den annen side kan høye konsentrasjoner av S100B, et kalsiumbindende protein, også aktivere NF-kB, og indusere nevroinflammasjon og gliacelleaktivering [21]. Overekspresjonen av S100B i astrocytter provoserer nevrotoksiske effekter manifestert av retinal astrogliose [22].
Cistanche kan anti-aldring
Strategier er eksperimentelt utviklet for å forhindre skade på netthinnen. Noen fytokjemikalier av spinat isolert fra andre planter har blitt assosiert med hemming av AGE og oksidativt stress [8,23-26]. Lutein, astaxanthin og kaempferol har beskyttet menneskeavledede retinale pigmentepitelceller (ARPE-19) mot skade gjennom deres anti-AGE-, antioksidant- og anti-apoptoseegenskaper [26-28]. Disse resultatene tyder på at fytokjemikaliene til spinat har en relevant rolle i forebygging av retinal degenerasjon som DR. En annen strategi har vært å bruke aminoguanidin (AG) som en potent hemmer av glykering og iNOS-aktivitet, som svekker CML-akkumulering og dannelse av reaktive dikarbonyliske forløpere hos rotter [29]. I en multisentrisk og randomisert klinisk studie med 690 diabetespasienter ble den gunstige effekten imidlertid ikke klarlagt [30].
Endringene i retinal degenerasjon under hyperglykemiske forhold er knapt studert. Derfor er det interessant å vite om SME beskytter retinale lag mot skade relatert til dens anti-AGE, antioksidant og antiinflammatoriske egenskaper i netthinnen til streptozotocin-induserte diabetiske rotter.
2. Materialer og metoder
2.1. Fremstilling av metanolekstraktet av spinat (SME)
De friske bladene av spinat (S.oleracea L.) ble høstet i høst-vintersesongen i et jordbruksfelt i Puebla-provinsen, Mexico, og identifisert av en botaniker i herbariet til The National Polytechnic Institute (IPN, Mexico City, Mexico). Voucherprøve nummer 4532 ble deponert i herbariet til National School of Biological Sciences of IPN.
Bladene var dehydrert og finmalt. De tørkede bladene ble maserert med metanol ved romtemperatur, filtrert gjennom cellulosefiltre (Whatman, Maidstone, Storbritannia) og tørket ved bruk av en roterende vakuumfordamper (BUCHI Rotavapor R{{0}}, Sveits) ved 45 grader til gi en grønn tyggegummi (95,0 g/kg tørre blader).Anti aldring cistancheSME ble lagret mørkt ved 4 grader frem til bruk. For alle analyser ble ekstraktet rekonstituert i destillert vann[11].
2.2.In vitro-analyser av SMB-anti-glykeringsaktivitet
2.2.1. Dannelse av avanserte glykeringssluttprodukter avledet fra bovint serumalbumin (BSA-AGEs)
BSA-AGEs-analysen ble utført, som beskrevet tidligere [31]. Kort fortalt ble 10 mg/mL BSA (fraksjon V; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) tilsatt enten i D-glukose 0.5 M, D-fruktose {{12 }},5 M, eller metylglyoksal 2,5 mM, og laget i en løsning 0.1 M PBS (pH 7,4) og 0,02 prosent natriumazid. SME-konsentrasjoner (5, 10, 25, 50, 100 og 200 mg/ml) ble tilsatt til hver blanding og deretter inkubert ved 37 grader i 4 uker. Etterpå ble de ureagerte sukkerene fjernet ved dialyse mot destillert vann i to dager ved 4 grader. BSA-AGE-nivåer ble bestemt ved fluorescensspektrofotometri (Ex370/Em 440 nm; modell LS 30, PerkinElmer LAS Ltd., Buckinghamshire, Storbritannia) [32]. Glykeringen av BSA-protein ved å redusere sukker og MGO var en positiv kontroll (BSA-glykert), mens inkubasjonen av BSA-glykert med aminoguanidin (1 mg/ml) ble brukt som negativ kontroll (BSA-glykert-AG). Analysene ble utført i tre eksemplarer.
2.2.2. Fruktosaminanalyse
Fruktosaminnivået ble bestemt av nitroblått tetrazolium (NBT)-analysen [33], som er basert på fruktosamins evne til å redusere NBT, og danner formazan, et farget sluttprodukt under alkaliske forhold. Ti mikroliter av en av kontrollene eller glykerte BSA-inkuberte SME-konsentrasjoner (BSA-SME) ble tilsatt til 90 μL NBT ved 2,5 mM, fremstilt i en karbonatbuffer (0,1 M; pH 10,3); alle ble inkubert ved 37 grader C i 30 minutter. Absorbansen ved 530 nm ble målt. Konsentrasjoner av fruktosamin (nmol/mg) ble beregnet i henhold til en standardkurve for formazan.
2.2.3. Bestemmelse av dannelse av karbonylgrupper og utarming av tiolgrupper i BSA-AGE
Karbonylgruppekonsentrasjon ble målt i BSA-SME og kontrollprøver, ifølge Levine et al. [34]. En løsning av 2,4-dinitrofenylhydrazin (DNPH;10 mM) i 400 μL 2,5 M HCl ble tilsatt til 100 μL hver prøve og inkubert i mørke i 60 minutter ved romtemperatur.cistanche benefíciosDeretter ble 500 μL trikloreddiksyre (20 prosent w/v) tilsatt og holdt på is i 5 minutter. Prøvene ble sentrifugert ved 4000 rpm i 15 minutter, og proteinpelleten ble vasket tre ganger med etylacetat/etanol (1:1 v/v). Etterpå ble prøvene suspendert i 250μL guanidinhydroklorid til 6 M. Konsentrasjonen av karbonylgrupper (nmol/mg protein) ble beregnet ved spektrofotometri ved 370 nm absorbans (EON, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA) ved å bruke absorpsjonskoeffisient for DNPH (22 000 M-1 cm-1).
I henhold til Ellmans metode ble bestemmelsen av tiolgruppeutarming i BSA-SME og kontrollprøver utført. Kort fortalt ble 10 μL 5,5'-disulfandiylbis（2-nitrobenzoic acid）（DNTB;10 mM, fremstilt i PBS） med 50 μL glykerte prøver inkubert i 15 minutter ved romtemperatur, deretter ble absorbansen ved 410 nm målt. Nivået av frie tiolgrupper ble beregnet ved å bruke en standardkurve av L-cystein (0.4-11 μM) og uttrykt i nmol/mg protein [34].
2.3. Effekt av SMB på netthinnen til diabetesrotter 2.3.1. Diabetesinduksjon hos rotter
Wistar hannrotter som veide 250± 10 gr(N=40) fastet i 8 timer ble brukt. En intraperitoneal dose av streptozotocin (60 mg/kg) i sitratbuffer (10 mM, pH 4,5) (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA) ble administrert [35]. Tre dager senere ble glukosenivået målt (glukometer; ACCU-CHEK aktiv; Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Tyskland) ved å samle en dråpe av en blodprøve fra halen. Dyr med glykemiske nivåer høyere enn 350 mg/dL ble rekruttert til studien. Glukosen i blodet ble målt ukentlig i 12 uker.
2.3.2. Eksperimentelt design
De streptozotocin-induserte diabetiske rottene (STZ) ble delt tilfeldig inn i følgende grupper (n =10): STZ behandlet intragastrisk med 2 ml drikkevann (STZ); STZ behandlet med SME ved 400 mg/kg (STZ-SME); normoglykemiske rotter (NG); og STZ behandlet med 50 mg/kg aminoguanidin (AG; Sigma-Aldrich, Inc.)(STZ-AG). STZ-AG ble brukt som en anti-AGE referansegruppe. De tildelte dosene ble administrert hver 24. time (09:00) i 12 uker. Det glykemiske nivået i alle grupper ble overvåket ukentlig. SME-doseringsregimet ved 400 mg/kg var basert på følgende: 7 g SME oppnås fra 100 g fersk spinat (data ikke vist). Denne mengden tilsvarer det daglige forbruket til en gjennomsnittlig person på 70 kg i det amerikanske kostholdet [36], som tilsvarer 100 mg ekstrakt/kg kroppsvekt.Cistanche Extract Anti RadiationPå den annen side, på grunn av forskjellen i akselerert metabolisme hos rotter, anbefales det å øke forbruket av naturlig ekstrakt opptil 6,4 ganger for sammenligningsstudier med mennesker [37]. Dosen på 400 mg/kg som vi brukte var hovedsakelig basert på resultatene oppnådd i en modell av myokardnekrose indusert i Wistar-rotter, som viste at den antiinflammatoriske effekten av SME er mer signifikant ved 300 mg/kg [12].
2.3.3. Histologiske og immunhistokjemi-evalueringer
Enukleerte øyne ble fiksert i nøytralt formalin og ble deretter dehydrert i graderte alkoholer og innebygd i parafin. Histologiske seksjoner på 2 μm ble montert på elektroladede objektglass, avvokset og rehydrert opp til antigengjenvinningsløsning (K035; 10× sitratbuffer, pH6; Diagnostic BioSystems, Pleasanton, CA, USA). Et polymerbasert immundeteksjonssystem (PolyVuemous/kanin DAB-deteksjonssystem, Diagnostic BioSystems) ble brukt. Følgende primære antistoffer ble brukt: gliafibrillært surt protein (anti-GFAP;MAB360; Chemicon International, Inc., Temecula, CA, USA); vaskulær endotelial voksende faktor (anti-VEGF;sc-7269; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA), S100 kalsiumbindende protein B (anti-S100B; ab52642; Abcam PLC, Cambridge, Storbritannia) , og kjernefaktor kappa-lettkjede-forsterker av aktiverte B-celler (anti-NF-kB p65;sc-8008). Alle fortynninger var ved 1:200 og inkubert over natten ved 4 grader. Et sekundært antistoff (Mouse/Rabbit PolyVueTM) ble tilsatt i henhold til leverandørens instruksjoner.cistanche herbaSnitt ble farget med DAB pluss/kromogen-substrat og hematoksylin. Histologiske observasjoner og fangst av bilder ble utført i et Carl Zeiss mikroskop (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Tyskland).
For immunfluorescensfarging ble objektglassene inkubert over natten ved 4 grader C med følgende primære antistoffer: karboksymetyllysin (anti-CML; ab124145; Abcam PLC, Cambridge, Storbritannia), AGE-reseptor (anti-RAGE; sc-365154), NADPH-oksidase 4 (anti-Nox4;ab133303), 3-nitrotyrosin (anti-NT; ab110282), og nitrogenoksidsyntase (induserbar)(anti-iNOS; A00368-1;Boster Bio, Pleasanton, CA , USA). Deretter ble følgende sekundære antistoffer brukt: for anti-RAGE, geit-anti-mus lgG(FITC)-konjugert (1:200; Santa Cruz, Biotechnology, Inc.); for anti-CML og anti-NT, mus anti-kanin IgG-PE (SC-3753); og for anti-iNOS og anti-Nox4, m-IgGkBP-PE (Sc-516141). Alle ble inkubert ved romtemperatur i 60 minutter. Etterpå ble seksjoner montert i et medium som inneholdt 4',6-Diamidine-2'-fenylindoldihydroklorid (DAPI). Anti-CML og anti-RAGE antistoffer ble ko-hybridisert i det samme objektglasset. FLoidTM Cell Imaging Station (Life technologies Carlsbad, San Diego, CA, USA) ble brukt for fluorescensbilder.
2.3.4. Apoptosevurdering
Apoptosen til retinale celler ble oppdaget i henhold til manualen beskrevet av terminal deoksynukleotidyltransferase(TdT)-mediert deoksyuridintrifosfat (dUTP) nick-end-merking (TUNEL)-analyse ved bruk av In Situ Cell Death Detection Kit, TMR(tetramethyl-rhodamine{{ 3}}dUTP) rød, versjon 12 (12156792910; Roche Diagnostics). Kort fortalt ble de avvoksede objektglassene rehydrert og skylt to ganger med PBS. Deretter ble de inkubert med TUNEL-reaksjonsblandingen i en fuktet atmosfære i 60 minutter ved 37 C. Etterpå ble seksjoner montert med DAPI og observert i fluorescensmikroskopi (FLoidTM Cell Imaging Station). IOD for TUNEL ble beregnet for netthinnelag.
2.3.5. Lipidperoksidasjonsanalyse
For evaluering av malondialdehyd (MDA)-nivåer i retinalvevet ble omtrent 3 mg ferskt vev (n=3) homogenisert og behandlet som tidligere rapportert [38]. MDA-nivåer ble kvantifisert etter kitleverandørens instruksjoner (OXItek-TBARS analysesett, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA).
2.4.Statistisk analyse
For statistisk analyse ble alle netthinnemikrofotografier tatt med en styrke på 200× ved 100 μm utenfor synsnerveområdet. Omtrent 40 bilder per gruppe dyr (n=7) ble analysert. Bildeanalyse ble utført med programvaren Image-Pro Premier versjon 9.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA). Vi brukte GraphPad Prism-programvare (La Jolla, CA, USA; versjon 8.0). Figurene viser verdier grafisk i boks-og-whisker-plott (median, første-tredje kvartil, minimum-maksimum verdi) for ganglioncellelaget (GCL), indre kjernelag (INL) og ytre kjernelag (ONL). Gjennomsnitt og standardavvik (gjennomsnitt ± SD) er vist i vedlegg A (tabell A1-A3). I alle tilfeller ble det utført en enveis ANOVA-test etterfulgt av Tukeys test. s<0.05 was="" considered="" statistically="">
