Olivenbladekstrakt (OLE) svekket vasopressin-indusert Aquaporin-2-handel gjennom aktiveringen av den kalsiumfølende reseptoren

For mer info. ta kontakt med:tina.xiang@wecistanche.com

Vasopressin (AVP) øker vannpermeabiliteten inyresamlerør gjennom regulering av handel med aquaporin-2 (AQP2). Flere lidelser, inkludert hypertensjon og upassende antidiuretisk hormonsekresjon (SIADH), er assosiert med abnormiteter i vannhomeostase. Det har vist seg at visse fytoforbindelser er gunstige for menneskers helse. Her har effekten av Olive Leaf Extract (OLE) blitt evaluert ved bruk av in vitro og in vivo modeller. Konfokale studier viste at OLE forhindrer vasopressin-indusert AQP2-translokasjon til plasmamembranen i MCD4-celler og rotternyrer. Inkubasjon med OLE reduserer den AVP-avhengige økningen av den osmotiske vannpermeabilitetskoeffisienten (Pf). For å belyse mulige effektorer av OLE ble intracellulært kalsium evaluert.OLE øker det intracellulære kalsiumet gjennom aktivering av Calcium Sensing Receptor (CaSR).NPS2143 , en selektiv CaSR-hemmer, opphevet den hemmende effekten av OLE på AVP-avhengig vannpermeabilitet. In vivo-eksperimenter viste at behandling med OLE øker ekspresjonen av CaSR-mRNA og reduserer AQP2-mRNA parallelt med en økning av AQP2-målrettet miRNA-137. Sammen antyder disse funnene at OLE antagoniserer vasopressinvirkning gjennom stimulering av CaSR, noe som indikerer at dette ekstraktet kan være gunstig for å dempe lidelser preget av unormal CaSR-signalering og påvirke nyrevannreabsorpsjon.

Oliventreblader har blitt mye brukt som tradisjonelle midler for å kurere flere sykdommer, spesielt i middelhavslandene. Blader blir ofte konsumert i det menneskelige kostholdet som et ekstrakt eller pulver for å tilberede infusjoner eller urtete. Kjemisk karakteriseringsanalyse viste at oliventreblader inneholder flere bioaktive forbindelser som kan ha gunstige effekter ved visse sykeligheter som metabolsk syndrom, dyslipidemi og hypertensjon. Hos pasienter med essensiell hypertensjon reduserte OLE blodtrykket og noe redusert glykemi og kalsemi. Tallrike polyfenoler som oleuropein, hydroksytyrosol og tyrosol har blitt funnet beriket i et grønt olivenbladekstrakt (OLE)5, og de er kjent for å være involvert i forebygging av visse sykdommer preget av oksidativt stress. Derfor har interessen for å undersøke de potensielle fordelaktige effektene av olivenbladekstrakt øket blant forskere innen forskjellige forskningsfelt de siste årene. OIE viste en betydelig antiproliferativ effekt i maligne mesotheliomaceller ved å endre intracellulær kalsiumdynamikk, muligens målrettet mot T- type Ca2 pluss kanaler. Interessant nok ble OLE funnet å ha antihypertensive effekter på genetisk hypertensjon hos spontant hypertensive rotter (SHR), relatert til forbedring av vaskulær funksjon*. Overdreven vannreabsorpsjon spiller en viktig rolle i patogenesen av økt blodtrykk. Hos hypertensive pasienter, behandlet med olivenbladekstrakt, ble det funnet en signifikant reduksjon av flere inflammatoriske faktorer assosiert med en reduksjon i blodtrykket. Dessuten karakteriserer overdreven vannretensjon flere lidelser som levercirrhose, hjertesvikt og upassende antidiuretisk hormonsekresjon (SIADH). Kroppsvannhomeostase er tett kontrollert av det antidiuretiske hormonet vasopressin (AVP) som frigjøres under dehydrert tilstand. AVP binder sin beslektede V2R-reseptor lokalisert ved den basolaterale membranen tilnyrehovedceller og aktiverer derved cAMP-signalveien som resulterer i translokasjon av aquaporin-2(AQP2)-bærende vesikler fra en intracellulær pool til den apikale plasmamembranen der vannreabsorpsjon skjer. På et molekylært nivå kan flere faktorer modulere renal vannbalanse. Et forhøyet nivå av luminalt kalsium nedregulerte den kortsiktige vasopressinavhengige AOP2-trafikken gjennom aktivering av den kalsiumfølende reseptoren (CaSR)1,12. På den annen side induserte CaSR-aktivering i betinget udødeliggjorte renale proksimale tubulære epitelceller, isolert fra den menneskelige urinen, en signifikant økning i cytosolisk kalsium og reduserte signifikant økningen i cAMP fremkalt av forskolin (FK), en direkte aktivator av adenylat cvclase3. , i MCD4-celler i nyresamling, som stabilt uttrykker vannkanalen AOP2, svekket stimulering av CaSR den cAMP-avhengige økningen i AQP2-fosforylering ved serin 256 som er en sentral hendelse i signaltransduksjonskaskaden aktivert av vasopressin og som til slutt økte vannpermeabiliteten4 ,15 Videre, inyreskiver fra den indre medulla musenyre, aktivering av CaSR med det kalsimimetiske NPS-R568 forårsaket en betydelig økning i AQP2-målrettet miRNA-137, noe som bekrefter et tett samspill mellom CaSR-signalveien og AQP{ {4}}avhengig vannpermeabilitetl.17.I denne studien ble effekten av olivenbladekstraktet, hentet fra den lokale Coratina-kultivaren, evaluert på vasopressin-indusert AQP2-funksjon i MCD4-celler i nyresamlingskanalen som stabilt uttrykker AOP2 og i dDAVP behandlede rotter injisert med ekstraktet. Vi gir bevis for at OLE-behandling motvirker vasopressinrespons i nyreceller, noe som delvis kan forklare dens vanndrivende effekt. Interessant nok ser denne effekten ut til å være relatert til OLE-indusert aktivering av CaSR, en reseptor kjent for å ha et negativt samspill med vasopressinreseptoren12.

Lær mer om effekten av cistanche på nyrene

Resultater

Effekter av OLE på vasopressin-indusert AQP2-funksjon i MCD4-celler. For å undersøke mulig involvering av OLE på vasopressinavhengig AQP2-funksjon,nyresamlende MCD4-celler, som stabilt uttrykker vasopressinreseptoren 2(V2R) og human AQP2, ble brukt som en eksperimentell modell18. Konfokale studier (fig. 1A) avslørte at, sammenlignet med dDAVP-behandlede celler, der AQP2-farging lokalisert til den apikale plasmamembranen, forhindret behandling med OLE membranlokaliseringen av AOP2 indusert ved stimulering med dDAVP. I samsvar med disse observasjonene svekket OLE-behandling den dDAVP-induserte økningen av den temporale osmotiske responsen (angitt som 1/t i fig.1B)(OLE/dDAVP=88.70±1.86 prosent , n=292 celler vs dDAVP=206.8±5.49 prosent ,n=186 celler;p<0.001).altogether these="" findings="" suggested="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" principal="" cell="" permeability="" by="" preventing="" aqp2="" translocation="" from="" an="" intracellular="" vesicle="" pool="" to="" the="" apical="" plasma="" membrane.="" vasopressin-induced="" aop2="" trafficking="" is="" controlled="" by="" intracellular="" camp="" which="" stimulated="" the="" camp-dependent="" kinase="" (pka)1.="" further,="" to="" evaluate="" the="" functionality="" of="" the="" v2r="" in="" the="" presence="" of="" ole="" in="" terms="" of="" camp="" production,="" permeable="" 8-br-camp="" was="" used="" as="" an="" external="" source="" of="" camp.="" treatment="" with="" 8-br-camp="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" elicited="" by="" ole="" on="" osmotic="" water="" permeability(ole/8-br-camp="188.7±3.56%,n=293" cells="" vs="" ole="85.93±2.27%," n="238"><0.001).therefore, to="" evaluate="" whether="" treatment="" with="" ole="" regulates="" aqp2="" trafficking="" by="" fine-tuning="" intracellular="" camp="" level,="" fluorescence="" resonance="" energy="" transfer(fret)technology="" was="" applied.="" compared="" to="" untreated="" cells="" (ctr),="" normalized="" netfret="" signals="" are="" reduced="" with="" ddavp="" stimulation(ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.00l; fig.2a),consistent="" with="" a="" significant="" increase="" of="" intracellular="" camp.="" conversely,="" treatment="" with="" ole="" prevented="" the="" ddavp="" dependent="" decrease="" of="" netfront="" signals="" consistent="" with="" a="" decrease="" of="" the="" vasopressin="" dependent="" camp="" release="" (ole/ddavp="92.97±3.46%," n="211" cells="" vs="" ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells;=""><0.05; fig.2a).treatment="" with="" ole="" alone="" did="" not="" affect="" the="" intracellular="" cgmp="" level="" compared="" with="" cells="" left="" under="" basal="" conditions(ole="96.15±3.80%," n="184" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.05).besides, western="" blotting="" studies(fig.2b)revealed="" that="" treatment="" with="" ole="" significantly="" reduced="" the="" ddavp="" induced="" increase="" of="" aqp2="" phosphorylation="" at="" serine="" 256(aqp2-ps256),="" indicating="" that="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking,="" in="" response="" to="" ole,="" are="" dependent="" on="" camp-pka="" function.="" the="" phosphorylation="" level="" of="" aqp2-ps256="" in="" response="" to="" ole="" was="" not="" statistically="" different="" from="" the="" control="" even="" though="" it="" tended="" to="" be="" reduced.="" to="" gain="" insight="" into="" the="" molecular="" signals="" underlying="" the="" action="" of="" ole,="" intracellular="" calcium="" dynamics="" were="" evaluated.="" mcd4="" cells="" endogenously="" express="" a="" functional="" calcium-sensing-receptor(casr)20,="" which="" plays="" an="" important="" role="" in="" controlling="" aqp2="" expression="" and="" trafficking'4.long="" term="" incubation="" with="" ole(0.1="" mg/ml)slightly="" increased="" the="" intracellular="" calcium="" level="" compared="" with="" untreated="" cells(fig.3;="" ole="209.0±13.45" nm,n="128" cells="" ys="" ctr="163.3±8.957" nm,n="97cells:"><0.05).co-incubation with="" ole(0.1="" mg/ml)="" and="" the="" selective="" nps2143(1um)antagonist="" of="" the="" casr="" abolished="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" mobilization(ole/nps2143="168.8±11.43" nm,n="144" cells="" ys="" ole="209.0+13.45" nm.="" n="128"><0.05).to dissect="" further="" intracellular="" calcium="" signals="" in="" response="" to="" ole,="" functional="" experiments="" were="" also="" performed="" under="" acute="" stimulation="" with="" ole="" and="" nps2143.="" short-term="" treatment="" with="" ole="" (1="" mg/ml)="" evoked="" specific="" calcium="" oscillations(fig.4a)="" that="" were="" prevented="" when="" cells="" were="" pretreated="" with="" the="" selective="" casr="" inhibitor="" nps2143（10="" μm）.="" statistical="" analysis="" of="" the="" fluorescence="" responses（fig.="" 4b）revealed="" that="" incubation="" with="" ole="" increased="" cytosolic="" calcium="" by="" 97.06±6.93%(vs="" atp="" 100.00±2.28%).pretreatment="" with="" nps2143="" reduced="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" increase(ole/nps2143="18.87±2.17%,n=59" cells="" vs="" ole="97.06±6.93%," n="50" cell;=""><0.001).to deeper="" investigate="" whether="" the="" effect="" of="" ole="" on="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" occurred="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling,="" functional="" studies="" were="" performed="" as="" previously="" shown="" (fig.1b).="" interestingly,="" treatment="" with="" nps2143="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ole="" on="" avp-regulated="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.5;="" ole/ddavp/nps2143="190.4±7.15%," n="191 cells" vs="" ole/ddavp="88.70±1.86%,n=292"><0.001), suggesting="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" the="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling.="" compared="" to="" untreated="" cells,="" treatment="" with="" only="" nps2143="" did="" not="" affect="" the="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.="">

<0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" alt="Figure 2. Efects of OLE on AQP2 phosphorylation and cAMP production in MCD4 cells. (A) Evaluation of cAMP production by FRET experiments in MCD4 cells transiently transfected with H96 as described in the " materials="" and="" methods"="" section.="" histogram="" reports="" netfret="" measured="" in="" cells="" under="" basal="" conditions,="" treated="" with="" ddavp="" (100 nm="" for="" 30 min),="" ole="" (0.1 mg/ml="" o/n),="" or="" co-treated="" with="" ole="" and="" ddavp.="" te="" treatment="" with="" ddavp="" displayed="" a="" signifcantly="" higher="" camp="" production="" depicted="" as="" a="" reduced="" netfret="" signal.="" data="" are="" shown="" as="" single="" values="" in="" a="" scatter="" plot="" reporting="" means±s.e.m=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

Effekter av OLE i nyrene til rotter injisert med OLE.

For ytterligere å undersøke virkningene til OLE, er det utført in vivo-studier. Spesielt har rotter blitt injisert med OLE (250 mg/kg/dag) en gang daglig i tre dager. Alternativt ble rotter samtidig behandlet med OLE i 3 dager og dDAVP i 3 0 min. Evaluering av CaSR-mRNA som ble isolert fra nyresamlingskanalen til rotter og behandlet for sanntids-PCR (fig.6) avslørte en signifikant økning i CaSR-mRNA i OLE(OLE=1.87±0.29, n{{ 10}} rotter vs CTR=1.02±0.17, n=5 rotter; p<0.05) and="" ole/ddavp(ole/ddavp="2.77±0.25," n="5" rats="" vs="" ctr="1.02±0.17,n=5" rats="" and="" ddavp="1.08±0.11," n="5" rats;=""><0.001)injected rats="" compared="" with="" control="" and="" ddavp="" animals,="" casr="" signaling="" can="" regulate="" the="" expression="" level="" of="" selective="" mirnas,="" which="" downregulated="" the="" expression="" level="" of="" aqp216.based="" on="" these="" findings,="" and="" considering="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" aqp2="" function,="" the="" level="" of="" mir-137,="" a="" known="" aqp2-targeting="" mir="" in="" the="" renal="" collecting="" duct,="" was="" evaluated.="" compared="" to="" control="" rats="" (fig.7),="" the="" level="" of="" mir-137="" in="" the="" renal="" collecting="" ducts="" of="" ole(ole="4.18.10-8±1.07.10-8ng,n=5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.05)and ole/ddavp="" rats="" was="" increased="" indicating="" that="" treatment="" with="" ole="" upregulates="" the="" casr="" signaling="" and="" the="" expression="" level="" of="" the="" mir-137(ole/ddavp="4.38.10-8±47.01·10-9ng," n="5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.01 and="" vs="" ddavp="2.1610-8±3.52.10-°ng," n="5"><0.05). to="" verify="" whether="" the="" increase="" of="" mir-137="" affected="" the="" expression="" level="" of="" aqp2,="" renal="" samples="" were="" processed="" for="" real-time="" pcr.="" data(fig.8a)revealed="" that="" the="" expression="" levels="" of="" aqp2="" mrna="" were="" lower="" in="" ole(ole="0.36±0.06,n=5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5"><0.01)and ole/ddavp(ole/ddavp="0.65±0.12," n="5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5" rats="" and="" ddavp="1.03±0.16,n=5" rats;=""><0.05)renal samples="" compared="" with="" specimens="" obtained="" from="" control="" animals.="" besides,="" western="" blotting="" analysis(fig.="" 8b)showed="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" the="" abundance="" of="" aop2="" regardless="" of="" ddavp="" stimulation(ole/ddavp="0.62±0.13,n=5" rats="" vs="" ddavp="1.04±0.16,n=5"><0.05)indicating that="" the="" ole-induced="" reduction="" of="" aqp2="" mrna="" expression="" level="" coincided="" with="" a="" decrease="" of="" aqp2="" protein="" content.="" to="" evaluate="" the="" effect="" of="" ole="" on="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking="" in="">nyre, Western blotting-analyse og konfokale studier ble utført (fig. 9). Hos OLE/dDAVP-injiserte rotter ble fosforylering av AQP2 ved serin 256 signifikant redusert sammenlignet med nyrevev fra dDAVP-behandlede dyr (OLE/dDAVP=0. 77±0.16, n=5 rotter vs dDAVP=2.16±0.25,n=5 rotter; p<0.001,fig.9a),thereby confirming="" the="" in="" vitro="" findings(fig.2b).="" besides,="" confocal="" studies="" (fig.9b)="" of="" kidney="" sections="" revealed="" that="" exposure="" to="" ole="" prevented="" the="" aop2="" mem-brane="" localization="" that="" instead="" was="" observed="" in="" ddavp="" treated="">

Diskusjon

Kalsium er en viktig intracellulær budbringer som modulerer en mengde cellulære funksjoner2. Unormal kalsiumsignalering kan føre til flere sykdommer, inkludert hjertesvikt, kreft og hypertensjon23. Spesifikk kontroll av uttrykket og aktiviteten til proteiner som kontrollerer flere intracellulære kalsiumsignaler har vist seg vellykket for å møte en rekke lidelser og er derfor attraktiv for medikamentutvikling. Denne studien gir ny innsikt i virkningsmekanismen til OLE ved å vise dens evne til å modulere intracellulær kalsiumsignalering gjennom stimulering av CaSR som er involvert i finjustering av vasopressin-indusert AQP2-trafikk og uttrykk. Under fysiologiske forhold spiller AQP2 en viktig rolle i å kontrollere kroppsvannhomeostase25. Stimulering av det intracellulære maskineriet, som fører til lokalisering av AQP2 ved den apikale plasmamembranen, resulterer i unormal vannretensjon og påfølgende hyponatremi som i syndromet med upassende antidiuretisk hormon (SIADH)-sekresjon, levercirrhose og kongestiv hjertesvikt-.I en mus modell av SIADH, assosiert med polycystisk nyresykdom 1 haploinsuffisiens, ble det basale intracellulære kalsiumnivået betydelig redusert sammenlignet med nivået målt i samlekanalene til villtypemus. Lavt intracellulært kalsium nedregulerte aktiviteten til visse enzymer inkludert proteinfosfatase PP2A, noe som resulterte i oppregulering av AOP2-fosforylering ved serin 2561. Derimot. aktivering av CaSR med det kalsimimetiske NPS-R568 økte den intracellulære kalsiumkonsentrasjonen og reduserte cAMP-nivået i PKD1-mangelfulle celler. Det er viktig at cytosolisk kalsium kan nedregulere den kalsium-inhiberbare adenylerte cyclase3 og dermed finjustere det intracellulære nivået av cAMP. I MCD4-celler reduserte faktisk stimulering av CaSR med NPS-R568 AQP2-pS256 gjennom hemming av adenylatet cyclase4. I denne studien forhindret behandling med OLE den vasopressinavhengige økningen av cAMP og AOP2-pS256, muligens sekundært til en økning i den intracellulære kalsiumkonsentrasjonen. Det er verdt å merke seg at eksponering for en ekstern cAMP-kilde ved bruk av permeabel 8-Br-cAMP motvirket den hemmende effekten av OLE på V2R-banen betydelig.

Et forhøyet nivå av cytosolisk kalsium kan føre til celledød og apoptose. Imidlertid fremmet en vedvarende økning i intracellulært kalsium fra 250 nM til mer enn 600 nM nevronal overlevelse4. I MCD4-celler vises ikke behandling med OLE ved 0,1 mg/ml en cytotoksisk effekt. Ved denne konsentrasjonen økte OLE (0,1 mg/ml) det intracellulære kalsiumnivået noe. Kalsiumavbildning avslørte at akutt stimulering med OLE forårsaket en forbigående økning av intracellulært kalsium gjennom aktivering av CaSR som oppheves når cellene ble preinkubert med den selektive CaSR-antagonisten NPS2143, i nyreproksimale tubuliceller, allosterisk aktivering av CaSR med I-ornitin reduserte ROS-produksjonen og nedregulerte dermed mitokondrielt oksidativt stress som forårsaket celleapoptose356. Dessuten viste vår tidligere studie at uttrykket av gain-of-function varianter av CaSR reduserte ROS-frigjøring og S-glutationylering av AQP237. Inkubasjon med OLE reduserte ROS-generasjonen i MCD4-celler35, noe som viste dens antioksidantevne. Likevel er det for øyeblikket uklart om OLE påvirker AOP2-S-glutationylering. Tallrike studier avslørte at OLE eller oleuropein, som er hovedbestanddelen av OLE, kan ha beskyttende roller ved å hemme celledød,39 Imidlertid er doseavhengige effekter beskrevet hos rotter som får OLE. Fordelaktige responser ble oppnådd ved doser på 250 og 500 mg/kg. Derimot, ved høyere konsentrasjoner, kan behandling med OLE ha skadelige effekter, muligens på grunn av pro-oksidantvirkningene til flere fytoforbindelser. I denne studien ble rotter injisert med OLE i en dose på 250 mg/kg i tre dager og viste oppregulering av CaSR. Ekspresjonsnivået til CaSR økes av visse forbindelser som fungerer som allosteriske aktivatorer av reseptoren. Kalsimimetika reduserte faktisk de vaskulære forkalkningene ved å øke biosyntesen av CaSR i menneskelige vaskulære glatte muskelceller0. I denne konkurransen kan det ikke utelukkes muligheten for at visse forbindelser i OLE kan fungere som allosteriske modulatorer av CaSR. På en annen side kan stimulering med vasopressin føre til IL-6-frigjøring som kan bidra til å øke ekspresjonsnivået til CaSR42.

I nyrene er stimulering av CaSR-signalering assosiert med en nedregulering av AQP2-uttrykk, muligens gjennom miR-137-generasjonen. miRNA er sentrale posttranskripsjonelle modulatorer. Flere vasopressinavhengige miRNA-er rettet mot AQP2-uttrykk er også beskrevet43. Transfeksjon med miR-32 og miR-137 reduserte ekspresjonsnivået til AOP2 signifikant i mpkCCDc14-celler. Interessant nok kan OLE dempe inflammatoriske signaler og utøve beskyttende effekter ved å modulere ekspresjonsnivået til flere miRNA". Spesielt i glioblastoma multiforme-celler fremmet OLE uttrykket av forskjellige miRNA inkludert miR-13745 som er involvert i nedreguleringen av Akt/mTOR-signalveien 46. Bemerkelsesverdig forhindrer behandling med oleuropein Akt/mTOR-signalering gjennom aktivering av kalsiumindusert CAMK og AMPK. Aktivering av CaSR med NPS-R568 aktiverer AMPK og reduserer mTOR-aktivitet i humane proksimale tubulære celler3. I samsvar med disse funnene øker inkubasjon med OLE cytosolisk kalsium, nedregulerer PKA-aktivitet og reduserer cystestørrelsen i en 3D-cellekulturmodell48. Sammen antyder disse funnene at OLE kan være nyttig i behandling av lidelser preget av dysregulering av intracellulær kalsiumdynamikk relatert til nedregulering av CaSR-signalering.

Olivenbladekstrakt består av flere bioaktive komponenter, inkludert polyfenoler, fibre og mineraler49. For øyeblikket er det ikke klart om en forbindelse eller en synergisk kombinasjon av fytoforbindelser i OLE kan være fordelaktig for å modulere intracellulære responser. Ekstraktet brukt i denne studien har blitt brukt som et mulig mattilsetningsstoff, og det er derfor viktig å definere den fysiologiske virkningen av selve ekstraktet med tanke på at flere fenoler, inkludert hydroksytyrosol, kan filtreres av nyrene og gjenvinnes i urinen50. Ytterligere studier vil gi effekten av spesifikke komponenter som aktivt kan regulere intracellulær kalsiumsignalering gjennom CaSR. For å konkludere, gir denne studien bevis på at OLE kan betraktes som en ny potensiell adjuvans som er nyttig for å dempe lidelser preget av en reduksjon av CaSR-ekspresjon, samt signalisere og påvirke renal vannpermeabilitet.

Materialer og metoder

Kjemikalier og antistoffer.Alle kjemikalier og antibiotika ble kjøpt fra Merck (Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland). Calcein-AM, Fura-2-AM, cellekulturmedier, føtalt bovint serum (FBS) og Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrates ble kjøpt fra Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Aquaporin{ {2}}(AQP2) ble påvist ved bruk av spesifikke antistoffer (C-tail Ab) reist mot et syntetisk peptid som tilsvarer de siste 15 C-terminale aminosyrene til human AQP2!. AQP2-pS256-antistoffer ble gitt av prof Peter Deen. Sekundære geit-anti-kanin pepperrot peroksidase-koblede antistoffer ble oppnådd fra Merck (Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland). Et sekundært geit-anti-kanin-antistoff koblet til Alexa-488 ble kjøpt fra Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

Fenolrik ekstraktproduksjon og kjemisk karakterisering.Produksjonen av et fenolrikt ekstrakt fra olivenblader ble utført som rapportert i Ranieri et al.35. Etter fresing med en blender (Waring-Commercial, Torrington, CT, USA), ble ddH2O vann tilsatt (forhold 1/20, w/y) og deretter utsatt for ultralyd (CEIA, Viciomaggio, Italia) tre ganger , i 30 minutter ved 35±5 grader hver gang. Til slutt ble ekstraktene filtrert gjennom filterpapir, lyofilisert og lagret ved -20 grader C. De oppnådde ekstraktene ble filtrert med nylonfiltre på 0,45 μm (Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland) og brukt til kjemisk karakterisering. Det totale fenolinnholdet, antioksidantaktiviteten og identifiseringen av enkeltfenolforbindelser ble utført i henhold til Difonzo et al.. OLE viste et innhold av polyfenoler, bestemt av Folin-Ciocalteu, lik 195 mg. gallussyreekvivalenter (GAE) og en antioksidantaktivitet, bestemt av ABTS (2,2'-azino-bis(3-etylbenzotiazolin-6-sulfonsyrediammoniumsalt), som utgjør 750 μmol TE (Trolox-ekvivalenter) .

Cellekultur og behandlinger.Musekortikale samlekanal MCD4-celler, som stabilt uttrykker human AQP2 og den kimære V2R-Rluc ble brukt som en eksperimentell modell18. Celler ble dyrket i en 1:1 blanding av Dalbec-cos modifisert Eagle's medium og F-12 supplert med 5 prosent (år/år) føtalt bovint serum. 1 prosent (år/år)L-glutamin og 1 prosent penicillin/streptomycin,5 μM deksametason,400 ug/ml G418 (for AQP2-resistens) og 1 ug/ml puromycin (for V2R-Rluc-resistens) , i en fuktet atmosfære på 5 prosent CO, ved 37 grader. MCD4-celler ble etterlatt under basal tilstand (CTR) eller langtidsbehandlet med OLE ved 0,1 mg/ml O/N, dDAVP ved 100 nM i 30 minutter, eller samtidig behandlet med OLE og dDAVP eller NPS2143 ved 1 μM O/N .Alternativt ble celler eksponert for 8-Br-cAMP ved 500 μM i 45 minutter, korttidseksperimenter ble utført med OLE ved 1 mg/ml i 5 minutter og NPS2143 ved 10 μM i 15 minutter. Eksperimenter ble utført 3-5 uavhengige ganger ved bruk av celler fra forskjellige passasjer.

Dyremodell og behandlinger.Alle prosedyrer ble utført i samsvar med de danske nasjonale retningslinjer for stell og håndtering av forsøksdyr og de publiserte retningslinjene fra National Institutes of Health. Protokollene ble godkjent av Institutt for klinisk medisin. Aarhus Universitet, i henhold til lisensene for bruk av forsøksdyr utstedt av det danske justisdepartementet (godkjenningsnummer 2015-15-0201-00658). Studier ble utført på voksne Wistar-hannrotter med en startvekt på 200-225 g. Dyrene ble holdt på en standard gnagerdiett (Altromin, Lage, Tyskland) og hadde fri tilgang til vann fra springen. Under eksperimentene ble rottene plassert i grupper på to per bur, med en lys-mørke-syklus på 12:12 timer, en temperatur på 21±2 grader C og en fuktighet på 55±2 prosent. Fem rotter ble behandlet med subkutan injeksjon av 1 ng dDAVP (Sigma-Aldrich, Glostrup, Danmark) i 200 ul saltvann/dyr, og fem bærerbehandlede rotter tjente som kontroller. Etter 30 minutter ble rottene drept, og nyrene ble behandlet som beskrevet nedenfor.

Celler og IMCD-lysater.Celler ble dyrket på {{0}}mm skåler og resuspendert i en buffer som inneholdt 220 mM mannitol, 70 mM sukrose, {{10}}. 5 M EGTA pH 8,0,0,5 M EDTA pH 8,0,1 M Tris-HCl pH 7,4 i nærvær av proteaser (1 mM PMSF, 2 mg/ml leupeptin og 2 mg/ml pepstatin A) og fosfataser (10 mM NaF og 1 mM natriumorthovanadat)-hemmere. Alternative nyreseksjoner på ca. 0,5 mm ble preparert og ekvilibrert i 10 minutter i en buffer inneholdende 1,8 mM NaCl, 16 mM Hepes, 17 mM Na-Hepes, 14 mM glukose, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,8 mM MgSO4, og 1,8 mM KH2PO4 (pH 7,4). Nyrepapillen ble hakket med saks i den samme bufferen i nærvær av proteaser (1 mM PMSF, 2 mg/mlleupeptin og 2 mg/mlpepstatin A) og fosfataser (10 mM NaF og 1 mM natrium orthovanadat)-hemmere. Etter sonikering (60 kHz i 5 s) ble lysater sentrifugert ved 12,000×g i 10 min. Supernatantene ble samlet og brukt til immunoblotting-studier'8.

Konfokal mikroskopi.Konfokale studier ble utført som tidligere beskrevet1. Kort fortalt ble celler dyrket på cellekultur-PET-innlegg og behandlet som beskrevet ovenfor. Alternativt ble nyreseksjoner oppnådd fra kontroll, OLE, dDAVP og OLE med dDAVP-behandlede rotter utsatt for immunfluorescenseksperimenter som tidligere beskrevet. Bilder ble tatt med et konfokalt laserskannende fluorescensmikroskop Leica TCS SP2 (Leica Microsystems, Heerbrugg, Sveits). Gelelektroforese og immunblotting. Proteiner ble separert på 12 prosent flekkfrie polyakrylamidgeler (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) under reduserende forhold som tidligere beskrevet =5,52. Kort fortalt ble proteinbånd overført til Immobilon-P-membraner (Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland) og immunoblottet ved bruk av anti-AQP2 (Pre-C-tail Ab) og anti-AQP2-pS256-antistoffer. Immunoreaktive signaler ble oppnådd ved bruk av Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrates med Chemidoc System (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Bånd ble normalisert til totalt protein ved bruk av flekkfri teknologi (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Densitometrianalyse ble utført ved bruk av ImageLab (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) og analysert ved bruk av GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Vannpermeabilitetsanalyse.Osmotisk vannpermeabilitet ble målt som tidligere beskrevet43. Kort fortalt ble MCD4-celler dyrket på 40-mm dekkglass. Etter behandlinger ble cellene lastet med 10 μM membranpermeabelt Calcein-AM i 45 minutter ved 37 grader ,5 prosent CO, i DMEM/F-12. Dekkglass ble montert i et perfusjonskammer (FCS2 Closed Chamber System, BIOPTECHS, Butler, USA). Målinger ble utført ved bruk av et invertert TE2000-S-mikroskop (Nikon Eclipse-mikroskop, Tokyo, Japan) utstyrt for enkeltcellefluorescensmålinger og bildeanalyse. De Calcein-AM-lastede prøvene ble eksitert ved 490 nm. Fluorescensmålinger, etter isosmotiske (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl.. 1 mM CaCl., 10 mM Hepes-sulfonsyre, 5 mM glukose, pH 7,4) eller hyperosmotisk (isomotisk løsning tilsatt 135 mM Mannitol) løsninger . ble utført ved bruk av Metafluor-programvare (Molecular Devices, MDS Analytical Technologies, Toronto, Canada). Tidsforløpsfluorescensdata etter perfusjon av celler med iso- og hyperosmotiske løsninger ble registrert. Tidsforløpet for cellekrymping ble målt som tidskonstanten (Ki, uttrykt som 1/r, sek), en parameter korrelert til vannpermeabiliteten, oppnådd ved å tilpasse data med en eksponentiell funksjon analysert ved bruk av GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego , CA, USA).

Fluorescensresonansenergioverføringsmålinger.For å evaluere intracellulære cAMP-endringer ble teknologi for fluorescensresonansenergioverføring (FRET) brukt. For FRET-eksperimenter ble celler transfektert med et plasmid som koder for H96-sensoren som inneholder det cAMP-bindende konsensusmotivet til EPAC1 innebygd mellom det cyanfluorescerende proteinet (CFP) og cp173Venus-Venus som tidligere vist 32.33.54. Plasmidet som koder for H96-proben var en gave fra Dr.K. Jalink. Visualisering av ECFP- og/eller EYFP-uttrykkende celler og påvisning av FRET ble utført ved hjelp av et invertert TE2000-S-mikroskop (Nikon Eclipse-mikroskop, Tokyo, Japan). Hvert bilde ble korrigert og analysert som tidligere vist55.

Intracellulære kalsiummålinger. Intracellulære kalsiummålinger ble utført som tidligere vist56. Kort fortalt ble MCD4-celler lastet med 4 μM Fura-2 AM i 15 minutter ved 37 grader i DMEM/F-12. Ringers løsning ble brukt til å perfuse celler under eksperimentet inneholdende 140 mM NaCl, 5 mM KCl 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM glukose, 1,8 mM CaCl, pH 7,4. Ved fluorescensmålinger ble dekkglassene med overbelastede celler montert i et perfusjonskammer (FCS2 Closed Chamber System. BIOPTECHS. Butler, USA). Målinger ble utført med et invertert TE2000-S-mikroskop (Nikon Eclipse-mikroskop, Tokyo. Japan). Forholdet mellom fluorescensintensiteter ved 340 og 380 nm ble plottet og beregnet som endringen i fluorescens. Spesielt ble stimulering med OLE（1 mg/ml） eller NPS2143 （10 μM） sammenlignet i samme celletype med de som ble oppnådd etter stimulering med en maksimal dose av den kalsiummedierte agonisten ATP（100 μM） som ble brukt som en internkontroll (100 prosent ).

Intracellulært kalsiumnivå ble målt ved steady-state og kalibrert som beskrevet av Grynkiewicz57. OLE og NPS2143 ble brukt på lang sikt ved henholdsvis 0,1 mg/ml og l uM, og hver prøve ble kalibrert ved tilsetning av 5 μM ionomycin i nærvær av 1 mM EGTA (Rm.) etterfulgt av 5 μM ionomycin i 5 mM CaCl, (RMA).

Sanntids PCR-analyse av AQP2 og CaSR mRNA i kontrollrotter og behandlede rotter.Sanntids PCR-eksperimenter ble utført for å måle det relative uttrykket av mRNA i den indre medulla-samlingskanalen (IMCD) isolert fra kontroll og behandlede rottenyrepapiller. Nyreskiver på ca. 0,5 mm ble laget og ekvilibrert i 10 minutter i en buffer inneholdende 118 mM NaCl, 16 mM HEPES, 17 mM Na-Hepes, 14 mM glukose, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,8 mM MgS04 og 1,8 mM KH2P04 (pH 7,4). Nyrepapillen ble isolert under et stereomikroskop. Prøver fra kontrollrotter og behandlede rotter ble deretter hakket med en saks direkte i Trizol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Omvendt transkripsjon ble utført på 2,5 ug totalt RNA ved bruk av SuperScriptVilo Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), i samsvar med produsentens forslag (25C i 10 min; 42C i 60 min; 85C i 5 min). Sanntids PCR-amplifikasjon ble utført ved å bruke TagMan Fast Advanced Master Mix med CaSR-, AOP2- og GAPDH-analyser (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) i StepOne Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA ), innstilling av de termiske syklusforholdene som spesifisert av produsenten (95 grader C i 20 s; 40 sykluser alternativt ved 95·C i 1 s og 60 grader C i 20 s). Resultatene ble uttrykt som 2- verdier (relativ kvantifisering) med △ACt=(Ct target-Ct GAPDH) behandlet-(Ct target-Ct GAPDH)Sham1.

miRNA-137-evaluering i kontrollrotter og behandlede rotter.miRNA{{0}}-innhold i kontroll- og behandlet rotte-medulla-samlingskanal ble evaluert ved hjelp av TagMan Advanced miRNA-analyser (has-miR-137; Assay ID;477904 mir; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA .US.A), som muliggjorde svært sensitiv og spesifikk varsling av modent miRNA ved bruk av kvantitativ PCR. Nyreskiver på ca. 0,5 mm ble laget og ekvilibrert i 10 minutter i en buffer inneholdende 118 mM NaCl, 16 mM HEPES, 17 mM Na-Hepes, 14 mM glukose, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,8 mM MgSO4 og 1.8 mM MgSO4 og 1. KH2PO4(pH7,4). Nyrepapillen ble isolert under et stereomikroskop. Prøver fra kontrollrotter og behandlede rotter ble deretter hakket med en saks direkte i Trizol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) for å trekke ut totalt RNA. TaqMan Advanced miRNA cDNA-syntesesett （Katalog n²∶A25576; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ble brukt til å oppnå cDNA-syntese, i henhold til protokollen levert av produsenten (Poly(A)-halereaksjon; ligeringsreaksjon; omvendt transkripsjonsreaksjon; miR-Amp-reaksjon). Det syntetiske RNA(UUAUUGCUUAAGAAUACGCGUAG) med 59-fosfor ble syntetisert av Thermo Fisher Scientific og brukt til å utføre en kalibreringskurve for å interpolere miRNA-prøveverdier og for å oppnå en nøyaktig evaluering (i nanogram) av miR-137-innhold i samples16, ved å bruke GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Statistisk analyse.Alle verdier er rapportert som gjennomsnitt±SEM Statistisk analyse ble utført ved enveis ANOVA etterfulgt av Newman-Keuls multiple sammenligningstest med *p<0.05 considered="" statistically="" different="">

Uttalelser, etisk godkjenning og samtykke til å delta.Dyrestudier ble utført i samsvar med de danske nasjonale retningslinjer for stell og håndtering av forsøksdyr og de publiserte retningslinjene fra National Institutes of Health. Den etiske komiteen for dyrepleie ved Institutt for klinisk medisin, Aarhus Universitet godkjente studieprotokollene, i henhold til lisensene for bruk av forsøksdyr utstedt av det danske justisdepartementet (godkjenningsnummer 2015-15-0201-00658). Forfatterne bekrefter at alle metoder ble utført i henhold til relevante retningslinjer og forskrifter. Dessuten bekrefter forfatterne at studien ble utført i samsvar med ARRIVE-retningslinjene.

Referanser

1. El, SN & Karakaya, S. Oliventre (Olea europaea) etterlater potensielle gunstige effekter på menneskers helse. Nutr. Åp. 67, 632–638.

2. Javadi, H., Yaghoobzadeh, H., Esfahani, Z., Reza Memarzadeh, M. & Mehdi Mirhashemi, S. Effekter av olivenbladekstrakt på metabolsk respons, lever- og nyrefunksjoner og inflammatoriske biomarkører hos hypertensive pasienter. PJBS 22, 342–348.

3. Saibandith, B., Spencer, JPE, Rowland, IR & Commane, DM Olivenpolyfenoler og det metabolske syndromet. Molekyler

4. Cherif, S. et al. En klinisk utprøving av et titrert Olea-ekstrakt i behandling av essensiell arteriell hypertensjon. J. Pharm. Belg. 51, 69-71 (1996).

5. Difonzo, GRA et al. Grønne ekstrakter fra cortina oliven cultivar blader antioksidant karakterisering og biologisk aktivitet. J. Funksjon. Matvarer 31, 8.

6. Herrero, M. et al. Nye muligheter for valorisering av olivenoljebiprodukter. J. Chromatogr. 1218, 7511–7520.

7. Marchetti, C. et al. Oleuropein-anriket olivenbladekstrakt påvirker kalsiumdynamikken og svekker levedyktigheten til maligne mesotheliomaceller. eCAM 2015, 908493.

8. Romero, M. et al. Antihypertensive effekter av oleuropein-anriket olivenbladekstrakt hos spontant hypertensive rotter. Matfunksjon 7, 584–593.

9. Hall, JE Renal dysfunksjon, snarere enn nonrenal vaskulær dysfunksjon. Formidler saltindusert hypertensjon. Opplag 133, 894–906.

10. Wilson, JL, Miranda, CA & Knepper, MA Vasopressin og reguleringen av aquaporin-2. Clin. Exp. Nephrol. 17, 751–764.