Olivenblader (Olea Europaea L) ekstrakt ladede lipid nanopartikler: Optimalisering av prosesseringsparametre ved Box-Behnken Statistisk design, in vitro karakterisering og evaluering av antioksidant og antimikrobiell aktivitet Del 2
Jun 10, 2022
Vær så snill og kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mer informasjon
2.5.6 Stabilitetsevaluering
Stabiliteten til optimalisert formulering (F9) ble undersøkt i henhold til retningslinjer fra International Council for Harmonization (ICH). SLN-dispersjon ble tatt i tre separate glassampuller (10 ml i hver). Blant de tre hetteglassene ble det ene lagret i kjøleskap (4 grader ±2 grader), det andre ved romtemperatur (25±2 grader /60±5 RF prosent RF), og det siste ble lagret i et stabilitetskammer (Thermo). Scientific, Sverige) ved 40±2 grader /75±5 grader prosent RF. På et spesifikt tidspunkt, nemlig 1,3,6 måneder, ble prøvene tatt ut og undersøkt for visse parametere som partikkelstørrelse, innfangningseffektivitet, zetapotensial og PDI, etc, som ble bestemt og sammenlignet statistisk med nulltidsdata (initial) . 2.5.7 Antioksidantaktivitet
En av de mest nyttige metodene for påvisning av antioksidantpotensial er 2,2-Diphenyl-1-Picryl-Hydrazyl-Hydrate frie radikaler(DPPH)-metoden2. Radikalfjernende aktivitet (dvs. å analysere deres evne til å fjerne DPPH-frie radikaler) av OLP-SLN ble evaluert spektrofotometrisk ved 517 nm. Antioksidantaktiviteten til OLP, så vel som OPL-SLN-er, ble bestemt ved hjelp av (DPPH)-metoden. Oppløsning av DPPH ble fremstilt ({{10}},1 mM) i etanol. OLP-SLN-er (tilsvarer 0,2 mg/ml OLP) ble dispergert i fosfatbuffer og lot stå i 24 timer for å frigjøre stoffet. En ekvivalent konsentrasjon av OLP(0.2 mg/mL) og blanke SLN-er ble også fremstilt i samme medium. I denne studien ble askorbinsyre med konsentrasjon 0,2 mg/ml tatt som standard og mens DPPH-løsning ble brukt som kontroll.cistanche Australia3300 μL DPPH ble blandet i hver løsning av OLP-SLN (500 μL), blanke SLN-er og OLP-løsning (500 μL). Hver reaksjonsblanding ble holdt i et ristevannbad ved 37±0,5 grader i 30 minutter under beskyttede forhold fra lys. Til slutt ble absorbansen til hver prøve bestemt med et UV-synlig spektrofotometer (Shimadzu 1800, Japan) ved 517 nm ved bruk av etanol ble brukt som en blindprøve. Hvert eksperiment ble evaluert tre ganger og verdiene presenteres som gjennomsnitt ± SD. Verdien av antioksidantaktivitet i form av prosent DPPH-rensende aktivitet ble bestemt av følgende formel (ligning 2):
2.5.8 Antimikrobiell studie
Den antimikrobielle studien av OLP-lastede SLN-er (optimalisert batch F9) ble utført ved å bruke agarbrønndiffusjonsmetoden. Bakteriestammer som Staphylococcus aureus (Gram-positiv) og Pseudomonas aeruginoza (Gram-negativ) ble brukt til evalueringen ". Næringsagarplater ble preparert under sterile forhold og bakteriesuspensjon (100 μL, konsentrasjon rundt 10 grader FU/ ml） av hver bakterie ble plassert individuelt på hver sterile næringsagarplate ved hjelp av sterile vattpinner inkubert ved 37±0,5 grader i 1 time.cistanche fordelerFire brønner rundt 8 mm diameter hver ble produsert på hver plate ved hjelp av en steril korkborer. Her ble tomme SLN-er, positiv kontroll (rent ekstrakt), fysisk blanding (OLP-ekstrakt pluss blank) og SLN-er og optimalisert OLP-SLN-preparat (100 μL) brukt til den antimikrobielle studien og plassert i hver brønn . Platene ble inkubert ved en temperatur på 37±0,5 grader. Ved forhåndsbestemte tidspunkter (6,12,24 timer) ble platene trukket tilbake og hemmingssonene rundt veggene ble målt i mm ved hjelp av en skyvelære.
3. Resultater og diskusjon
3.1 Foreløpig screening og pre-optimalisering av form-latente variabler
The highest solubility of OLP was found to be in compri-to 888 ATO as depicted in Fig.1. The descending order of OLP solubility/100 gm in different lipid was compritol 188 ATO(36.93±4.92mg)>Precirol ATO 5(29.37±3.01 mg)>GMS(23.84±2.73mg)>palmitic acid(21.41±2.81 mg)>stearinsyre (16,25±1,65 mg). Compritol 888 ATO hadde blitt brukt som et lipid for fremstilling av oral-baserte SLN for preparatet SLN.
Basert på resultatene fra den foreløpige screeningsstudien ble tween 80 og compritol 888 ATO valgt som henholdsvis overflateaktivt middel og lipid. Andre parametere som forholdet mellom legemiddel og lipid (1:3-1:6), konsentrasjon av overflateaktivt middel (prosent ,1.5-4.5 prosent ) og homogeniseringshastighet (rpm, 3000-6000 rpm), homogeniseringstid (2 timer), sonikeringstid (10 minutter) ble bestemt ved å utføre de foreløpige eksperimentene. Faktorer som et medikament til lipid-forhold (A), konsentrasjon av overflateaktivt middel (B) og homogenisering (C) ble igjen optimalisert ved å bruke responsoverflatemetodikk (RSM) i forbindelse med 3-faktorer og 3-nivåer BBD , og deres innflytelse ble oppdaget på avhengige faktorer, nemlig partikkelstørrelse (Y1), innfangningseffektivitet (Y2) og PDI(Y3).
3.2 Utarbeidelse av SLN-er og optimalisering av OLP-lastet SLNS
Verdiene til forhåndsoptimaliserte parametere som beskrevet
ovenfor ble tilpasset BBD av ekspertdesign. Sammensetningen av totalt sytten formuleringer ble utforsket av BBD med 5 midtpunkter. Alle formuleringer ble utviklet og verdier for avhengige parametere som partikkelstørrelse, innfangningseffektivitet og PDI ble undersøkt og tilpasset videre til BBD for å få det endelige resultatet. Polynomligninger og 3D-grafer ble generert som viser påvirkningen av uavhengige faktorer på avhengige faktorer. Det positive tegnet til polynomligningen utforsket en positiv effekt og det negative tegnet indikerte en negativ effekt på avhengige variabler. Verdien av faktiske og predikerte avhengige variabler regresjonsanalyse og analyse av variansdata for modeller er presentert i henholdsvis tabell 1, 2 og 3. Den kvadratiske modellen ble ansett som den best tilpassede modellen for alle svarene, da den høyeste verdien av regresjonskoeffisienten ble observert i dette tilfellet.
3.3 Effekt av visse parametere på partikkelstørrelse(Y1)
Følgende polynomligning ble hentet fra BBD som indikerer effekten av forskjellige uavhengige faktorer på partikkelstørrelse (Y1):
Den ovenfor gitte ligningen viste at compritol 888 ATO viste en positiv effekt på partikkelstørrelsen mens tween 80 og homogenisering viste en negativ innvirkning på partikkelstørrelsen.
Her hadde variablene A, B, C, AB, BC og B" en signifikant effekt på partikkelstørrelsen.cistanche kolesterolAt a 95% confidence interval, the lack of fit was insignificant(p>0.05) mens de resterende parameterne ble funnet å være signifikante (s<0.0001)with adequate="" precision（="">4）（Tabell 3）.Basert på R²
(0.9996)-verdi, ble den kvadratiske modellen ansett som den best tilpassede modellen med tilstrekkelig signal (tabell 4).
Partikkelstørrelsen til forskjellige partier ble funnet å være i området 112.35-277.46 nm. Hvis andre variabler ble holdt konstante, ble partikkelstørrelsen økt ved å øke forholdet mellom medikament og lipid (tabell 1, batch F1 237.05 nm og F2 259.57 nm). Dette kan skyldes aggregering av partiklene på grunn av utilstrekkelig overflateaktivt middel til å dispergere partiklene. På den annen side viste overflateaktivt middel (1.5-4.5 prosent ) en negativ effekt på partikkelstørrelsen (tabell 1, batch F1 237.05 nm og F3 112.35 nm ). Dette kan skyldes en reduksjon i grensesnittspenningen mellom den vandige og lipidfasen som forhindrer partikkelaggregering). Homogeniseringshastigheten viste en negativ innvirkning (tabell 1, batch F5 187.46 nm og F7 134.27 nm) på partikkelstørrelsen på grunn av generering av høy kraft som bryter partiklene og dermed reduserer partikkelstørrelsen partikkelstørrelse. Ligning 3 indikerte at effekten av overflateaktivt middel (koeffisientverdi -40.87) viste en mer fremtredende effekt på partikkelstørrelse sammenlignet med homogeniseringshastighet (koeffisientverdi -24.97).cistanche deserticola bivirkningerFigur 2 utforsket påvirkningen av ulike uavhengige parametere på partikkelstørrelse.
Cistanche kan anti-aldring
3.4 Effekten av visse parametere på innfangningseffektivitet(Y2)
Følgende polymerligning ble oppnådd fra BBD som viser påvirkningen av forskjellige uavhengige parametere på innfangningseffektiviteten:
Her hadde variablene A, B, C, AB, AC, BC, A og B² en betydelig innflytelse på innfangningseffektiviteten. Ved et 95 prosent konfidensintervall var mangelen på passform ubetydelig (s<0.05)while the="" remaining="" parameters="" were="" found="" to="" be=""><0.0001)with adequate="" precision(="">4)(Tabell 3). Den kvadratiske modellen (R²=0.9991) ble ansett som den best tilpassede modellen med et tilstrekkelig signal (tabell 4).
Fra ligning 4 ovenfor, er det observert at lipid (compritol 888ATO) viste en positiv effekt mens de resterende to parameterne viste en negativ innflytelse på innfangningseffektivitet. Det overflateaktive stoffet (koeffisientverdi -7.23) hadde en mer fremtredende effekt sammenlignet med homogeniseringshastighet (koeffisientverdi -5.76). Den positive effekten av lipid på innfangningseffektivitet (tabell 1, batch F1 og F2) skyldtes tilgjengeligheten av mer lipid for akkommodasjon av tilgjengelige legemidler. En variabel effekt ble observert på innfangningseffektivitet. I det innledende stadiet, ved økning av overflateaktivt middel, ble verdien av innfangningseffektivitet økt, men ved ytterligere økning av overflateaktivt middel ble den redusert på grunn av lekkasje av medikamentet i det ytre miljø (tabell 1, batch F1 og F3). Homogeniseringshastigheten viste en negativ effekt på innfangningseffektiviteten på grunn av mer skjærkraft som kan være ansvarlig for utstøtingen av medikamentet (tabell 1, batch F5 og F7). Figur 3 utforsket effekten av ulike uavhengige parametere på
3.5 Påvirkning av uavhengige parametere på PDI(Y3)
Følgende polynomligning som viser påvirkningen av forskjellige parametere på PDI:
Here,variables like A,B, C,AB,AC,BC,A2,and C°had a significant effect on the PDI. At a 95% confidence interval, the lack of fit was insignificant(p>0.05) mens de resterende parameterne ble funnet å være signifikante (s<0.0001)with adequate="" precision(="">4)(Tabell 3). Den kvadratiske modellen (R=0.9991) ble ansett som den best tilpassede modellen med et tilstrekkelig signal (tabell 4).
Fra ligning 5 er det angitt at alle de tre uavhengige parameterne som et medikamentlipidforhold, overflateaktivt middel og homogeniseringshastighet hadde en positiv effekt på PDI. Den dominerende effekten skyldtes homogeniseringshastighet (koeffisientverdi 0.048) etterfulgt av lipid(koeffisientverdi 0.046) og minst var overflateaktivt middel (koeffisientverdi 0,014). På grunn av homogenisering ble den kinetiske energien til systemet noe høy, noe som forårsaker kollisjon og aggregering av lipidnanopartikler (tabell 1, batch F9 og F11). En høy konsentrasjon av overflateaktivt middel produserte flere små partikler som danner en bro med store partikler og dermed produserer ujevnhet som forbedrer PDI. Økning av lipidkonsentrasjonen ved et konstant nivå av overflateaktivt middel forårsaket koagulering av partikler som resulterte i en ujevn partikkelstørrelsesfordeling. Figur 4 utforsket påvirkningen av ulike uavhengige variabler på PDI). Basert på tre karakteristikker, dvs. partikkelstørrelse, innfangningseffektivitet og PDI, ble batch F9 ansett som en optimalisert formulering med verdien av partikkelstørrelse, innfangningseffektivitet og PDI 277,46 nm, 80,48 prosent og 0,275 hhv.
3.6 Karakterisering av OLP-SLN
3.6.1 Evaluering av partikkelstørrelse, PDI og zetapotensial
Verdien av partikkelstørrelse, PDI og zetapotensial for den optimaliserte batchen (F9) ble funnet å være henholdsvis 277,46 nm, 0.282, (Fig. 5A), og -23.18 mV. Den lille verdien av PDI(<0.5)indicates the="" uniform="" or="" mono="" distribution="" of="" particles="" without="" any="" aggregation="" in="" the="" developed="" slns="" dispersion.="" a="" similar="" finding="" was="" observed="" by="" yasir="" et="" al.="">cistanche dosering redditunder produksjonen av Buspiron-lastede SLN-er for levering fra nese til hjerne. Både partikkelstørrelse og overflateladning er viktig i tilfelle av nanopartikkel-medikamentlevering. Partikkelstørrelsen mindre enn 500 nm antas å rømme fra fagocytosemekanismen indusert av makrofager. Zetapotensial i form av en negativ overflateladning (rundt -20 mV) er ønskelig for riktig stabilitet av nano-formuleringen. Den observerte verdien av zetapotensialet var -23.18 mV, noe som indikerer god fysisk stabilitet
av SLN-spredning. En viktig rolle for negative overflatenanopartikler er deres tiltrekning til positivt ladede proteiner fra skadet vev og hjelper til med å regulere oksidasjonsprosessen." Den utviklede optimaliserte formuleringen
(F9) oppfylte både kriteriene for partikkelstørrelse og overflateladninger.
3.6.2 Morfologisk studie
Den optimaliserte gruppen med utviklede OLP-SLN-er(F9) indikerer den omtrentlige sfæriske formen som observert av TEM-studien (fig.5B).
3.6.3 Innfangningseffektivitet ( prosent )
Innfangningseffektiviteten til utviklede partier med OPL SLN ble funnet å være i området 50.17-86.46 prosent med 80,48 prosent av optimalisert formulering (F9) som indikerer en god medikamentinnfangningsevne til utviklede SLN. 3.6.4 Differensiell skanningskalorimetri (DSC)-studie Egenskaper som krystallinitet og termisk oppførsel til de utviklede OLP-SLN-ene er viktige egenskaper som sikrer deres anvendelse i medikamentlevering. DSC-termogrammet til OLP(medikament),lipid(compritol 888 ATO) og optimalisert formulering(F9) er representert i fig. 6. Det termiske spekteret til OPL viste en kort og bred endoterm topp ved 65,23 grader, men den gikk opp til 100,96 grad. Compritol 88ATO viste en endoterm topp ved 70,5 grader som lignet på smeltepunktet. Karakteristikktoppen til OLP var fraværende i termogrammet for optimalisert formulering (F9). Her ble bare en relativt bred topp rundt 67,81 grader observert, noe som indikerer inneslutningen av OLP i lipidmatrisen som fører til dannelsen av OLP-SLNs4.
3.6.5 In vitro legemiddelfrigjøring
Frigjøringen av medikament fra optimalisert OLP-SLN-formulering (F9) ble funnet å være 95,29±8,13 prosent som vist i fig. Frigjøringen fra den optimaliserte formuleringen viste en bi-
fasisk mønster dvs. initial rask frigjøring (23,83±4,51 i første 1 time) på grunn av frigjøring av overflateabsorbert medikament og senere vedvarende (95,29±8,13 prosent på 24 timer) på grunn av medikamentfrigjøring fra SLNs matrise. Frigjøringskinetikken til OLP-formoptimalisert formulering ble detektert ved å sette de oppnådde medikamentfrigjøringsdataene inn i de forskjellige kinetiske modellene som representert grafisk i fig.8. Maksimal R²（0.9984）-verdi ble funnet å være for førsteordens kinetiske modell. Derfor ble førsteordens kinetikk ansett som den best tilpassede modellen. Frigjøringsmekanismen ble funnet å være den Fickian diffusjonstypen med verdien av frigjøringseksponent(n)0.441.
3.6.6 Stabilitetsevaluering
Under de riktige oppbevaringsforholdene forventes enhver utviklet doseringsform å være stabil opp til bruksvarigheten (utløpsdato). Her ble den utviklede optimaliserte OLP-SLNs-formuleringen (F9) lagret ved visse lagringsforhold i henhold til spesifikasjonen gitt av ICH-retningslinjene. Formuleringen lagret ved 4±2 grader (kjøleskap) og romforhold (25±2 grader /60±5 prosent RF) var ikke signifikant (p<0.05) differ="" from="" the="" initial="" data(zero="" time)in="" respect="" of="" particle="" size,="" pdi,="" surface="" charge(zeta="" potential)="" and="" entrapment="" efficiency.="" a="" significant=""><0.05)in zeta="" potential(-19.27="" mv)and="" entrapment="" efficiency="" (73.29%)and="" a="" significant=""><0.05)in particle="" size(388.37="" nm)was="" observed="" in="" the="" formulation="" stored="" at="" 40±2℃/75±5%="" rh.it="" might="" be="" due="" to="" the="" partial="" loss="" of="" surfactant="" covering(hence="" zeta="" potential="" reduced)which="" leads="" to="" aggregation="" of="" particles(hence="" particle="" size="" increased)and="" leakage="" of="" a="" drug="" in="" the="" external="" environment="" (hence="" entrapment="" efficiency="">
3.6.7 Antioksidantaktivitet
Hovedhandlingen til OLP er å forhindre peroksidasjon ved å rense frie radikaler og bidra til å lindre skader forårsaket av oksidativt stress. Som vist i fig. 9, viste fri OLP 48,38±5.28 5 prosent antioksidant som er signifikant (p<0.01)less than="" the="" anti-oxidant="" activity="" (67.93±7.37%)of="" optimized="" formulation(f9).="" this="" could="" be="" due="" to="" the="" nano-size="" of="" the="" lipid="" particles="" which="" offered="" a="" higher="" surface="" area="" for="" the="" chemical="" quenching="" and="" also="" protect="" the="" olp="" in="" the="" external="" environment.="" no="" absorbance="" was="" found="" for="" the="" blank="" slns="" and="" hence="" blank="" slns="" did="" not="" exhibit="" any="" radical="" scavenging="" activity.="" similar="" findings="" were="" reported="" previously".="" the="" value="" of="" anti-oxidation="" activity="" for="" ascorbic="" acid="" was="" supposed="" to="" be="" 69.42±5.38%="" which="" was="" not="" significantly=""><0.05)from the="" optimized="" formulation(f9).="" 3,6.8="" anti-microbial="">
Studien viste det antimikrobielle potensialet til utviklede SLN-formuleringer av OLP(F9) mot bakteriene som Staphylococcus aureus (Gram-positiv) og Pseudomonas aeruginosa (Gram-negativ) som vist i Fig. 10. Resultatet viste at det ikke var noen hemmingssone for blankformulering siden den var fri for OLP-ekstraktet.
Den maksimale hemmingssonen for positiv kontroll og fysisk blanding (OLP-ekstrakt pluss blanke SLN-er) ble observert i løpet av de første 6 timene. Etter denne varigheten (første 6 timer), var det ingen endring i sonen for hemming av positiv kontroll og fysisk blanding. Verdien av hemmingssonen for positiv kontroll mot Pseudomonas aeruginosa og Staphylococcus aureus var henholdsvis 7,5±1,25 mm og 8±1,30 mm. Tilsvarende ble verdien av hemmingssonen for den fysiske blandingen (OLP-ekstrakt pluss blanke SLN-er) mot Pseudomonas aeruginosa og Staphylococcus aureus funnet å være henholdsvis 8,25±1,9 mm og 8,60±2,1 mm. På den annen side viste OLP-lastede SLN-er den antimikrobielle effekten i lengre tid (opptil 24 timer) sammenlignet med fri OLP og fysisk blanding. Dette er på grunn av vedvarende frigjøring av OLP fra SLNs formulering. Den antimikrobielle effekten av OLP-lastede SLN-er mot begge gram-positive
og gram-negative bakterier ble observert i opptil 24 timer. Den antimikrobielle effekten av OLP-SLN-er var signifikant (s<0.001)more than="" that="" of="" olp="" extract="" and="" physical="" mixture="" against="" pseudomonas="" aeruginosa="" and="" staphylococcus="" aureus.="" the="" value="" of="" the="" zone="" of="" inhibition="" of="" opl-slns="" against="" pseudomonas="" aeruginosa="" and="" staphylococcus="" aureus="" was="" observed="" at="" 14.75±2.25="" mm="" and="" 16.30±2.1="" mm="" in="" 24="" h="" respectively.="" moreover,="" study="" findings="" indicated="" that="" all="" formulations="" containing="" olp="" extract="" exhibited="" better="" anti-microbial="" efficiency="" towards="" gram-positive="" staphylococcus="" aureus="" as="" compared="" to="" gram-negative="" pseudomonas="" aeruginosa,4".="" to="" the="" best="" of="" our="" knowledge,="" the="" previous="" report="" showed="" that="" the="" major="" constituents="" for="" antimicrobial="" activity="" present="" in="" the="" olive="" extract="" are="" cyclotrisiloxane="" hexamethyl(36.98%),="" cyclo-tetrasiloxane="" octamethyl(15.18%),="" and="" cyclopentasilox-ane="">
4. Konklusjon
I denne studien ble olivenbladekstraktpulver som var mindre stabilt under normale miljøforhold vellykket omdannet til en stabil SLNs-formulering. Den optimaliserte formuleringen viste en lovende partikkelstørrelse, innfangningseffektivitet samt overflateladninger. Den optimaliserte formuleringen viste et vedvarende medikamentfrigjøringsmønster i opptil 24 timer etter den første ordens legemiddelfrigjøringskinetiske og Fickian diffusjonstype av medikamentfrigjøringsmekanisme. Stabilitetsstudien ble utført og den optimaliserte formuleringen (F9) var stabil under de angitte lagringsforholdene. OLP-formulering viste en lovende antioksidant-egenskap som rettferdiggjort av DPPH-analysemetoden. Den antimikrobielle aktiviteten mot Gram-positive (Staphylococcus aureus) og Gram-negative (Pseudomonas aeruginosa) bakterier. Til slutt ble det konkludert med at SLN-er kunne være de lovende bærerne for levering av olivenbladekstraktpulver.
Denne artikkelen er hentet fra J. Oleo Sci. 70, (10) 1403-1416 (2021)
