Del 1: Acteoside undertrykt Mikroglia M1 polarisering gjennom hemmet NF-κB signalvei og AMPK-mediert mitokondrier funksjon utvinning

Ansvarlig: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Pls klikk her til del 2

Abstrakt:

Bakgrunn:Alzheimers sykdom (AD)er den hyppigste typen demens. Mensacteoside fra cistanche urt(ACT), en forbindelse isolert fra Cistanchetubulosa, har nevrobeskyttende egenskaper. Den underliggende mekanismen for regulering av mikrogliapolarisering forblir imidlertid dårlig de¦ned.Metoder:Heri ble den AlCl3-induserte AD-modellen i sebra¦sh larver brukt til å avdekke den terapeutiske e-̈ cacy av ACT. BV-2 celler ble brukt til å demonstrere ACT-rollen på mikroglia polarisering. RNA- Sequence, HPLC-Q-TOF-MS, western blot og molekylær docking ble kombinert for å kon¦rm mekanismen.Resultater:ACT signi¦kantelt ameliorated eksperimentell dyskinesi og nervesystemet lidelser i sebra ¦sh. Deretter undertrykte den M1-polariseringen og forfremmet til M2-fenotypen i LPS-induserte BV-2-celler. Vi demonstrerte at ACT utøvde dyp transkripsjonspåvirkning, som innebar regulering av viktige signalveier i §ammation, argininbiosyntese, samt pantothenat og CoA biosyntese, korrelert med mitokondrier funksjon. ACT(acteoside fra cistanche urt) redusert mikroglia M1 polarisering ved å hemme NF-κB signalveien. Og de metabolske veiene ble ytterligere kon ¦rmed av HPLC-Q-TOF-MS. I tillegg reti¦ed ACT overdreven ROS for å gjenopprette mitokondrier funksjon gjennom AMPK-mediert PGC-1α og UCP-2 upregulation, i samsvar med metabolske endringer. Interessant nok kan ACT direkte binde seg til både NF-κB og AMPKα, som det fremgår av molekylær dokking.Konklusjoner:Forskningen ga en infusiv mekanisme i ACT og illustrerte et nytt perspektiv basert på mitokondrie dysfunksjon for å avsløre sammenhengen mellom metabolisme og mikroglia polarisering.

Bakgrunn:

AlzheimerS sykdom(AD) er en vanlig nevrodegenerativ sykdom ledsaget av kognitiv svikt og dyskinesi[1]. Den er preget av alvorlig nevrontap, senile plakk og nevrobrillære floker[2]. Patogenesen av AD er flerdimensjonal og knyttet til nevroin§ammasjon. Neuroin§ammation er drevet av aktivering av glialceller, nært knyttet til utviklingen av AD[3, 4]. Under progresjonen og forverringen av nevroin§ammasjon regnes mikroglia som nøkkelfaktoren. Mikroglia er de primære immuncellene i sentralnervesystemet. Det er nært forbundet med en kaskade av prosesser, som inneholder hjerneutvikling, opprettholde et nøytralt miljø, samt svare på skade og reparasjon[1]. Videre kan mikroglia stimuleres til en M1 fenotype og uttrykket av pro-in§ammatory cytokiner økes når nevroin§ammasjonsrelaterte sykdommer som AD oppstod[5]. Studier viser også at polariseringen til M1-fenotypen ofte ledsages av metabolske forstyrrelser[6], noe som forårsaker ubalanse i energimetabolismen og mitokondriedysfunksjon[7]. Disse bivirkningene er avledet fra nevrodegenerasjon, til og med AD.

acteoside fra cistanche urt(ACT), en fenylethanoid glykosid, er primært avledet fra Cistanchetubulosa. Økende bevis har antydet at ACT hadde en rekke farmakologiske aktiviteter, inkludert nevrobeskyttende[8], anti-in§ammatory[9], og antioksidant[10] effekter. Spesielt har ACT blitt rapportert å forbedre læring og hukommelsessvikt samt oppregulere energimetabolismen i streptozotocininduserte rotter[11]. Det har også blitt foreslått å hemme nevronal apoptotisk celledød og mitokondrieskade hos de eksperimentelle autoimmune encefalomyelittmusene[12]. Det er imidlertid fokusert færre studier på effekten av ACT på mikroglia M1/M2 polarisering. Spesielt har ulike mekanismer, som reparasjon av mitokondrierfunksjon og regulering av cellemetabolisme, ikke blitt utført. I tillegg har ACT-mekanismen bidratt til mikroglia M1/M2-polarisering vært uutforsket.

Den nåværende rapporten var rettet mot å undersøke den terapeutiske e-̈ cacy av ACT samt den under-molekylære mekanismen til ACT i AD. Herein, ACT viste en signi ¦ cant neuroprotection effekt i AlCl3-induserte AD zebra ¦ sh larver. I tillegg hemmet ACT effektivt M1-polariseringen og fremmet M2-fenotypen i LPS-induserte BV-2-celler. RNA-Sekvensering (RNA-Seq) integrert med metabolomisk metode for bedre å forstå den underliggende mekanismen for ACT i regulering av mikroglia polarisering. Krysstale mellom metabolisme og mikroglia polarisering når det gjelder mitokondriefunksjon ble undersøkt. Denne studien vil gi ny respekt for den videre undersøkelsen av ACT som et potensielt terapeutisk middel for behandling av AD.

Metoder:

Dyr og modellgruppering:

Wild-type sebra¦sh (AB-stamme, 4 måneder gammel) ble valgt i denne studien (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). De ble opprettholdt under en 14/10 t lys/mørk syklus ved 28 °C, etter den forrige metoden[13]. Naturlig gjødsel og normalt utviklede embryoer ble generert og dyrket til 3 dager etter befruktning (dpf) i en belysningsinkubator. Alle sebra¦sh eksperimenter ble utført under tilsyn av Animal Ethics Committee of China Pharmaceutical University.

Zebra¦sh larver ble delt inn i seks grupper og behandlet fra 3 dpf til 7 dpf: kontrollgruppe, modellgruppe, modell + donepezil hydroklorid (DPZ) gruppe, modell + ACT grupper. Kontrollgruppen ble opprettholdt i mediet med 0,2 % DMSO og modellgruppen ble behandlet med 150 μM AlCl3 (pH 5,8). Modellen + DPZ-gruppen ble sambehandlet med AlCl3 og 8 μM DPZ. Modellen + ACT-gruppene ble sambehandlet med AlCl3 og forskjellige konsentrasjoner av ACT (200, 100, 50 μM). ACT(acteoside fra cistanche urt)(HPLC renhet ≥ 98%) ble hentet fra Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, Kina). AlCl3·6H2O og DPZ ble kjøpt fra Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., LTD. (Shanghai, Kina).

Atferdsanalyse

Zebra¦sh larver bevegelser ble registrert med en ViewPoint atferdsanalysator (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) ved 28°C. Brie§y, atferdsparametrene og resultatbehandlingen var i samsvar med metoden vi etablerte tidligere[13]. Her ble gjennomsnittlig hastighet (AS), hastighetsendring (ΔS), dyskinesi recovery rate (DRR) og respons e ̈ ciency (RE, %) valgt for å evaluere dyskinesi utvinning i sebra ¦sh.

Etter behandling fra 3 dpf til 7 dpf ble sebra¦sh larver samlet inn for å måle AChE- og ChAT-aktivitet. Basert på produsentens protokoll ble aktiviteten oppdaget av de enzymbundne immunosorbente analysene (ELISA) (MLBIO bioteknologi Co. Ltd., Shanghai, Kina). Og proteinkonsentrasjonene av forskjellige prøver ble bestemt av BCA-metoden.

BV-2 celler ble sådd i en 6-brønns tallerken separat (n = 6 / gruppe). Etter behandling ble mediet fjernet, og cellene ble vasket tre ganger med kald PBS. Deretter umiddelbart utsatt for flytende nitrogen for å undertrykke celler metabolisme. Cellene ble høstet med kald 80% metanol (1 ml / brønn) og suspensjonen ble overført til et 2 ml Eppendorf-rør. For å lette proteinnedbør, kraftig virvelert i 1 min og sentrifugert ved 13.000 rpm i 15 min ved 4°C. Cellefjæringen ble overført til et nytt 2 ml Eppendorf-rør og tørket under en strøm av nitrogen og lagret ved -80 °C til analyse. De tørkede rester ble rekonstituert i 150 μL forkjølt 25% acetonitril. For å sikre stabiliteten og nøyaktigheten av sekvensanalysen ble like volumer (10 μL) av hver celleprøve kombinert som kvalitetskontrollprøver (QC). Under metabolittdeteksjon ble disse prøvene injisert etter hver sjette celleprøve for å kontre stabiliteten. En 1 μL aliquot ble injisert for HPLC-Q-TOF-MS.

HPLC-Q-TOF-MS-analysen ble utført på Agilent 1290 HPLC-systemet koblet til Agilent 6530 Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) massespektrometer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Separasjonen ble utført på en ACQUITY UPLC BEH C18-kolonne (2,1×100 mm, 1,7 μm). Den mobile fasen var sammensatt av 0,1% maursyrevann (v / v; A) og acetonitril (B).

§ow rate ble satt til 0,4 ml/min med følgende optimale gradient elution tilstand: 0 til 2 min, 5% B; 2 til 20 min, 5% til 95% B (positiv ionmodus); 0 til 2 min, 5% B; 2 til 20 min, 5% til 95% B (negativ ionmodus). Operasjonsparametrene til massespektrometeret ble satt som følger: gasstemperatur, 320 °C; tørkegass, 10 l/min; forstøver, 35 psi; VCap, 4000 V; fragment, 120 V.

Rådataene ble operert under MassHunter Workstation Software versjon B.07.00 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Rådataene ble forhåndsbehandlet av XCMS-plattformen. Hovedkomponentanalyse (PCA) og delvis minste kvadraters diskriminerende analyse (PLS-DA) av de normaliserte dataene ble utført med MetaboAnalyst (https://www.metaboanalyst.ca). Kombinert med litteratur, differensialmetabolitter (VIP > 1, T-test P< 0.05)="" were="" identi¦ed="" on="" hmdb="" (https://hmdb.ca).="" finally,="" pathway="" analysis="" was="" conducted="" with="">