Overvinne immunsvikt med allogrooming

Enkel oppsummering:

Vi undersøkte om to nært beslektede termittarter er forskjellige i deres avhengighet av sosial eller individuell immunitet mot to arter av patogene sopp, som alle ble samlet fra samme sted. Resultatene våre indikerer at gjensidig pleie (allogrooming) er svært effektivt for å begrense dødelige infeksjoner i den grad det kan kompensere for relativt svakt individuelt immunforsvar. Etter at patogener er påtruffet, bruker termitter en alternativ strategi for sosial distansering og begrenser spredningen av smittsomme sykdommer og kommer i stedet sammen for å rense hverandre. Variasjon i intensiteten til denne atferdsresponsen indikerer en nyansert respons på trusselnivået.

cistanche supplement fordeler-øke immunitet

Abstrakt:

Allogrooming ser ut til å være avgjørende hos mange sosiale dyr for beskyttelse mot rutinemessig eksponering for parasitter. Hos sosiale insekter ser det ut til å være avgjørende for fjerning av patogene forplantninger fra kutikula før de kan starte en smittsom syklus. For underjordiske termitter inkluderer dette soppsporer som ofte forekommer i jorda, for eksempel Metarhizium conidia, som raskt kan spire og trenge inn i skjellaget. Vi undersøkte om det er en forskjell i avhengighet av sosial og medfødt immunitet hos to nært beslektede underjordiske termitter for beskyttelse mot dødelige infeksjoner av to lokalt påtruffet Metarhizium-arter. Resultatene våre indikerer at relativt svak medfødt immunitet hos en termittart kompenseres av mer vedvarende allogrooming. Dette inkluderer forbedret allogrooming som respons på konsentrasjoner av konidier som reflekterer mer rutinemessig kontaminering av kutikulaen, så vel som på kraftig kutikulær kontaminering som fremkaller en nettverksbasert nødrespons.

Nøkkelord:

sosial immunitet; medfødt immunitet; entomopatogener; alarmoppførsel; endestasjon

cistanche tubulosa-forbedre immunsystemet

Klikk her for å se Cistanche Enhance Immunity-produkter

【Be om mer】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

1. Introduksjon

Sosiale forsvarsmekanismer kan være svært effektive for å motvirke mottakelighet for smittsom sykdom til tross for sosialitet som favoriserer spredningen [1,2]. Hos termitter og maur ser utviklingen av effektive sosiale mekanismer for immunforsvar ut til å ha avslappet selektivt press på individuelle medfødte immunmekanismer [3–6]. Etter at patogener er påtruffet, vil trusselen om sykdom hos sosiale insekter avhenge av effekten av medfødt frontlinjeforsvar, som inkluderer fysiske barrierer for infeksjon. Mange sopppatogener produserer aseksuelle sporer (konidier) som kan trenge direkte inn i insektets kutikula. Sosialt immunforsvar som bidrar til å beskytte neglebåndet, inkludert allogrooming og utskilte soppdrepende midler, ser ut til å være spesielt viktig hos termitter for forsvar mot Metarhizium spp [7–9]. Metarhizium conidia er allestedsnærværende i jorden som mange termitter beveger seg gjennom mens de søker etter mat og når konsentrasjoner som opprettholder en konstant trussel om infeksjon [10]. Forsøkende termitter, som arter av slekten Reticulitermes, beveger seg gjennom jorda for å utvide kolonienes rekkevidde og få tilgang til flere fôringssteder, som vanligvis er treressurser som hviler på jordoverflaten [11]. Kolonienes underjordiske nettverk kan strekke seg over titalls meter, inneholde over hundre tusen individer og nå tettheter på over hundre kolonier per hektar [12]. De utviklet seg fra en stamfar med kolonier begrenset til et enkelt trestykke [13,14]. Denne overgangen ville ha resultert i økte møter med rovdyr, patogener og konkurrenter og falt sammen med utviklingen av en dedikert ekte arbeiderkaste som vanligvis gir avkall på direkte reproduksjon. Forbedret hygiene har sannsynligvis vært avgjørende for denne overgangen og den påfølgende strålingen og den nåværende økologiske suksessen til termitter, hvis bidrag til treforfall kan overstige mikrobiell nedbrytning [15,16] og som ser ut til å raskt ekspandere globalt når temperaturen stiger [17] . Under overgangen til næringssøk falt en avslapning av selektivt press på medfødte immungener sammen med intensiveringen på to gener som produserer utskilte antifungale proteiner [6]. Disse proteinene ser ut til å være avgjørende for fjerning av soppkonidier med allogrooming. Det kontrasterende selektive presset på komponenter av individuelle medfødte og sosiale forsvarsmekanismer i det siste antyder at det fortsetter å være en adaptiv avveining i termitters avhengighet av individuell medfødt og sosial immunitet for beskyttelse mot soppsykdom. Dette støttes av observasjonen at medfødt immungenuttrykk er lavere i grupper enn individer av Reticulitermes-arbeidere som har vært utsatt for Metarhizium conidia [18]. Allogrooming reduserer behovet for å aktivere indre immunsystem. I denne studien undersøkte vi forskjeller i sosial og medfødt immunitet hos to arter av underjordiske termitter mot to lokale arter av Metarhizium som møter hverandre naturlig. Metarhizium-artene ble isolert fra jorda under eller ved siden av tømmerstokker der termitter ble samlet inn. De to termittartene, Reticulitermes virginicus og Reticulitermes flavipes, ble samlet fra samme sted i Maryland. Selv om de ser ut til å være agonistiske, blir de ofte funnet ved siden av hverandre eller til og med i samme stokk. Interspesifikk aggresjon mellom arbeidere resulterer ofte i dødelige sår i petriskålagonismeanalyser [19]. Den soppdrepende aktiviteten til kutikulære vask av R. virginicus-arbeidere har tidligere vist seg å være mer effektiv til å inaktivere Metarhizium conidia enn vask fra R. flavipes-arbeidere [20]. Dette antyder at selv om disse to termittene er nært beslektet og møter de samme patogenene, kan de være forskjellige i deres avhengighet av individuell medfødt eller sosial immunitet. Vi brukte en komparativ tilnærming for å undersøke om det er en forskjell mellom avhengighet av og integrering av sosial og medfødt immunitet og om det er en potensiell avveining mellom de to. Forbedret sosial immunitet kan være assosiert med mindre effektive medfødte immunmekanismer, som kan inkludere styrken til utskilte soppdrepende midler, og omvendt. Svakere individuell immunitet kan kompenseres av mer effektiv sosial immunitet. Overlevelsen av termittarbeidere på sent stadium i grupper på tolv, par eller singletons ble undersøkt etter at de hadde blitt utfordret med sopp fra enten Metarhizium robertsii eller Metarhizium brunneum. Grupper på 12 arbeidere ble kortvarig eksponert for en høy dose av soppen. Denne potensielt dødelige konsentrasjonen forårsaker lignende atferdsreaksjoner som observeres når termitter møter et sporulerende kadaver, og i noen tilfeller fremkaller en betydelig økning i en alarmrespons som resulterer i raske langsgående oscillerende bevegelser, LOMs [21–23]. Hyppigheten av LOM-er i de første 12 minuttene etter at termitter er utsatt for konidier av forskjellige stammer og arter av Metarhizium er positivt korrelert med hyppigheten av anfall av allogrooming. LOM-er, som er lettere å måle enn allogrooming, kan derfor brukes som et indirekte mål på allogrooming-nivåer. Påvisning av soppen ser ut til å bli forsinket til overflatene til termitter er forurenset med konidier, noe som tyder på at gjenkjennelsesreseptorer knyttet til munndeler er kritiske for utbruddet av forhøyet alarm og allogrooming. Par og singletons ble utsatt for en lav dose av soppen som er mer sannsynlig å reflektere eksponeringsnivåene som termitter møter når de konstruerer gallerier gjennom jorda, i motsetning til direkte møter med spordannende kadaver. I motsetning til enkelttermitter er termittpar nesten fullstendig motstandsdyktige mot dødelige infeksjoner ved denne dosen over 10 dager. For å erte sosial og medfødt immunitet ved denne lave dosen, ble termittpar separert på forskjellige tidspunkter kort tid etter utfordringer med soppkonidier, og overlevelsen til disse parene ble sammenlignet med singletons som ikke hadde muligheter for sosiale interaksjoner etter sopputfordringer. Allogrooming og LOM-er ble observert før separasjonstidspunktene for termittpar. I tillegg ble den antifungale aktiviteten til råekstrakter av hele termitter testet for ytterligere å vurdere forskjeller i medfødt immunitet mellom de to termittartene som respons på de to soppartene.

Fordeler med cistanche tubulosa-styrke immunsystemet

2. Metoder

2.1. Studer organismer

Termittene R. flavipes og R. virginicus, og soppene M. brunneum og M. Roberts, ble samlet fra sekundærvekst løvskog i Baltimore County (Pleasant Hills og Monkton), Maryland. Termittarter ble identifisert ved bruk av intra- og interspesifikke agonismeanalyser [19] og mitokondrielle rRNA-sekvenser [4]. Metarhizium-artene ble isolert fra jordprøver nær termittsamlingssteder (<30 cm) using a baiting technique with Tenebrio molitor larvae [24]. The conidia and mycelia of two clonal lines of the species were used for DNA purification with a QIAGEN DNeasy Blood and Tissue kit. The 50 regions of translation elongation factor 1-alpha were PCR-amplified using PCR primers EF1T and EF2T [25]. These regions were Sanger-sequenced (Psomagen, Rockville, MD) for species identification. Foraging groups of R. flavipes and R. virginicus (>1000) og veden de matet i ble samlet og lagret i plastbeholdere under mørke, fuktige forhold ved 25 ◦C. Termitter som tilhører samme art ble samlet inn fra lokaliteter som var adskilt med minst 60 m, noe som vanligvis er tilstrekkelig til å sikre at samlingene er fra forskjellige kolonier [12]. Disse separate samlingene blir referert til som kolonier nedenfor. Termitter ble samlet inn sommeren 2018 og 2019 for forsøkene med gruppene på 12 samt in vitro-forsøk med termitt-råekstrakter, og i 2021 og 2022 for forsøkene med par og singletons. Termitter ble brukt i sine respektive eksperimenter innen 4 måneder etter innsamling. Arbeidere ble forsiktig fjernet fra trestykker og holdt i grupper med 12 55 mm diameter petriskåler foret med fuktet filterpapir (Whatman 1) i 24 timer i omgivelseslys før de ble brukt til eksperimentene våre. Dette tillot dem å akklimatisere seg til lys og rense kutikulære overflater for partikkelrester før soppeksponeringene. Vi inkluderte ikke soldater ettersom de ikke stelle nestkamerater, representerer 1–2 % av kolonien og ikke konsekvent finnes i fôrsøkende grupper.

2.2. Overlevelse og alarmrespons for grupper på tolv

Grupper på 12 R. flavipes- eller R. virginicus-arbeidere ble utsatt for en høy dose av 10 6 conidia mL−1 av 0.05 % Tween 80 (MilliporeSigma , Burlington, MA, USA) eller 0,05 % Tween 80 for kontroller. Tween 80 ble inkludert for å hjelpe til med å bryte opp klumper av konidier ved fremstilling av suspensjonene. Dagen før disse behandlingene ble alle 12 termittene merket med en liten prikk med farget emaljemaling på ryggsiden av magen, slik at de kunne identifiseres individuelt. Allogrooming fjernet malingen fra noen få individer, men disse individene kunne fortsatt identifiseres individuelt ved dødstidspunktet ved å kartlegge de overlevende og ved naturlig individuell variasjon hos arbeiderne, for eksempel graden av mørk farge i magen. Termittene som ble brukt for hver replikat av 12 utfordrede termitter og kontroller var fra forskjellige kolonier. Fem kolonier ble brukt for både R. flavipes og R. virginicus (n=480 arbeidere). Eksperimenter med M. Roberts-kolonier ble gjentatt etter tre måneder for å teste for konsistens i overlevelse. Totalt var det 60 replikater av 12 eller 11 termitter (n=709). I 11 replikater døde en termitt før soppeksponering, noe som så ut til å skyldes håndtering ved malingsmerking. Termitter ble eksponert for konidier fremstilt fra en klonal kultur av enten M. Roberts eller M. brunneum. Arbeidere ble tilsatt til 1,5 ml rør som inneholdt 500 µL av konidia-fortynningene, eller 0,05 % Tween 80 for kontroller, med en liten plasttrakt og forsiktig omrørt i 10 s for å sikre fullstendig nedsenking. Arbeiderne ble deretter avsatt på filterpapir for å absorbere overflødig væske, overført til 55 mm diameter petriskåler foret med fuktet filterpapir (Whatman 1), og video tatt opp i 12 minutter. Dødeligheten ble overvåket daglig i to uker. Døde individer ble fjernet, overflatesterilisert med 70 % etanol og plassert på fuktig filterpapir i petriskåler (55 mm) holdt ved 24 ◦C og 100 % fuktighet for bekreftelse av Metarhizium-infeksjon (grønn muskardinvekst etter 3–4 dager). Det totale antallet LOM-er observert i videoene over 12 minutter ble skåret for hver termitt. LOM-er varte mellom 2–7 s og måtte ha stoppet og deretter gjenopptatt for å bli scoret som separate hendelser [23].

2.3. Overlevelse og allogroming for par og enslige

Overlevelsen av termittpar ble sammenlignet med singletons etter eksponering for en lav dose (104 konidier mL−1) av konidier som ikke forårsaket overdreven dødelighet og sannsynligvis gjenspeiler konsentrasjoner som termitter møter når de beveger seg gjennom jord [10] . Par og singletons ble sammenlignet for å måle overlevelse gitt av sosiale forsvarsmekanismer. Grupper på 12 arbeidere ble først utfordret med eller uten sopp som beskrevet ovenfor, bortsett fra at konidiasuspensjoner på ca. 107 konidier ml-1 ble fremstilt i 0,1 % Tween 80 og kraftig vortexet før fortynninger med sterilt vann til 104 konidia ml-1. Tween 80 ble ikke inkludert i fortynningene fordi suspensjoner av individuelle konidier kunne opprettholdes ved lave konsentrasjoner og fordi det overflateaktive stoffet kan forstyrre adhesjonen av konidier til kutikula. Disse personene var ikke malingsmerket. Umiddelbart etter behandlinger og før termitter hadde mulighet til å samhandle, ble de delt inn i par eller singletons i brønnene på 24-brønnplastcellekulturplater (CELLTREAT Scientific, Pepperell, MA). Hver brønn ble foret med fuktet filterpapir (Whatman 1). For hver termitt/soppkombinasjon (n=4) ble fire termittpar skilt i singletons etter 15 minutter, 2 timer, 5,5 timer, 8 timer og 27 timer (n=160), og for hver termitt/soppkombinasjon 12 termitter som aldri hadde mulighet til å interagere ble separert i soppbehandlede eller kontrollsingle (n=96). Disse individuelle termittene ble også delt inn i 24-brønnplater dekket med filterpapir. Termittenes dødelighet ble deretter overvåket over ti dager, og døde individer ble fjernet for bekreftelse av infeksjon med Metarhizium. En enkelt koloni ble brukt for både R. flavipes behandlet med M. robertsii eller M. brunneum og R. virginicus behandlet med M. robertsii eller M. brunneum (n=256). Seks ubehandlede par ble også holdt i 24-brønnplater i 10 dager for hver art. Et separat eksperiment med de samme koloniene fokuserte på å registrere allogrooming før separasjonstidene til parene ved 15 minutter, 2 timer, 5,5 timer, 8 timer og 27 timer. Seks forskjellige par av hver termittart ble behandlet med hver sopp eller vann for kontroller og scoret for allogrooming i 15 minutter før separasjonstidspunktene (n=180). Allogrooming-hendelser ble skåret når munn-til-kropp-kontakt mellom to termitter involverte bevegelse av munndeler (palper), og varigheten av hver uavbrutt allogrooming-hendelse ble registrert. Allogrooming ble skåret av en enkelt observatør som var blind for hvilken behandling termitter hadde fått. LOM-er ble også skåret, men var ubetydelige og ble ikke brukt i analysen. Selvpleie ble ikke observert.

Fordeler med cistanche tubulosa-styrke immunsystemet

2.4. In vitro antifungal aktivitet

Tolv arbeidere fra 5 R. flavipes- eller R. virginicus-kolonier ble kaldt immobilisert i 1,5 mL Eppendorf-rør, og 12 0 µL kaldt, sterilt vann ble tilsatt til hvert rør. Arbeiderne fra begge artene som ble brukt i denne studien var omtrent like store (lengde 4–5 mm). Termittene ble homogenisert med en plaststøter, og ekstraktet ble sentrifugert ved 16,000 g i 2 minutter. Supernatanten ble filtersterilisert med 0,22 µm Ultrafree-filtre (MilliporeSigma, Burlington, MA, USA). Ti µL av filtratet ble inkubert i 24 timer med 10 µL inneholdende 100 konidier av M. robertsii eller M. brunneum og 20 µL 100 µg ml-1 ampicillin for ytterligere å unngå bakteriell kontaminering. Kontroller inkluderte 10 µL sterilt vann i stedet for råekstraktet. To replikater for hver inkubert blanding ble spredt på potet dekstrose-agar (PDA) supplert med 50 µg ml-1 ampicillin (60 mm petriskåler) og inkubert ved RT i mørket i 4–5 dager. Antifungal aktivitet ble målt ved å sammenligne kolonidannende enheter (CFUer) i råekstraktbehandlinger med kontroller.

2.5. Statistikk

Kaplan-Meier estimater av gjennomsnittlig overlevelsestid ble brukt for parvise sammenligninger av overlevelse. Hazard ratios of death (HRs) ble beregnet med Cox regresjonsanalyse. Vi brukte Cox-regresjon for å undersøke forskjeller i dødelighet mellom individer som viser LOM-er eller ikke viser LOM-er mens vi kontrollerer for andre kategoriske variabler (soppbehandling eller kontroll, sopparter, termittarter, opprinnelseskoloni). LOM-er ble kategorisert som fraværende eller tilstede hos individer på grunn av hyppigheten av uteliggere og mangel på normalitet. I overlevelsesanalysen med termittpar og singleton var HR basert på en sammenligning mellom konidiebehandlede par (separert på ulike tidspunkt) og konidiebehandlede singletons. Disse HR-ene gir derfor et mål på overlevelse gitt av sosiale forsvarsmekanismer mens de kontrollerer for individuelle forsvarsmekanismer. Sammenhengen mellom tid brukt som et par og endring i HR ble målt med Pearson-korrelasjoner. Fordelingen av LOM-er mellom ulike behandlinger ble sammenlignet med en Kruskal–Wallis-test med Bonferroni-korreksjoner for flere tester for parvise sammenligninger. Gjennomsnittlig CFU eller varighet av allogrooming-hendelser ble sammenlignet med en ANOVA-test med Bonferroni-korreksjoner for parvise sammenligninger. Vi brukte IBM SPSS Statistics (versjon 28) for de statistiske testene.

3. Resultater

3.1. Overlevelse og alarm av utfordrede grupper på tolv

The Cox regression model of survivorship that included categorical variables for fungal treatment, LOMs, termite species, fungi species, and a colony of origin was significant (Chi-square = 246.29, df = 12, p < 0.001). Challenged termites were 9.28 times more likely to die than untreated termites (Wald = 143.05, p < 0.001) while controlling for the other variables. Termites that displayed LOMs (n = 422) were 1.52 times more likely to survive (Wald = 8.30, p = 0.004) than individuals that did not display LOMs (n = 286). R. virginicus workers were 2.08 times more likely to die than R. flavipes workers (Wald = 6.31, p = 0.012). Fungal species did not contribute significantly to the model (Wald = 0.841, p = 0.359). The colony of origin contributed significantly to the model (Wald = 50.16, p < 0.001), which is consistent with previously reported colony variation in Reticulitermes resistance to Metarhizium infections [24]. Survivorship did not differ between the same colony when the experiment was repeated 3 months later with workers that were exposed to M. Roberts (Breslow pairwise comparison, Chi-square = 0.342, p = 0.559). Most deaths in the challenged termites were attributable to Metarhizium infection (>9 0 % bekreftelse). For utfordrede termitter med M. Roberts ble 129 dødsfall observert blant 237 individer, og gjennomsnittlig overlevelsestid for R. virginicus (9,10 dager) var signifikant lavere enn for R. flavipes (10. 98 dager)(Breslow=10.05, df=1, s=0.002) (Figur 1). For utfordrede termitter med M. brunneum ble det observert 79 dødsfall blant 120 individer, og gjennomsnittlig overlevelsestid for R. flavipes (9,70 dager) var lavere enn for R. virginicus (10,68 dager), men ikke signifikant (Breslow=2 .74, df=1, s=0.098). Fordelingen av LOM-er (figur 2) blant sopp- og kontrollbehandlinger var signifikant forskjellig (Kruskal–Wallis=176.897, df=5, p < 0.001). Frekvensen av LOM-er var ikke signifikant forskjellig mellom M. brunneum-behandlinger og deres respektive kontroller for R. flavipes (justert p=0.097) og R. virginicus (justert p=1.000 ). Hyppigheten av LOM-er var imidlertid signifikant høyere for M. Roberts-behandlinger sammenlignet med deres respektive kontroller for R. flavipes (justert p < 0,001) og R. virginicus (justert p < 0,001) (Figur 2). For M. Roberts-behandlingen var frekvensen av R. flavipes LOM-er signifikant høyere enn R. virginicus LOM-er (justert p < 0,001). For M. brunneum-behandlingen var imidlertid frekvensen av R. flavipes LOM-er ikke signifikant forskjellig fra R. virginicus LOM-er (justert p=1.000). I motsetning til M. brunneum, resulterte grupper på 12 termitter utfordret med M. Roberts konidier i en signifikant atferdsrespons.

3.2. Overlevelse av utfordrede par og singletoner

Overlevelsen av termittpar separerte til forskjellige tider kort tid etter patogenutfordring ble sammenlignet med overlevelsen av utfordrede singletons med hazard ratios of death (HRs). En HR på 1 tilsvarer lik overlevelse i de adskilte parene og singletonene over ti dager. Verdier mindre enn én indikerer at det er redusert dødelighet i de separerte parene sammenlignet med singletonene. Korrelasjonen mellom tid brukt som et par og reduksjonen i HR var bare signifikant for R. flavipes behandlet med enten M. Roberts (r=−0.978, s=0.{ {7}}04) eller M. brunneum (r=−0.983, s=0.003), og ikke for R. virginicus behandlet med noen av dem M. Roberts (r=−0,643, s=0.242) eller M. brunneum (r=−0,812, s=0.095). Dette gjenspeiles også i R2-verdiene fra lineære regresjoner vist i figur 3 (tiden ble log-transformert for beregning av Pearson-korrelasjonene og R2-verdiene). Ingen død ble observert i ubehandlede par (6 par for hver termittart) og ett dødsfall i 16 behandlede par (4 par for hver termitt/soppkombinasjon) som aldri ble separert over 10 dager.

Figur 1. Overlevelse for grupper på 12. Rf samsvarer med R. flavipes, Rv med R. virginicus, Mr med M. robertsii og Mb med M. brunneum. Signifikante overlevelsesforskjeller for parvise sammenligninger var basert på Breslow-tester (generaliserte Wilcoxon-tester). * Signifikant forskjell mellom behandlinger, NS ingen signifikant forskjell mellom behandlinger (s< 0.025 Bonferroni adjusted α). The distribution of LOMs (Figure 2) among fungal and control treatments was significantly different (Kruskal–Wallis = 176.897, df = 5, p < 0.001). The frequency of LOMs was not significantly different between M. brunneum treatments and their respective controls for R. flavipes (adjusted p = 0.097) and R. virginicus (adjusted p = 1.000). However, the frequency of LOMs was significantly greater for M. robertsii treatments compared to their respective controls for R. flavipes (adjusted p < 0.001) and R. virginicus (adjusted p < 0.001) (Figure 2). For the M. robertsii treatment, the frequency of R. flavipes LOMs was significantly greater than R. virginicus LOMs (adjusted p < 0.001). However, for the M. brunneum treatment, the frequency of R. flavipes LOMs was not significantly different from R. virginicus LOMs (adjusted p = 1.000). In contrast to M. brunneum, groups of 12 termites challenged with M. robertsii conidia resulted in a significant behavioral response. 

Figur 1. Overlevelse for grupper på 12. Rf samsvarer med R. flavipes, Rv med R. virginicus, Mr med M. robertsii og Mb med M. brunneum. Signifikante overlevelsesforskjeller for parvise sammenligninger var basert på Breslow-tester (generaliserte Wilcoxon-tester). * Signifikant forskjell mellom behandlinger, NS ingen signifikant forskjell mellom behandlinger (s< 0.025 Bonferroni adjusted α). For the survivorship of pathogen-challenged single termites (Figure 4), 47 deaths were observed among 48 individuals, and the mean survival time for R. flavipes (4.21 days) was significantly lower than for R. virginicus (6.17 days)(Breslow, chi-square = 33.927, df = 1, p < 0.001). This relationship held for both species of fungi: For M. robertsii exposure, the mean survival time for R. flavipes (4.25 days) was significantly lower than for R. virginicus (5.83 days) (chi-square = 16.133, df = 1, p < 0.001); For M. brunneum exposure, the mean survival time for R. flavipes (4.17 days) was significantly lower than for R. virginicus (6.50 days) (chi-square = 20.994, df = 1, p < 0.001). 3.3. Antifungal Activity of Crude Extracts The two species of fungi were analyzed separately (the viability of conidia on PDA differs between the two species). For M. robertsii, mean colony-forming units (CFUs) among fungal and control treatments were significantly different (F = 18.08, df = 2, p < 0.001) (Figure 5a). Crude extracts of R. virginicus but not R. flavipes workers showed significant antifungal activity against M. robertsii compared to the control (adjusted p < 0.001 and p = 1.000, respectively). The antifungal activity of R. virginicus extracts against M. robertsii was significantly greater than the antifungal activity of R. flavipes extracts against M. robertsii (adjusted p < 0.001). For M. brunneum, mean CFUs (Figure 5b) among fungal and control treatments were significantly different (F = 27.26, df = 2, p < 0.001). Crude extracts of R. virginicus but not R. flavipes showed significant antifungal activity against M. brunneum compared to the control (adjusted p < 0.001 and p = 0.072, respectively). The antifungal activity of R. virginicus extracts against M. brunneum was significantly greater than the antifungal activity of R. flavipes against M. brunneum (adjusted p < 0.001).

3.3. Antifungal aktivitet av råekstrakter

De to soppartene ble analysert separat (levedyktigheten til konidier på PDA er forskjellig mellom de to artene). For M. robertsii var gjennomsnittlige kolonidannende enheter (CFU) blant sopp- og kontrollbehandlinger signifikant forskjellige (F=18.08, df=2, p < 0 .001) (Figur 5a). Råekstrakter av R. virginicus, men ikke R. flavipes-arbeidere, viste signifikant antifungal aktivitet mot M. robertsii sammenlignet med kontrollen (justert p < 0.001 og p=1.{{ 10}}, henholdsvis). Den antifungale aktiviteten til R. virginicus-ekstrakter mot M. robertsii var signifikant større enn den antifungale aktiviteten til R. flavipes-ekstrakter mot M. robertsii (justert p < 0,001). For M. brunneum var gjennomsnittlige CFUer (Figur 5b) blant sopp- og kontrollbehandlinger signifikant forskjellige (F=27.26, df=2, p < 0.001). Råekstrakter av R. virginicus men ikke R. flavipes viste signifikant antifungal aktivitet mot M. brunneum sammenlignet med kontrollen (henholdsvis justert p < 0,001 og p=0}.072). Den antifungale aktiviteten til R. virginicus-ekstrakter mot M. brunneum var signifikant større enn den antifungale aktiviteten til R. flavipes mot M. brunneum (justert p < 0,001).

Figur 2. Alarmrespons på sopputfordring. Boksplott representerer fordelingen av LOM-er (LOM-er scoret i 709 malingsmerkede individer). Bokser samsvarer med avstanden mellom øvre og nedre kvartil fra medianen (IQR). Værehår tilsvarer 1,5 × IQR. Sirkler og asterisker viser uteliggere utover henholdsvis 1,5 × IQR eller 3 × IQR. Ulike bokstaver indikerer betydelige forskjeller mellom fordelinger for sopp- og kontrollbehandlinger (Bonferroni justert). Rf korresponderer med R. flavipes, Rv med R. virginicus, Mr med M. robertsii og Mb med M. brunneum.

3.4. Allogrooming blant utfordrede par

Frekvensen av allogrooming-anfall reduserte betydelig med sopputfordringer (utfordringsgjennomsnitt {{0}}.55, kontrollmiddel=8.80, t=−4.461, p < {{20}}.001). Imidlertid økte gjennomsnittlig varighet av allogrooming signifikant med sopputfordringer (utfordringsgjennomsnitt=19.01 s, kontrollmiddel=5.62 s, t=4.876, p < 0.001). Varigheten av allogrooming-anfallene for hver interaksjon mellom termittpar var signifikant forskjellig på tvers av behandlinger og kontroller (F=7.166, df=5, p < 0.001) (Figur 6). Allogrooming-varigheten per hendelse var signifikant forhøyet i R. flavipes-par behandlet med M. robertsii (justert p < 0,001) eller M. brunneum (justert p=0.037) i forhold til kontroller, men ikke i R. virginicus-par behandlet med M. robertsii (justert p=1.000) eller M. brunneum (justert p=1.000) i forhold til kontroller.

Figur 3. Overlevelsen av to termitter versus én ble sammenlignet med fareforhold for død (n=80 par, 96 singletons). Rf korresponderer med R. flavipes, Rv med R. virginicus, Mr med M. robertsii og Mb med M. brunneum. Tiden ble loggtransformert for beregning av R2-verdiene.

Figur 4. Overlevelse av enkelttermitter etter en sopputfordring (n=96). Rf korresponderer med R. flavipes, Rv med R. virginicus, Mr med M. robertsii og Mb med M. brunneum. Se tekst for detaljer om statistiske forskjeller mellom behandlinger. Signifikante overlevelsesforskjeller for parvise sammenligninger var basert på Breslow-tester (generaliserte Wilcoxon-tester). * Signifikant forskjell mellom behandlinger (p < 0.025 Bonferroni justert).

Figur 5. Råekstrakt antifungal aktivitet mot M. robertsii (a) og M. brunneum (b). Verdier over søyler representerer gjennomsnittlig CFU (±SD), og forskjellige bokstaver indikerer signifikante forskjeller (Bonferroni justert). Rf samsvarer med R. flavipes og Rv med R. virginicus. Analysen brukte to replikater fra 5 kolonier fra hver termittart, 6 replikater for Rf-kontrollen og 2 replikater for Rv-kontrollen.

Figur 6. Varighet av allogrooming per interaksjon (n=161 allogrooming-hendelser). Verdiene over søylene representerer gjennomsnittlig varighet av allogrooming-interaksjoner (±SD), og distinkte bokstavkombinasjoner indikerer signifikante forskjeller (Bonferroni justert). Rf korresponderer med R. flavipes, Rv med R. virginicus, Mr med M. robertsii og Mb med M. brunneum.

4. Diskusjon

R. flavipes er avhengig av sosiale forsvarsmekanismer mot lokale sopppatogener i større grad enn R. virginicus. For R. flavipes-arbeidere utfordret med begge Metarhizium-arter, var det en sterk negativ korrelasjon mellom tiden to termitter tilbrakte sammen og sannsynligheten for død i forhold til utfordrede enkelttermitter. Risikoforholdet for død i forhold til utfordrede enkelttermitter ble halvert på omtrent to timer (figur 3). Tidlige sosiale interaksjoner ser derfor ut til å være kritiske for overlevelse når R. flavipes-arbeidere møter lave konsentrasjoner av Metarhizium conidia. I kontrast viste R. virginicus-arbeidere en svak sammenheng mellom tiden to termitter tilbrakte sammen og sannsynligheten for død. I motsetning til R. virginicus, økte R. flavipes arbeiderpar betydelig varigheten av allogrooming-anfall etter en sopputfordring (Figur 6). Påvisning av konidier på en redekamerats kutikula har sannsynligvis ført til denne økningen. Mer effektiv fjerning av konidier fra kutikulære overflater ved å øke varigheten av allogrooming-anfall ser ut til å forklare R. flavipes' overlegne sosiale immunitet. Resultatene våre indikerer også at R. virginicus er avhengig av individuelle medfødte forsvarsmekanismer mot lokale sopppatogener i større grad enn R. flavipes. Dødeligheten til enkeltarbeidere med R. flavipes som ble utfordret med en av Metarhizium-artene var signifikant høyere enn dødeligheten til arbeidere med R. virginicus (Figur 4). Den antifungale aktiviteten til R. virginicus worker kutikulære vasker mot Metarhizium conidia har tidligere vist seg å være betydelig sterkere enn aktiviteten til R. flavipes-arbeidere [20]. Den antifungale aktiviteten til råekstrakter av hele termitter var også sterkere hos R. virginicus enn hos R. flavipes (Figur 5). Disse ekstraktene inkluderer forbindelser fra intestinale symbionter, som sammen med termitt-antifungale forbindelser også kan bidra til å eliminere inntatte konidier [26]. Variasjonen i fareforhold for død og deres svake korrelasjon med separasjonstider hos R. virginicus-arbeidere er i samsvar med en større avhengighet av medfødte immunforsvarsmekanismer som varierer mellom individer i stedet for sosiale immunmekanismer. R. flavipes viste også en større avhengighet av sosial immunitet når grupper på 12 arbeidere ble kortvarig eksponert for høye konsentrasjoner av M. robertsii conidia. Umiddelbart etter eksponering for M. robertsii conidia viste begge termittartene forhøyede LOMs. Denne alarmaktiviteten var signifikant høyere hos R. flavipes enn hos R. virginicus (Figur 2), og motstanden mot dødelige infeksjoner var også signifikant høyere hos R. flavipes enn hos R. virginicus (Figur 1). Derimot var det en forhøyet, men svak alarmrespons på M. brunneum conidia. I samsvar med dette resultatet er det tidligere vist at forhøyet alarm i R. flavipes som respons på konidiene til forskjellige Metarhizium-stammer og arter er korrelert med forhøyet allogrooming og overlevelse [23]. R. flavipes-arbeidere kan ha en lavere terskel enn R. virginicus-arbeidere for å gjenkjenne og reagere kollektivt og effektivt på kutikulær kontaminering med M. robertsii conidia. M. robertsii, som er den mest utbredte Metarhizium-arten på vårt studiested [24], kan representere en trussel mot R. flavipes som krever en sterk sosial immunrespons fordi denne termitten har relativt svakt medfødt immunforsvar mot seg. Effektiviteten til soppdrepende forbindelser assosiert med spyttkjertelsekresjoner er sannsynligvis avgjørende for det individuelle forsvaret observert i denne studien [20]. Disse forbindelsene er tilstede på overflaten til arbeiderne før sopputfordringer ettersom de uttrykkes konstitutivt og stadig spres av basale nivåer av allogrooming, som derfor integrerer individuelle og sosiale forsvar. Denne gestalten inkluderer sannsynligvis det lille defensinlignende antifungale peptidet termicin, som skilles ut i spyttkjertelen og er kritisk viktig for forsvar mot dødelige infeksjoner av Metarhizium [27]. En studie av R. flavipes og R. virginicus fra samme innsamlingssted i Maryland som ble brukt i denne studien viste at termiciner nylig møtte et selektivt sveip som resulterte i en reduksjon i nukleotidpolymorfisme, og denne reduksjonen var større hos R. flavipes enn R. virginicus [28].

cistanche tubulosa-forbedre immunsystemet

Sveipen kan ha vært og fortsetter muligens å være mer alvorlig for R. flavipes fordi R. virginicus har mer effektive medfødte immunmekanismer som reduserte avhengigheten av termiciner for forsvar mot en nylig soppepidemi. Alternativt kan adaptive begrensninger på termittevolusjon (mangel på genetisk variasjon) ha etterlatt R. flavipes med svakere våpen i møte med en ny soppepidemi. Begrensning på adaptiv endring i termiciner under sterkt selektivt press er også tydelig i australske Nasutitermes [29]. Den stokastiske prosessen med genduplikasjon ser ut til å ha frigjort denne begrensningen i forskjellige nasutlinjer, noe som resulterte i den gjentatte utviklingen av to termiciner med forskjellige molekylære ladninger. Dette kan ha gagnet antifungalt forsvar fordi to terminaler med forskjellige ladningsegenskaper begrenser mulighetene for utvikling av soppresistens mot dem. Termitter som viser alarm (LOMs) etter eksponering for en høy dose konidier hadde mindre sannsynlighet for å dø i løpet av to uker enn individer som ikke viste noen alarm. LOM-er er positivt korrelert med R. flavipes arbeideraggregering og allogrooming [23], noe som tyder på at individer som viser alarm i denne studien ba om mer pleie fra redekamerater. LOM-er er sjelden rapportert i forskning som undersøker Metarhizium-infeksjoner i termitter og har blitt diskontert som å spille en rolle i å signalisere patogeneksponering [30]. Imidlertid kan de bli savnet fordi de ikke forekommer hos isolerte individer, ikke er vesentlig fremkalt av visse stammer og arter av Metarhizium, tar ca. 3 minutter etter en utfordring før de eskalerer, og avtar etter ca. 30 minutter [22,23]. Resultatene våre tyder på at LOM-er kommuniserer et nødvarsel etter eksponering for en høy dose konidier, som oppdages under allogrooming. LOM-er er imidlertid ikke nødvendige for en proaktiv atferdsrespons siden varigheten av allogrooming økte etter en lavdoseeksponering når LOM-er var ubetydelige.

5. Konklusjoner

LOM-er ser ut til å være en del av en nødrespons på kraftig kutikulær forurensning som bruker nettverkskommunikasjon for raskt å eskalere fjerning og ødeleggelse av de fleste konidier før de har en sjanse til å feste seg godt og spire, noe som tar omtrent 12 timer [31]. Denne nødberedskapen vil sannsynligvis være energisk kostbar. Forbedret sosial immunitet hos R. flavipes som respons på M. robertsii kan være en adaptiv avveining som R. virginicus ikke trenger å gjøre i samme grad fordi den har mer effektive medfødte immunmekanismer. Når de står overfor lave nivåer av patogeneksponering som fôrsøkende arbeidere rutinemessig må tåle, ser allogrooming også ut til å kompensere for svake medfødte immunmekanismer.

Referanser

1. Cremer, S.; Trekk, CD; Fuerst, MA Sosial immunitet: Fremvekst og utvikling av sykdomsbeskyttelse på koloninivå. Annu. Rev. Entomol. 2018, 63, 105–123. [CrossRef] [PubMed] 2. Cremer, S.; Armitage, SA; Schmid-Hempel, P. Sosial immunitet. Curr. Biol. 2007, 17, R693–R702. [CrossRef] [PubMed]

3. Evans, JD; Aronstein, K.; Chen, YP; Hetru, C.; Imler, JL; Jiang, H.; Kanost, M.; Thompson, GJ; Zou, Z.; Hultmark, D. Immunveier og forsvarsmekanismer hos honningbier Apis mellifera. Insekt Mol. Biol. 2006, 15, 645–656. [CrossRef] [PubMed]

4. Harpur, BA; Zayed, A. Akselerert utvikling av medfødte immunitetsproteiner i sosiale insekter: Adaptiv evolusjon eller avslappet begrensning? Mol. Biol. Evol. 2013, 30, 1665–1674. [CrossRef] [PubMed]

5. Han, S.; Sieksmeyer, T.; Che, Y.; Mora, MAE; Stiblik, P.; Banasiak, R.; Harrison, MC; Šobotník, J.; Wang, Z.; Johnston, PR; et al. Bevis for redusert immungendiversitet og aktivitet under utviklingen av termitter. Proc. R. Soc. Ser. B 2021, 288, 20203168. [CrossRef]

6. Bulmer, MS; Stefano, AM Termitt-eusosialitet og kontrasterende selektivt press på sosial og medfødt immunitet. Oppførsel. Ecol. Sosiobiol. 2022, 76, 1–12. [CrossRef]

7. Yanagawa, A.; Shimizu, S. Motstand av termitt, Coptotermes formosanus Shiraki mot Metarhizium anisopliae på grunn av stell. BioControl 2007, 52, 75–85. [CrossRef]

8. Rosengaus, RB; Traniello, JF; Bulmer, MS Økologi, atferd og utvikling av sykdomsresistens hos termitter. I Biology of Termites: A Modern Synthesis; Bignell, DE, Roisin, Y., Lo, N., red.; Springer: London, Storbritannia, 2011; s. 165–192.

9. Zhukovskaya, M.; Yanagawa, A.; Forschler, BT Grooming atferd som en mekanisme for forsvar av insektsykdom. Insekter 2013, 4, 609–630. [CrossRef]

10. Milner, RJ Utvalg og karakterisering av stammer av Metarhizium anisopliae for kontroll av jordinsekter i Australia. I biologisk kontroll av gresshopper og gresshopper; Lomer, CJ, Prior, C., red.; CAB International: Wallingford, Storbritannia, 1991; s. 200–207.

11. Traniello, JF; Leuthold, RH Atferd og økologi ved fôring hos termitter. I termitter: Evolusjon, sosialitet, symbioser, økologi; Abe, T., Bignell, DE, Higashi, M., Higashi, T., Abe, Y., red.; Springer: Dordrecht, Nederland, 2000; s. 141–168.

12. Vargo, E.; Husseneder, C. Biologi av underjordiske termitter: Innsikt fra molekylære studier av Reticulitermes og Coptotermes. Annu. Rev. Entomol. 2009, 54, 379–403. [CrossRef]

13. Abe, T. Evolusjon av livstyper hos termitter. I Evolution and Coadaptation in Biotic Communities; Kowana, S., Connell, JH, Hidaka, T., red.; University of Tokyo Press: Tokyo, Japan, 1987; s. 128–148.

14. Shellman-Reeve, JS Spekteret av eusosialitet hos termitter. I utviklingen av sosial atferd hos insekter og edderkoppdyr; Choe, JC, Crespi, BJ, red.; Cambridge University Press: Cambridge, Storbritannia, 1997; s. 52–93.

15. Griffiths, HM; Eggleton, P.; Hemming-Schroeder, N.; Swinfield, T.; Woon, JS; Allison, SD; Coomes, DA; Ashton, LA; Parr, CL Karbonfluks og skogdynamikk: Økt nedbrytning av dødved i tropiske regnskogs trefallskroner. Glob. Chang. Biol. 2001, 27, 1601–1613. [CrossRef]

16. Guo, C.; Tuo, B.; Ci, H.; Yan, ER; Cornelissen, JH Dynamiske tilbakemeldinger blant trefunksjonelle egenskaper, termittpopulasjoner og omsetning av dødved. J. Ecol. 2021, 109, 578–1590. [CrossRef]

17. Zanne, AE; Flores-Moreno, H.; Powell, JR; Cornwell, WK; Dalling, JW; Austin, AT; Classen, AT; Eggleton, P.; Okada, KI; Parr, CL; et al. Termittfølsomhet for temperatur påvirker globale treforfallshastigheter. Science 2022, 377, 1440–1444. [CrossRef] [PubMed]

18. Liu, L.; Wang, W.; Liu, Y.; Sun, P.; Lei, C.; Huang, Q. Påvirkningen av allogrooming atferd på individuell medfødt immunitet i den underjordiske termitten Reticulitermes chinensis (Isoptera: Rhinotermitidae). J. Insect Sci. 2019, 19, 6. [CrossRef] [PubMed]

19. Polizzi, JM; Forschler, BT Intra- og interspesifikk agonisme i Reticulitermes flavipes (Kollar) og R. virginicus (Banks) og effekter av arena og gruppestørrelse i laboratorieanalyser. Insectes Sociaux 1998, 45, 43–49. [CrossRef]

20. Hamilton, C.; Lay, F.; Bulmer, MS Profylaktiske sekresjoner fra underjordiske termitt og eksternt antifungalt forsvar. J. Insect Physiol. 2011, 57, 1259–1266. [CrossRef]

21. Rosengaus, RB; Jordan, C.; Lefebvre, ML; Traniello, JFA Patogenalarmatferd i en termitt: En ny form for kommunikasjon hos sosiale insekter. Sci. Nat. 1999, 86, 544–548. [CrossRef]

22. Myles, TG Alarm, aggregering og forsvar av Reticulitermes flavipes som respons på et naturlig forekommende isolat av Metarhizium anisopliae. Sosiobiologi 2002, 40, 243–256.

23. Bulmer, MS; Franco, BA; Fields, EG Sosialalarm for underjordiske termitter og hygieniske reaksjoner på sopppatogener. Insekter 2019, 10, 240. [CrossRef]

24. Denier, D.; Bulmer, MS Variasjon i underjordiske termitters mottakelighet for dødelige infeksjoner av lokale Metarhizium-jordisolater. Insectes Sociaux 2015, 62, 219–226. [CrossRef]

25. Bischoff, JF; Rehner, SA; Humber, RA En multilocus-fylogeni av Metarhizium anisopliae-linjen. Mycologia 2018, 101, 512–530. [CrossRef]

26. Rosengaus, RB; Schultheis, KF; Yalonetskaya, A.; Bulmer, MS; DuComb, WS; Benson, RW; Thottam, JP; Godoy-Carter, V. Symbiont-avledet -1, 3-glukanaser i et sosialt insekt: gjensidighet utover ernæring. Front. Microbiol. 2014, 5, 607. [CrossRef] [PubMed]

27. Hamilton, C.; Bulmer, MS Molekylært soppdrepende forsvar i underjordiske termitter: RNA-interferens avslører in vivo-rollene til terminus og GNBP-er mot et naturlig påtruffet patogen. Dev. Comp. Immunol. 2012, 36, 372–377. [CrossRef] [PubMed]

28. Bulmer, MS; Lay, F.; Hamilton, C. Adaptiv evolusjon i underjordiske termitt soppdrepende peptider. Insekt Mol. Biol. 2010, 19, 669–674. [CrossRef] [PubMed]

29. Bulmer, MS; Crozier, RH Duplisering og diversifisering av utvalg blant termitt-antifungale peptider. Mol. Biol. Evol. 2004, 21, 2256–2264. [CrossRef]

30. Moran, MN; Aguero, CM; Eyer, PA; Vargo, EL Redningsstrategi i en termitt: Arbeidere som er utsatt for et sopppatogen blir reintegrert i kolonien. Front. Ecol. Evol. 2022, 10, 840223. [CrossRef]

31. Davis, HE; Meconcelli, S.; Radek, R.; McMahon, DP Termitter former sin kollektive atferdsrespons basert på infeksjonsstadiet. Sci. Rep. 2018, 8, 14433. [CrossRef]