NGF modulerer kolesterolmetabolisme og stimulerer ApoE-sekresjon i gliaceller som gir nevrobeskyttelse mot oksidativt stress Del 2

2.6. NGF-mediert sekresjon av ApoE av U373 beskytter nevronale celler mot oksidativ fornærmelse

Akkumulerende bevis fremhever at ApoE øker nevronal motstandskraft mot oksidative fornærmelser, og forhindrer dermed apoptose og nevrodegenerasjon [17,18,37]. I denne sammenheng evaluerte vi om NGF-indusert ApoE-sekresjon av U373-celler kunne beskytte N1E-115-neuroner fra oksidativt stress. Fullt differensiert N1E-115 ble forhåndsbehandlet med rotenon, som induserer oksidativt stress ved å hemme mitokondriekomplekset I.

Apoptose er en prosess med selvdestruksjon, og det er en viktig måte for cellene å opprettholde kroppens homeostase gjennom programmert selvdestruksjon under visse omstendigheter. Apoptose spiller forskjellige roller i ulike stadier av livet.

Nyere studier har vist at det er en viss sammenheng mellom apoptose og hukommelse. Vi vet allerede at hukommelse er en kompleks nevral prosess i hjernen, som involverer forbindelser og koordinering mellom flere hjerneregioner. Apoptose kan spille en rolle i denne nevrale prosessen.

På den ene siden kan apoptose stabilisere nettverksstrukturen til nevroner ved å fjerne unødvendige nevroner og synapser, noe som gjør forbindelsene til nevroner mer raffinerte, og dermed forbedre kvaliteten og effektiviteten til minnet. På den annen side kan overdreven apoptose også føre til en reduksjon i antall hjerneceller, noe som kan påvirke lagring og fangst av minner negativt.

Derfor, mens vi opprettholder passende nivåer av apoptose, kan vi forbedre hukommelsen gjennom en rekke atferd og ferdigheter, som å lese, lære, trene og justere tankegangen vår. Disse atferdene og ferdighetene kan fremme vekst og tilkobling av hjerneceller og forbedre kvaliteten og effektiviteten til hukommelsen ved å stimulere forbindelsene og koordineringen mellom hjerneneuroner.

Konklusjonen er at forholdet mellom apoptose og hukommelse er komplekst. Bare mens vi opprettholder riktig apoptose kan vi stimulere hjernen vår og forbedre hukommelsen vår gjennom en rekke atferd og ferdigheter. Fra dette synspunktet må vi forbedre hukommelsen vår. Cistanche deserticola kan i betydelig grad hjelpe oss med å forbedre hukommelsen vår, fordi Cistanche deserticola også kan regulere balansen mellom nevrotransmittere, som å øke nivåene av acetylkolin og vekstfaktorer. Disse stoffene er viktige for hukommelsen. Det er veldig viktig for læring og læring. I tillegg kan kjøtt fra kjøtt også forbedre blodflyten og fremme oksygentransport, noe som kan sikre at hjernen får tilstrekkelig med næringsstoffer og energi, og dermed forbedre hjernens vitalitet og utholdenhet.

Klikk vet kosttilskudd for å forbedre hukommelsen

Etter 16 timers rotenoneksponering ble N1E-115-nevroner dyrket i ferskt medium (Ctrl), kondisjonert medium fra U373-celler (U373-Ctrl), kondisjonert medium fra U373 forhåndsbehandlet med NGF i 48 timer (U373-NGF), eller kondisjonert medium fra ApoE-dempet U373 forhåndsbehandlet med NGF i 48 timer (U373-NGF ApoE siRNA). Rotenon-forbehandling reduserte antallet N1E-115 som ble dyrket i kontrollmediet sterkt, noe som indikerer at administrering av dette plantevernmiddelet har en alvorlig innvirkning på N1E-115-overlevelsen.

Rotenon-cytotoksisitet bestemte også intens nevritt-retraksjon, som observert av lengden på nevrittene. Nevrittskade fremkalt av rotenonbehandling var spesielt tydelig ved evaluering av neurittbærende celler, ettersom antallet N1E-115 med neuritter sank til 50 %. Lignende resultater ble oppnådd når N1E-115-celler ble dyrket i U373-Ctrl-kondisjonert medium, noe som tyder på at tilstedeværelsen av supernatant avledet fra ustimulerte astrocytter ikke er tilstrekkelig til å beskytte nevronceller fra rotenon-mediert toksisitet. På tvert imot forhindret påføring n av kondisjonert medium avledet fra NGF-behandlet U373 effektivt nevronal død, så vel som reduksjonen i neurittbærende celler og neurittlengde forårsaket av rotenonadministrering (figur 5).

Enda viktigere y, det kondisjonerte mediet avledet fra ApoE-dempede U373-celler mistet fullstendig de fordelaktige effektene indusert d av U373-NGF-kondisjonert medium, noe som indikerer at nevrobeskyttelse er drevet av NGF-mediert ApoE-frigjøring i kulturmediet. Spesielt beholdt kondisjonert medium fra NGF-behandlet U373 transfektert med kryptert siRNA fullstendig de beskyttende effektene som utøves av U373-NGF-kondisjonert medium, noe som demonstrerer at tapet av nevrobeskyttelse observert i kondisjonert medium fra ApoE-dempede celler er effektivt avhengig av ApoE nedregulering (Figur S3C).

Figur 5. Effekter av U373-kondisjonert medium på oksidativt stress i nevroner. Representative bilder i lyst felt og kvantitativ vurdering av nevronal morfologi av N1E -115. Celler ble tidligere behandlet (+) eller ikke (−) med rotenon (0.1 µM) i 16 timer, og deretter dyrket i fersk DMEM (Ctrl), i et kondisjonert medium avledet fra kontroll U373 (U{{ 9}}Ctrl), NGF-forbehandlet U373 (U373-NGF) og NGF-forbehandlet U373 stilnet for apoE (U373-NGF ApoE siRNA) i 48 timer. n=5 forskjellige eksperimenter. Data representerer gjennomsnitt ± SD. Statistisk analyse ble vurdert ved å bruke enveis ANOVA, etterfulgt av Tukeys post hoc-test. ** p < 0.01, *** p < 0,001.

For å styrke resultatene oppnådd fra det kondisjonerte mediet, utførte vi U373/N1E115 samkulturer. For å starte ble U373-celler forhåndsbehandlet eller ikke med NGF i 48 timer. Videre ble differensierte N1E-115-celler forhåndsbehandlet eller ikke med rotenon i 16 timer. Deretter ble U373-mediet erstattet med ferskt medium som inneholdt 0.5 % FBS, og dekkglass frøet med N1E-115 ble overført til U373-laget for å fremstille samkulturer (Figur 6A).

Oksidativ skade fremkalt av rotenonbehandling påvirket celleviabilineurittbærende celler betydelig og neurittlengden til kontroll N1E-115 og N1E-115 samdyrket med U373-Ctrl-astrocytter (Figur 6B). I samsvar med eksperimenter med kondisjonert medium ble N1E-115-celler dyrket sammen med U373-NGF-celler beskyttet mot oksidativ skade, mens ApoE-demping i U373 opphevet nevrobeskyttelsen som ble opprettholdt av NGF.

Figur 6. ApoE-sekresjon av NGF-behandlede U373-celler gir nevrobeskyttelse mot oksidativt stress. (A) Representativt opplegg for astrocytt-nevron-kokulturer satt opp som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Neurittbærende celler, neurittlengde og celleantall ble vurdert timer etter etablering av samkultur. (B) Representative bilder i lyst felt og kvantitativ vurdering av nevronal morfologi av N1E-115-celler, tidligere behandlet (+) eller ikke (-) med rotenon (0.1 µM) i 16 timer.

N1E-115 ble deretter holdt i fersk DMEM (Ctrl), eller samdyrket med kontroll U373 (U373-Ctrl), NGF-forbehandlet U373 (U373-NGF), og NGF-forbehandlet U373 stilnet for ApoE (U373-NGF ApoE siRNA) i 48 timer. n=5 forskjellige eksperimenter. Data representerer gjennomsnitt ± SD. Statistisk analyse ble utført ved å bruke enveis ANOVA, etterfulgt av Tukeys post hoc-test. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001.

3. Diskusjon

Ubalanser i signalveier for nevrotrofin, så vel som endringer i hjernens kolesterolmetabolisme, er sterkt assosiert med nevrologiske og nevrodegenerative sykdommer, som Rett syndrom, HD, Alzheimers sykdom (AD) og Parkinsons sykdom (PD) [2,38,39] . I denne sammenhengen er grunnleggende forskning på den biologiske aktiviteten til nevrotrofiner avgjørende for å dissekere de molekylære mekanismene som forbinder kolesterolmetabolisme og hjernefysiopatologi. I løpet av de siste årene har en interessant studie rapportert en rolle for BDNF i reguleringen av kolesterolmetabolismen i astrocytter [38].

Til tross for denne oppfatningen er ingen informasjon tilgjengelig om den antatte involveringen av NGF i reguleringen av astrocytisk kolesterol. Derfor, i dette arbeidet, fokuserte vi på den potensielle rollen som utøves av NGF i reguleringen av kolesterolmetabolisme, med spesiell referanse til påvirkningen av ApoE-sekresjon på nevronal differensiering og overlevelse. U373, astrocytomcellelinjen brukt som en eksperimentell modell av humane astrocytter, beholder potensialet til å reagere fullt ut på NGF, da den uttrykker betydelige nivåer av både TrkA og p75NTR.

Hovedresultatene indikerte at NGF oppregulerer nivåene av hovedproteinene involvert i kolesterolbiosyntese (HMGCR), intracellulær trafficking (NPC1) og sekresjon (ABCA1). Disse hendelsene er ledsaget av en samtidig økning av ApoE og kolesterollein i kulturmediet, noe som tyder på at NGF øker kolesterolbiosyntesen og ekstrudering fra gliaceller. Det er rapportert at NGF induserer ApoE-proteinekspresjon ved å øke transkripsjonen [40]. Imidlertid observerte vi ingen signifikant endring i intracellulært ApoE-uttrykk. Denne tilsynelatende inkonsekvensen kan forklares siden ApoE-oppbygging ikke kan verdsettes på grunn av dens økte utstrømning fra NGF-behandlet UIn
I et forsøk på å bedre dissekere de molekylære mekanismene, behandlet vi U373 med LM11A -31 og fant at p75NTR-modulatoren bare var i stand til å etterligne økningen i HMGCR-ekspresjon mediert av NGF. Involveringen av p75NTR i moduleringen av HMGCR-nivåer er i samsvar med tidligere data oppnådd i andre celletyper, som viser at denne reseptoren kontrollerer transkripsjonen av kolesterogene enzymer [41]. Imidlertid induserte LM11A-31 ingen endringer verken i de andre proteinene som ble analysert i denne studien, inkludert ABCA1, eller i kolesterol- og ApoE-nivåer i kulturmediet, noe som indikerer at den selektive moduleringen av p75NTR ikke er tilstrekkelig til å fremme kolesterol ekstrudering gjennom ApoE-rike partikler observert i NGF-behandlede celler. Disse resultatene fører til at vi antar at NGF styrer kolesterolmetabolismen i gliaceller gjennom involvering av både p75NTR- og TrkA-reseptorer.

Det er velkjent at nevrotrofinbinding til Trk-reseptorer aktiverer ERK1/2, og regulerer dermed flere veier involvert i celledifferensiering, proliferasjon og overlevelse [2,38]. Interessant nok har det blitt observert at ERK1/2-aktivering også regulerer ABCA1- og ApoE-ekspresjon i forskjellige celletyper [38,42,43]. Disse funnene, sammen med bevisene på at BDNF/TrkB/ERK-aksen fremmer ApoE-ekstrudering og ABCA1-ekspresjon i gliaceller [38], antyder at en signaltransduksjonsvei som involverer TrkA/ERK-aksen kan forklare en del av effektene som utøves av NGF i vår studie.

Selv om ingen endringer ble observert i nevrittutvekst, indikerte bruken av U373--kondisjonert medium og etableringen av samkultureksperimenter at den økte ApoE-sekresjonen fra gliaceller mediert av NGF er avgjørende for å forhindre de skadelige resultatene indusert av oksidativt stress i nevronceller. For å indusere cytotoksisitet brukte vi rotenon, et plantevernmiddel som vanligvis brukes i preklinisk forskning for å indusere mitokondrieravledede reaktive oksygenarter (ROS) og påfølgende apoptose [44].

Resultatene våre fremhever at NGF stimulerer ApoE-sekresjon av gliaceller, noe som er nødvendig for å garantere de nevrobeskyttende effektene mot rotenonadministrering i differensierte N1E-115-celler. Rollen til ApoE i forebygging av oksidativt stress er godt dokumentert. For eksempel forverrer ApoE-uttømming i musemodeller oksidativ skade i hjernevev [45,46]. Følgelig beskytter administrering av eksogen ApoE mot irreversibel oksidativ skade fra hydrogenperoksidbehandling ved å motvirke sekundær glutamattoksisitet [18]. I tillegg er ApoE-holdige lipoproteiner effektive i å dempe apoptose indusert ved tilbaketrekking av trofisk støtte i retinale ganglieneuroner [47].

I vår studie antyder bruken av rotenon at ApoE-mediert nevrobeskyttelse, fremmet av NGF-stimulerte gliaceller, kan være relevant i sammenheng med nevrodegenerative tilstander som PD. Spesielt reproduserer rotenon dopaminerg nevronal degenerasjon lik den som er observert i PD, både i dyremodeller og cellekulturer, inkludert N1E -115--avledede nevroner [48–50]. Sammenhengende støtter resultatene våre tidligere bevis som viser at ApoE fremkaller nevrobeskyttelse ved administrering av 6-hydroksydopamin (6-OHDA), et annet nevrotoksin som er i stand til å indusere en PD-lignende fenotype [51]. Samlet viser vår studie at NGF er en avgjørende modulator av kolesterolmetabolisme og ApoE-ekstrudering fra gliaceller. Det viktigste er at forbedringen i ApoE-sekresjon fremmet av dette nevrotrofinet er nødvendig for å sikre nevrobeskyttelse mot rotenon-cytotoksisitet.

BDNF er det mest utbredte nevrotrofinet i den voksne hjernen. Til tross for disse bevisene, har det blitt vist at NGF kan spille en avgjørende rolle ikke bare under utviklingen, men også i det voksne sentralnervesystemet. For eksempel påvirker NGF hippocampus aktivitet og, som en konsekvens, romlig hukommelse og læring [52]. Andre funn tyder på at NGF viser en nevrobeskyttende effekt på nigrostriatale dopaminerge nevroner og at denne aktiviteten kan legge grunnlaget for nye NGF-baserte terapeutiske tilnærminger for PD [53].

I følge denne oppfatningen har det blitt vist at produksjonen av NGF er dypt regulert i astrocytter i voksen alder og utøver modulerende handlinger på nevroinflammasjon, hjerneskade og nevrodegenerasjon [54–56]. I denne sammenhengen ville det være interessant å evaluere, i fremtidige studier, om disse effektene kan formidles, i det minste delvis, ved modulering av glialkolesterol fremmet av NGF. Dette arbeidet presenterer noen begrensninger som bør overvinnes i de neste eksperimentelle undersøkelsene; for eksempel ville det være viktig å bedre dissekere de molekylære mekanismene som forbinder NGF-behandling og kolesterolmetabolisme i gliaceller.

En bred forståelse er nyttig for å identifisere spesifikke molekylære mål som er tilgjengelige for farmakologisk manipulasjon som kan brukes i nevrodegenerative sammenhenger. Videre, selv om U373- og N1E-115-celler er mye brukt som håndterbare cellelinjer for å reprodusere henholdsvis astrocytiske og nevronale egenskaper [27–29,57], bør disse funnene bekreftes ytterligere i primære cellekulturer. Selv om ytterligere innsats bør gjøres for å styrke involveringen av nevrotrofinsignalering i hjernens kolesterolhomeostase, viser dette arbeidet for første gang at NGF indirekte kan utøve nevrobeskyttelse ved å påvirke glialkolesterolmetabolismen.

4. Materiale og metoder

4.1. Cellekultur

N1E-115-nevroblastomceller og U373-celler ble dyrket ved 5 % CO2 i DMEM ved høy glukose (Merck Life Science, Milano, Italia), med 10 % (v/v) føtalt bovint serum (FBS) (Merck Life Science) , Milano, Italia), og tilsatt penicillin/streptomycin-løsning.

For å indusere nevronal differensiering ble N1E-115-celler sådd ved 30% konfluens og ble byttet til DMEM med 0,5% FBS i 96 timer.

For å indusere nevronal differensiering ble N1E-115-celler sådd ved 30% konfluens og ble byttet til DMEM med 0,5% FBS i 96 timer.

Astrocytt-nevron-kokulturer ble satt opp i henhold til protokollen beskrevet av Ioannou og kolleger, med modifikasjoner [59]. Parafinavstandsstykker ble presset på dekkglass for å sikre vedheft; vi brukte spacere på nevronale dekkglass for effektivt å forhindre mekanisk skade når cellene ble plassert vendt mot hverandre. Dekkglass ble deretter sterilisert i etanol og belagt med poly-D-lysin (Merck Life Science, Milano, Italia). N1E-115 ble sådd på de belagte dekkglassene med ønsket tetthet, og når de var klare for samkulturen, ble sterile pinsett brukt til å løfte dekkglassene med N1E-115-nevroner og plassere dem med forsiden ned i { {10}}brønner sådd med U373-astrocytter.

Forbehandlinger på N1E-115-celler ble utført ved å administrere 0.1 µM rotenon (Sigma-Aldrich, Milano, Italia, R8875) i 16 timer. Kontrollceller mottok DMSO (fortynning 1:1000 i cellekulturmedium) som bærer. U373-celler ble behandlet med NGF (Alomone Labs, Jerusalem, Israel, N-245) i dosen 100 ng/mL i 48 timer i alle eksperimentene.

4.2. Lysatpreparat og Western Blot-analyse

U373-celler ble sonikert (duty cycle 20%, output 3) i prøvebuffer (0,1Tris-HClisHCl inneholdende 10% SDS, proteasehemmercocktail, pH 6,8) for å oppnå et totalt lysat, som tidligere beskrevet [ 60,61]. Laemmli buffer ble tilsatt, og prøvene ble denaturert ved 95 ◦C i 5 min. Proteinekstrakter (tjue mikrogram proteiner) ble løst på SDS-PAGE, og overføring til nitrocellulosemembran ble utført ved å bruke et trans-blot turbooverføringssystem (Biorad Laboratories, Milano, Italia), som tidligere rapportert [62].

Deretter ble membranen inkubert ved romtemperatur i 1 time med 5 % fettfri tørrmelk i Tris-bufret saltvann (25 mM Tris-HCl, 138 mM NaCl, 27 mM KCl, 0.05 % Tween{ {10}}, pH 6,8) og probet over natten ved 4 ◦C med følgende primære antistoffer: anti-p75NTR (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-271708, fortynning 1:500), anti- TrkA (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-118, fortynning 1:500), anti-SREBP-1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-8984 , fortynning 1:1000), anti-SREBP-2 (Abcam, Cambridge, Storbritannia, ab30682, fortynning 1:1000), anti-HMGCR (Abcam, Cambridge, Storbritannia, ab242315, fortynning 1:1000), anti-LDLr (Abcam, Cambridge, Storbritannia, ab30532, fortynning 1:500), anti-NPC1 (Novus Biologicals, Centennial, CO, USA, NB400-148, fortynning 1:3000 ), antiABCA1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-58219, fortynning 1:400), anti-ApoE (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-53570, fortynning 1 :400), anti-vinkulin (SigmaAldrich, Milan, Italia, V9264, fortynning 1:10 000), og anti- -aktin (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-47778, fortynning 1 :10 000).

Membraner ble suksessivt inkubert i 1 time ved romtemperatur med HRP-konjugerte sekundære anti-mus- eller anti-kanin-antistoffer (Bio-Rad Laboratories, Milano, Italia). Proteinbundne antistoffer ble visualisert ved klarhet ECL Western blotting (Bio-Rad Laboratories, Milano, Italia, #1705061), og kjemiluminescens ble registrert gjennom ChemiDoc MP-systemet (Bio-Rad Laboratories, Milano, Italia). Densitometrisk analyse avledet fra Western blots ble deretter utført ved å bruke ImageJ versjon 1.52t (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) programvare for Windows. Vinkulin eller -aktin ble brukt som husholdningsproteiner, som fungerte som interne kontroller for proteinlasting. Densitometriske beregninger ble oppnådd som vilkårlige enheter, utledet fra forholdet mellom intensiteten til proteinbåndet og det respektive husholdningsproteinet.

4.3. Oljerød O-farging

U373-celler ble sådd på poly-L-lysin (Sigma-Aldrich, P6282-5MG)-belagte dekkglass i 6-brønnplater, og oljerød O-farging ble utført som tidligere rapportert [60]. Kort fortalt ble cellene fiksert i paraformaldehyd (4% løsning) i 10 minutter og forsiktig skylt tre ganger med PBS. Faste celler ble inkubert med 60% isopropanol i 5 minutter og deretter vasket med destillert vann. Deretter ble cellene undersøkt med 1 mL Oil Red O arbeidsløsning (Sigma-Aldrich, O1391-250ML) i 15 minutter ved romtemperatur ved å sette 6-brønnplaten på en orbital rotatorrister. Etter inkubasjonen med fargeløsningen ble brønnene vasket tre ganger med destillert vann for å eliminere overskuddsflekken.

Dekkglass ble til slutt montert med Fluoroshield monteringsmedium (Sigma-Aldrich, F6182), og Oil red O autofluorescens ble visualisert via konfokal mikroskopi (TCS SP8; Leica, Wetzlar, Tyskland). Bildene ble tatt med Leica TCS SP8 utstyrt med en 63× forstørrelse og Leica LAS X-programvare (Milan, Italia). Kvantifisering av oljerød O-farging ble utført gjennom ImageJ-programvare for Windows og beregnet som gjennomsnittlig fluorescensintensitet per celleareal.
4.4. Filippinsk farging

Filippinsk farging ble utført ved bruk av filippinsk kompleks (Sigma-Aldrich, F9765). Filipinsk stamløsning (10 mg/ml i PBS) ble alltid tilberedt rett før bruk. Celler ble fiksert i paraformaldehyd (4% løsning) i 10 minutter og vasket med PBS. U373 ble deretter farget med 1 ml filippinsk arbeidsløsning (0,05 mg/ml i PBS) i 1 time i mørket, ved romtemperatur. Deretter ble cellene vasket tre ganger med PBS, og dekkglass ble montert med Fluoroshield monteringsmedium og umiddelbart analysert gjennom konfokal mikroskopi ved bruk av et UV-filtersett (340–380 nm eksitasjon). Bildene ble tatt med 40X forstørrelse. Filippinsk kvantifisering ble beregnet som gjennomsnittlig fluorescensintensitet per celleområde ved å bruke ImageJ-programvare for Windows.

4.5. Kolesterol kvantifisering

Kolesterolkvantifisering ble utført ved å bruke en kolorimetrisk analyse (Cholesterol Quantitation Kit, MAK043, Sigma-Aldrich, Milano, Italia) etter produsentens instruksjoner.

4.6. ELISA
ApoE-nivåer i kulturmediet ble vurdert ved å bruke Human Apolipoprotein E ELISA Kit (Abcam, Cambridge, UK, ab108813), i henhold til produsentens instruksjoner.

4.7. Immunfluorescens

Immunfluorescens av U373-celler ble utført som tidligere beskrevet [60]. U373 ble fiksert i paraformaldehyd (4 % i PBS) og sondert over natten med primære antistoffer: anti-p75NTR (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-271708, fortynning 1:100), og anti-TrkA ( Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-118, fortynning 1:100). Deretter ble cellene inkubert i 1 time med geit-anti-mus sekundært antistoff Alexa Fluor 555 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA, A28180) og med geit-anti-kanin sekundært antistoff Alexa Fluor 488 (ThermoFisher Scientific, USA Waltham, MA, MA, USA , A27034). DAPI-farging ble utført for å visualisere kjerner, og dekkglass ble til slutt montert med et Fluoroshield-monteringsmedium. Prøver ble analysert via konfokal mikroskopi, som beskrevet ovenfor.

4.8. ApoE Silencing

ApoE-mRNA-demping ble utført på U373-celler ved bruk av ApoE siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-29708) i henhold til produsentens instruksjoner. Transfeksjonen ble satt opp i en 6-brønn vevskulturplate hvor 100,000 celler per brønn ble sådd i DMEM-antibiotikafritt vekstmedium supplert med 10 % FBS i 24 timer. For hver brønn ble siRNA Transfection Medium (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-36868) ​​tilsatt til siRNA Transfection Reaction-løsningen, fremstilt ved bruk av siRNA duplex og siRNA Transfection Reagent (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc29528). Cellene ble deretter vasket en gang med siRNA-transfeksjonsmedium og dekket med den tidligere laget transfeksjonsblanding. Deretter ble kulturplaten inkubert i 7 timer ved 37 ◦C i en 5% CO2-inkubator.

DMEM-vekstmedium med 20 % FBS og antibiotika (2-fold normal konsentrasjon) ble tilsatt til transfeksjonsblandingen i hver brønn med et forhold på 1:1. Celler ble inkubert i 18 timer, og deretter ble mediet tømt ut og erstattet med friskt normalt vekstmedium; 24 timer etter dette siste trinnet var cellene klare til å brukes for videre eksperimenter. Effektiviteten til ApoE-demping ble vurdert ved RT-qPCR i U373-celler og ved ELISA i cellesupernatanten; ApoE siRNA forhindret effektivt ApoE induksjon av NGF sammenlignet med scramble siRNA (ApoE mRNA: 83 % reduksjon; ApoE ELISA: 78 % reduksjon). Spesielt var ApoE-ekspresjon ved siRNA-demping lavere enn de basale ekspresjonsnivåene observert i kontroll U373 (ApoE mRNA: 72 % reduksjon; ApoE ELISA: 58 % reduksjon) (Figur S 3A, B).

4.9. RNA-ekstraksjon og sanntids-PCR

mRNA-analyse ble utført som tidligere rapportert [22,63]. Kort fortalt ble totalt RNA fra U373-celler ekstrahert med TRI-reagens (Merck Life Science, Milano, Italia) i henhold til produsentens instruksjoner. DNAse-behandling (Ambion, Thermo Fisher Scientific, Milano, Italia) ble utført, og deretter ble RNA renset ved hjelp av et RNA-oppryddingssett (Zymo, Italia). RNA ble suksessivt revers transkribert til cDNA gjennom et høykapasitets cDNA revers transkripsjonscellesett (Applied Bio-System, Foster City, CA, USA) og brukt til qPCR-analyse.

Primere brukt i qRT-PCR for apoE var: fremover 5 0 -GGGTCGCTTTTGGGATTACCTG-30 og revers 50 -CAACTCCTTCATGGTCTCGTCC3 0. Primere brukt i qRT-PCR for gapdh (valgt som referansegen) var: fremover 50 - GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-30 og revers 50 -ACCACCCTGTTGCTGTAGCCA-30. Produksjonen av riktig amplikon ble vurdert ved evaluering av smeltekurven. Hver biologisk prøve ble kjørt i tre eksemplarer med SYBR grønn IQ-reagens (Bio-Rad Laboratories, Milano, Italia) og ved bruk av CFX Connect-deteksjonssystemet (Bio-Rad Laboratories, Milano, Italia).

4.10. Kvantitativ vurdering av nevronal morfologi

Nevronal morfologi i N1E-115-celler ble estimert ved å ta bilder med et invertert mikroskop. Morfometrisk analyse ble utført gjennom ImageJ-programvare for Windows, og antall totale celler (uttrykt som en prosentvis variasjon av kontrollen), gjennomsnittlig neurittlengde (uttrykt som en prosentandel av kontrollen) og neurittbærende celler ble estimert. For nevrittbærende celler ble prosentandelen beregnet ved å dele antall differensierte celler med totalt antall celler per felt. N1E-115 ble devaer differensiert når de hadde minst én neuritt a med lengde lik eller større enn diameteren til somaen. Morfologisk evaluering ble utført på minst fem uavhengige eksperimenter, der minst tre bilder ble analysert.

4.11. Statistisk analyse

Alle resultatene presentert i denne studien ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD (standardavvik normalfordeling av dataene ble kontrollert ved bruk av Shapiro–Wilk-testen. Når to eksperimentelle grupper ble sammenlignet, ble uparrede tester brukt. Men når tre eller flere grupper ble sammenlignet, ble det benyttet en enveis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av Tukeys post hoc test.. Når det gjelder forsøkene med rotenon, hvor to variable var til stede, ble det brukt toveis ANOVA etterfulgt av en Bonferroni post-test. p < 0.05 ble ansett for å være statistisk forskjellige. Statistisk analyse ble utført ved bruk av GraphPad Prism 5 (GraphPad, La Jolla, CA, USA) for Windows.

Forfatterbidrag:

Konseptualisering, MS; metodikk, MS og MC; validering, MS og MC; formell analyse, MS, MC, DP og MP; etterforskning, MC, NM, LL, MP og DP; ressurser, MS og VP; datakurering, MS og MC; skriving – originalutkast, MS og MC; skriving – gjennomgang og redigering, MP, LL, DP, NM og VP; visualisering, MS, MC og MP; tilsyn, MS; prosjektadministrasjon, MS; finansieringsanskaffelse, MS Alle forfattere har lest og godtatt den publiserte versjonen av manuskriptet.

Finansiering:

Denne forskningen ble finansiert av Funds for Departmental Research 2021 (University of Molise) til MS, og av Jerome Lejeune Foundation call for Grants session 2021a, #2043 to MS

Uttalelse fra institusjonell revisjonskomité:

Ikke aktuelt.

Erklæring om informert samtykke:

Ikke aktuelt.

Datatilgjengelighetserklæring:

Ikke aktuelt.

Anerkjennelser:

Vi takker Claudia Tonini for hjelpen med kolesterolanalysen

Interessekonflikter:

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Referanser

1. Björkhem, I.; Meaney, S.; Fogelman, AM Brain Cholesterol: Long Secret Life behind a Barrier. Arterioskler. Thromb. Vasc. Biol. 2004, 24, 806–815. [CrossRef] [PubMed]

2. Colardo, M.; Martella, N.; Pensabene, D.; Siteni, S.; Di Bartolomeo, S.; Pallottini, V.; Segatto, M. Neurotrophins som nøkkelregulatorer for cellemetabolisme: Implikasjoner for kolesterolhomeostase. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 5692. [CrossRef] [PubMed]

3. Goritz, C.; Mauch, DH; Pfrieger, FW Flere mekanismer medierer kolesterol-indusert synaptogenese i en CNS-neuron. Mol. Celle. Neurosci. 2005, 29, 190–201. [CrossRef] [PubMed]

4. Pfenninger, KH Plasmamembranutvidelse: En nevrons herkuliske oppgave. Nat. Rev. Neurosci. 2009, 10, 251–261. [CrossRef]

5. Takamori, S.; Holt, M.; Stenius, K.; Lemke, EA; Grønborg, M.; Riedel, D.; Urlaub, H.; Schenck, S.; Brügger, B.; Ringler, P.; et al. Molekylær anatomi til en menneskehandelsorganell. Cell 2006, 127, 831–846. [CrossRef] [PubMed]

6. Suzuki, S.; Kiyosue, K.; Hazama, S.; Ogura, A.; Kashihara, M.; Hara, T.; Koshimizu, H.; Kojima, M. Hjerneavledet nevrotrofisk faktor regulerer kolesterolmetabolismen for synapseutvikling. J. Neurosci. 2007, 27, 6417–6427. [CrossRef]

7. Segatto, M.; Leboffe, L.; Trapani, L.; Pallottini, V. Kolesterolhomeostasesvikt i hjernen: Implikasjoner for synaptisk dysfunksjon og kognitiv nedgang. Curr. Med. Chem. 2014, 21, 2788–2802. [CrossRef] [PubMed]

8. Jeske, DJ; Dietschy, JM Regulering av hastigheter for kolesterolsyntese in vivo i leveren og kadaveret til rotten målt ved bruk av [3H]vann. J. Lipid Res. 1980, 21, 364–376. [CrossRef]

9. Pfrieger, FW; Ungerer, N. Kolesterolmetabolisme i nevroner og astrocytter. Prog. Lipid Res. 2011, 50, 357–371. [CrossRef]

10. Nieweg, K.; Schaller, H.; Pfrieger, FW Markerte forskjeller i kolesterolsyntese mellom nevroner og gliaceller fra postnatale rotter. J. Neurochem. 2009, 109, 125–134. [CrossRef]

11. Oram, JF; Heinecke, JW ATP-bindende kassetttransportør A1: En cellekolesteroleksportør som beskytter mot kardiovaskulær sykdom. Physiol. Rev. 2005, 85, 1343–1372. [CrossRef]

12. Pfrieger, FW Outsourcing i hjernen: Er nevroner avhengig av kolesterollevering av astrocytter? BioEssays 2003, 25, 72–78. [CrossRef]

13. Christopherson, KS; Ullian, EM; Stokes, CCA; Mullowney, CE; Helvete, JW; Agah, A.; Lawler, J.; Mosher, DF; Bornstein, P.; Barres, BA Trombospondiner er astrocyttutskilte proteiner som fremmer CNS-synaptogenese. Cell 2005, 120, 421–433. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com