Del 1: Anti-inflammatorisk, antioksidant, fuktighetsgivende og antimelanogeneseeffekter av quercetin 3-O- -D-glukuronid i humane keratinocytter og melanomceller via aktivering av NF-κB og AP-1-baner

For mer informasjon, kontakttina.xiang@wecistanche.com

Abstrakt: Quercetin3-O- -D-glukuronid(Q-3-G), glukuronidkonjugatet av quercetin, har blitt rapportert å haanti-inflammatoriskegenskaper i de lipopolysakkarid-stimulerte makrofagene, samt antikreft- og antioksidantegenskaper. I motsetning til quercetin, som har blitt omfattende beskrevet for å ha et bredt spekter av farmakologiske aktiviteter, inkludert hudbeskyttende effekter, gjensto de farmakologiske fordelene og mekanismene til Q-3-G i huden å bli belyst. Denne studien fokuserte på å karakterisere de hudbeskyttende egenskapene, inkludert antiinflammatoriske og antioksidantegenskaper, til Q-3-Against UVB-indusert eller H2O2-indusert oksidativt stress, hydreringseffektene ogantimelanogeneseaktiviteter ved bruk av humane keratinocytter (HaCaT) og melanomceller (B16F10). Q-3-G nedregulerte uttrykket av det pro-inflammatoriske genet og cytokin som cyklooksygenase-2 (COX-2) og tumornekrosefaktor (TNF)- i HO, eller UVB- bestrålte HaCaT-celler. Vi viste også at O-3-Gexhibits har en antioksidanteffekt ved å bruke analyser for fjerning av frie radikaler, flowcytometri og økt uttrykk for nukleær faktor erytroid 2- relatert faktor 2 (Nrf2). Q-3-G reduserte melaninproduksjonen i -melanocyttstimulerende hormon (-MSH)-induserte B16F10-celler. Hydratiseringseffektene og mekanismene til Q-3-G ble undersøkt ved å evaluere de fuktighetsgivende faktor-relaterte genene, som transglutaminase-1(TGM-1), filaggrin(FLG) og hyaluronsyresyntase (HAR)-1. I tillegg økte Q-3-G fosforyleringen av c-Jun, Jun N-terminal kinase (JNK), mitogenaktivert proteinkinase (MAPK) kinase 4(MKK4) og TAK1, involvert i MAPKene/AP -1-vei, og fosforyleringen av IkB, IkB-kinase(IKK)-, Akt og Src, involvert i NF-kB-veien. Til sammen har vi vist at Q-3-G utøver antiinflammatoriske, antioksidant-, fuktighetsgivende og antimelanogenese egenskaper i humane keratinocytter og melanomceller gjennom NF-kB- og AP-1-veier.

Nøkkelord: quercetin 3-O- -D-glukuronid;UV-beskyttelse; fuktighetsgivende; antimelanogenese; AP-1; NF-kB

1. Introduksjon

Huden, det største organet i kroppen, tilbyr en barriere som spiller en viktig rolle i å beskytte kroppen mot det ytre miljøet og skadelige faktorer som ultrafiolett stråling, smittsomme mikrober og skadelige kjemikalier. Denne barrieren regulerer også kroppens elektrolyttbalanse og temperatur og forhindrer tap av fuktighet [1,2]. Menneskelig hud består av tre lag: epidermis, dermis med vedheng og subkutant vev [3]. Epidermallaget spiller en viktig rolle for å opprettholde kroppstemperaturen.

Keratinocytter, den rikelige komponenten i hudens epidermis, samhandler tett med en annen gjennom desmosomer og tette koblinger som tillater en effektiv fysisk-kjemisk barriere[4]. Selv om huden fungerer som en beskyttende barriere, har ultrafiolett (UV) stråling en betydelig effekt på de fleste celler, inkludert keratinocytter, det ytre laget av huden. UV-stråling kan forårsake aldring av huden, hudskader, rynker og hyperpigmentering, som anses å være en av de mest sensuriøse risikofaktorene [5]. UV-lys består av tre bølgelengdeområder: UVA(320-400 nm), UVB (280-320 nm), og UVC (200-280 nm). Foruten hydrogenperoksid (H2O2), som har vært kjent for å bidra til oksidativt stress, kan UVB føre til produksjon av reaktive oksygenarter (ROS) gjennom aktivering av ROS-genererende enzymer [6]. Den ukontrollerte akkumuleringen av ROS i celler inkludert keratinocytter har blitt beskrevet å forårsake oksidative modifikasjoner av lipider, proteiner, nukleinsyrer og andre intracellulære molekyler som senere fører til ulike typer hudskader og aldringsrelaterte prosesser som celledød, oksidativt stress, og betennelse [7,8]. I tillegg er den oksidative stressresponsen kjent for å påvirke skaden av ulike cellulære komponenter [9]. Skadede hudceller kan også føre til inflammatoriske reaksjoner, noe som resulterer i kronisk skadet hud [10]. En type UVB- eller H2O2-mediert hudskade gjennom biologiske prosesser er uttrykk for inflammatoriske gener som cyklooksygenase-2 (COX-2) og pro-inflammatoriske cytokiner [11]. Derfor er utviklingen av sikrere, mer robuste og effektive hudbeskyttende effekter avgjørende for å forebygge og blokkere sykdommer assosiert med UVB- eller H2O2-mediert hudskade.

Hudhydrering spiller også en viktig rolle for å opprettholde sin normale funksjon. Spesielt har stratum corneum (SC) en beskyttende effekt mot vanntap [12]. Vanninnholdet i stratum corneum deltar i hudavskalling og riktig modning, mens utilstrekkelig vann i SC fremmer akkumulering og dysfunksjon av corneocytter [12,13]. I de siste stadiene av keratinocyttdifferensiering forsvinner plasmamembranen og cellulære organeller, og deretter induserer kalsiumtilstrømning transglutaminase (TGM) for tverrbinding med andre proteiner. En mangel eller tap av TGM-1 fører til defekt tverrbinding av celleomhyllingen. Lamell iktyose er et eksempel på en sykdom forårsaket av tap av TGM-1. Videre spiller filaggrin (FLG), den dannede keratinmatrisen, en rolle i SC-dannelsen ettersom den fungerer som et stillas for å binde forhornede konvoluttproteiner og lipider [14] ved å katalysere g-glutamyllysin-tverrbindingsreaksjoner, ATGM-er og membraner. -assosierte enzymer, som gir integritet til SC-ene [15]. I tillegg er hyaluronsyre (HA) en type naturlig fuktighetsfaktor (NMF) som er involvert i fuktighetsbevaring i huden og viser en distinkt profil ved iboende aldring av huden, er et legemiddelleveringsmiddel og er en viktig komponent i den ekstracellulære matrisen. [16,17]. HA spiller en rolle i å øke hudens fuktighet ved å regulere hyaluronsyresyntase (HAS) gener; dessuten kan retinsyre (vitamin A) effektivt regulere HA i epidermis [17]. TGM-1, FLG og HAS-12,3 er gener assosiert med NMF-produksjon [18]. Videre er aktiveringen av transkripsjonsfaktorer som aktivatorprotein-1(AP-1) og nukleær faktor (NF)-kB involvert i produksjonen av pro-inflammatoriske stoffer som optimerer hudbarrieren og hudhydrering gjennom AP-1- og NF-kB-banene[19]. Oppstrøms signaleringsenzymer i AP-1-veien inkluderer mitogenaktiverte proteinkinaser (MAPK) som c-Jun N-terminal kinase (JNK), ekstracellulær signalregulert kinase (ERK) og p38, mens Src, Akt, IkB-kinase (IKKo/ ), og KBO(IkBa) tilhører NF-KB-veien [20. Huden produserer også melanin i epidermallaget, spesielt i melanocyttene – den viktigste kilden til melanin – som bidrar til å bestemme hudfarge og melanogenese [21]. UVB-bestråling og -melanocytt-stimulerende hormon (o-MSH) kan stimulere melaninsekresjon, og derved utløse melanogenese [22. Under melanogenese aktiverer -MSH proteinkinase A (PKA), proteinmikroftalmiassosiert transkripsjonsfaktor (MITF) og cAMP-responselementbinding (CREB) [23]. En av funksjonene til melanin anses å være forebygging av hudskader ved UV, inkludert i sollys. Imidlertid fremmer overskytende produksjon av melanin eller fravær av melanininnhold forårsaket av aldring, melanocyttstimulerende hormon og UV-eksponering fregner, melasma, senile lentiginer og andre hyper-/hypopigmenteringsforstyrrelser som kan ha en negativ innvirkning på utseendet og huden helse [24]. Derfor er det også ønskelig å kontrollere melanogenese for å opprettholde både det helsemessige og det kosmetiske utseendet til menneskekroppen.

Quercetiner en dominerende allokert flavonol-type flavonoid som finnes i grønnsaker, frukt, drikkevarer og medisinske planter [25]. Følgelig har quercetin blitt grundig studert for å ha farmakologiske fordeler, inkludert anti-inflammatorisk, anti-aterosklerotisk,antioksidant, antikreft og hudbeskyttende egenskaper, og er relatert til melanogenese [24,26-29]. Imidlertid har flere arbeider med sensitive og pålitelige metoder vist at quercetin ikke har blitt påvist i plasma [30-33] og knapt finnes i hjernen [34,35]. Quercetin, som vanligvis presenteres som en glykosidform, absorberes godt og hydrolyseres for det meste og metaboliseres i tynntarmen, tykktarmen, leveren og nyrene til konjugerte metabolitter [30,36-38]. Bare de konjugerte metabolittene som glukuronid eller sulfat (henholdsvis metylert eller umetylert), i stedet for quercetin-aglykon eller dets glykosider, blir påvist i det sirkulerende blodet. 3/-metyl-quercetin-3-glukuronid, quercetin-3-glukuronid og quercetin-3'-sulfat har blitt identifisert som hovedplasmametabolitter etter 1,5 time etter inntak av stekt løk[30, 32]. Disse quercetinmetabolittene dannes i tynntarmen og leveren av biotransformasjonsenzymer inkludert UDP-glukuronyltransferaser som et resultat av fase II metabolisme [29,39,40]. Det ble også rapportert at konjugerte metabolitter av quercetin akkumuleres i humant plasma i konsentrasjonsområdet 10-'til 10- grad M etter periodisk inntak av løk med måltider i 1 uke[41]. Halveringstiden til quercetin-metabolitter er ganske høy, på omtrent 11 til 28 timer [29]. Siden disse forbindelsene har blitt observert som hovedformene for konjugerte quercetin-metabolitter, ville studier som fokuserer på den biologiske aktiviteten til flavonoler ved bruk av disse konjugerte metabolittene være avgjørende, noe som fikk oss til å studere den biologiske aktiviteten til en av de konjugerte quercetin-metabolittene. En av de mest tallrike glukuronidmetabolittene som hovedsakelig finnes i plasma og vev, inkludert lever, nyre og hjerne, er quercetin 3-O- -D-glukuronid(Q-3-G)(Figur 1) [31,35,40,42,43], som kan generere lignende, sterkere eller svakere aktiviteter sammenlignet med foreldreforbindelser i forskjellige modeller. Q-3-G transporteres til målvev via plasma for å utøve sin biologiske aktivitet [39]. O-3-G har også vist seg å være en effektiv metabolitt i rotteplasma etter oral administrering av quercetin [43]. I andre studier ble Q-3-G-holdig metabolitt funnet å bli akkumulert i aorta etter administrering av quercetin-rik mat, og har blitt identifisert som et aktivt prinsipp påvist i humant blod fra 0.{{48} } μM【44】. I tillegg kan Q-3-G finnes i vin [45] og i medisinske planter som Hypericum hirsutum, Nelumbo nucifera, Oenothera biennis og grønne bønner [46-49].Q-3-G har blitt beskrevet som en anti-inflammatorisk komponent under LPS-stimulerte tilstander og viste antioksidantegenskaper i blodplasma [50-52]. Sammenlignet med den lange historikken med bruk og omfattende studie av quercetin, gjenstår imidlertid studiet av Q-3-G å utforske. Derfor ble Q-3-G valgt som en representant for quercetin-metabolitter som en aktiv in vivo-spiller av quercetin. I tillegg er rollen til Q-3-G på hudbeskyttende effekter heller ikke blitt fullstendig klarlagt ennå. I denne studien, ved hjelp av ulike in vitro-vurderinger, undersøkte vi de hudbeskyttende effektene av Q-3-G mot UVBor H2O2-indusert oksidativt stress og betennelse, hudhydreringen i HaCaT (en human keratinocyttcellelinje) celler, og antimelanogeneseaktivitet i B16F10 (en murin melanomcellelinje) celler.

2. Resultat

2.1.Anti-inflammatoriske og antioksidanteffekter av Q-3-G mot UVB eller H2O2-stimulerte HaCaT-celler

Hudvev kan bli skadet av UV-stråling. UV-stråling aktiverer flere skadelige faktorer, inkludert oksidativt stress, apoptotisk celledød, betennelse og aldring av huden. For å bestemme de UV-beskyttende aktivitetene til Q-3-G, evaluerte vi først om Q-3-G har noen effekter på cellelevedyktigheten til humane keratinocytter. Ved å bruke en 3-(4-5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyl-243 tetrazoliumbromid (MTT)-analyse, undersøkte vi de cytotoksiske effektene av O-3-G i HaCa-celler. Som vist i figur 2a var det ingen signifikant interferens på cellelevedyktighet ved en konsentrasjon på 2.5-20 uM med Q-3-G, noe som indikerte at O-3-G ikke viste noen cytotoksisitet opp til 20 μM og skadet ikke keratinocyttene, det overfladiske laget av hudcellene. Deretter evaluerte vi de hudbeskyttende effektene av Q-3-G i HaCaT-celler utsatt for UVB. Etter UVB-bestråling ved 30 mJ/cm², beskyttet Q-3-G HaCaT-celler betydelig fra UVB-indusert celledød på en konsentrasjonsavhengig måte (Figur 2b). I samsvar med MTT-analysen, ved bruk av et kamera koblet til et mikroskop for å fange morfologien til HaCaT-celler, beskyttet Q-3-G mot celledød på grunn av UVB-bestrålte HaCaT-celler opp til en konsentrasjon på 10 μM (Figur 2c) . Antall HaCaT-celler under hver tilstand var 482 for den ubehandlede gruppen, 91 for UVB 30 mJ/cm-gruppen, 276 for UVB 30 mJ/cm² pluss 5μM O-3-G-gruppen og 320 for UVB 30 mJ/cm² pluss 10μM Q-3-G-gruppe (figur 2d). Disse resultatene bekreftet at Q-3-G hemmer UVB-indusert HaCaT-skade og redder den hudbeskyttende effekten fra UVB-bestråling.

Forekomst og forverring av betennelse i kroppen aktiverer av og til makrofager og frigjør noen cytokiner. Betennelse er et kjennetegn på oksidativt stress. Vi undersøkte den antiinflammatoriske effekten av Q-3-G mot UVB- eller HO2-indusert betennelse. Det er velkjent at UVB kan fremme DNA-skade og betennelse i hudceller 【10】. Vi bestrålte HaCaT-cellene med UVB 30mJ/cm² og inkuberte HaCaT-cellene med H2O2 (500 uM). Vi brukte en sanntids PCR-analyse for å sjekke mRNA-ekspresjonen av inflammatorisk enzym COX-2 og pro-inflammatorisk cytokin TNF-. Som vist av resultatene i figur 2e,f, hemmet en 10 μM konsentrasjon av O-3-G signifikant mRNA-ekspresjonen av COX-2 og TNF-. Følgelig undertrykte Q-3-G de inflammatoriske responsene indusert i HaCaT-celler etter eksponering for UVB-bestråling eller H2O2.

Vi brukte 2,2'-azinobis-(3-etylbenzotiazolin-6-sulfonsyre)(ABTS) og 2,2-difenyl-lpicrylhydrazyl(DPPH) radikalfjernende analyser – mye brukte modellsystemer for å undersøke renseaktivitetene in vitro til naturlige forbindelser – for å vurdere antioksidantegenskapene til Q-3-G ved forskjellige konsentrasjoner. HaCaT-celler ble behandlet med Q-3-G på en konsentrasjonsavhengig måte fra 2.5-40 μM i nærvær av DPPH, og resultatet viste en signifikant renseaktivitet ved mer enn 2,5 uM (Figur 2g) . ABTS-analysen demonstrerte også signifikant effekten av Q-3-G på frie radikaler på konsentrasjonsavhengige måter med en IC50-verdi på 1,75 μM (Figur 2h). Askorbinsyre (AA), som en positiv kontroll, viste de største antioksidanteffektene i både DPPH- og ABTS-analyser. Nukleær faktor erytroid 2-relatert faktor 2 (Nrf2), et av de antioksidantresponselement (ARE)-avhengige genene, er rapportert å regulere de beskyttende oksidoreduktasene og dets nukleofile substrater, og dermed fremme antioksidantenzymer for å fjerne skade og reparere systemer [53]. Deretter undersøkte vi ekspresjonsnivået til Nrf2 i UVB-bestrålte HaCaT-celler. For å styrke funnene ovenfor, økte O-3-G ekspresjonsnivået til Nrf2 betydelig ved UVB-bestråling sammenlignet med kontrollen på en konsentrasjonsavhengig måte, opp til 10 uM(Figur2i), noe som antydet at Q-3- G presenterer en antioksidanteffekt både kjemisk og biologisk med en frie radikalfjernende egenskap og øker henholdsvis den beskyttende effekten av Nrf2-avhengig ARE-signalering. Videre utførte vi også ROS flowcytometri ved bruk av diklordihydrofluoresceindiacetat (DCFDA) i UV-tilstand. Antioksidanten er viden kjent for å undertrykke cellulære stressorer ved å hemme ROS-produksjon [54]. Resultatet viste at behandling med Q-3-G ved konsentrasjoner på 5 og 10 μM reduserte nivået av UVB-indusert ROS (Figur 2j). Til sammen antydet disse dataene at Q-3-G utøver hudbeskyttende egenskaper som antiinflammatoriske og antioksidanteffekter mot H2O, eller UVB-indusert oksidativt stress og betennelse i HaCaT-celler.

2.2.Antimelanogeneseeffekt i B16F10 og fuktighetsgivende effekt i HaCaT-celler av Q-3-G

For å undersøke effekten av O-3-G på melanogenese, ble melanomcellene behandlet med -MSH i 48 timer for å skille ut melanin i B16F10-celler. Ved å bruke MTT-analyser bekreftet vi først at Q-3-G ikke hadde noen cytotoksisitet i B16F10-celler ved konsentrasjoner opp til 20 μM i 48 timer (Figur 3a). Dette resultatet viste, for de neste vurderingene, at effekten av O-3-G i B16F10 ikke skyldtes celledød. Deretter evaluerte vi B16F10 med Q-3-Gand -MSH i 48 timer for å bestemme effekten av Q-3-G på melanogenese. Som vist i figur 3b, hemmet Q-3-G melaninsekresjonen signifikant. Den positive kontrollen arbutin reduserte også signifikant utskillelse av melanin.

Det hudfuktighetsrelaterte molekylet er hyaluronsyre (HA). Som tidligere nevnt er HA, fordelt gjennom epidermis og dermis, en NMF som forbedrer hudens fuktighet [55]. Vi brukte en revers transkripsjons-PCR (RT-PCR)-analyse for å undersøke transkripsjonsnivået til HAS-1 etter 12 timer med en konsentrasjon av Q-3-G på opptil 30 uM. HAS fremmer akkumulering av mellomstor HA i keratinocytter [12]. Som vist i figur 3c ble uttrykket av HAS-1 økt ved behandling med Q-3-G opp til 10 μM. I tillegg til fuktighetsfaktoren undersøkte vi også uttrykket av FLG og TGM{{ 1. 3}}. Vi brukte retinol som en positiv kontrollgruppe. Transkripsjonsnivåene av FLG og TGM-1 økte merkbart etter behandling med Q-3-G ved konsentrasjoner opp til 10 μM (figur 3d). Disse funnene tyder på at Q-3-G har fuktighetsgivende aktivitet for huden i HaCaT-celler. Ved å bruke SB203580 (p38-hemmer), SP600125 (JNK-hemmer), UO126 (ERK-hemmer) og Bay11-7082 (NF-kB-hemmer), undersøkte vi dessuten involveringen av MAPK- og NF-kB-signalveier i fuktighetsgivende faktor for Q-3-G-behandlede HaCaT-celler. Basert på O-3-G-indusert genekspresjon, ble både nivåene av TGM-1 og FLG redusert ved behandling med SP600125, en JNK-hemmer (Figur 3e), noe som tyder på at JNK er nødvendig for å øke uttrykket av TGM-1 og FLG når det gjelder den fuktighetsgivende effekten av O-3-G. I tillegg ble FLG-ekspresjon også redusert av Bay11-7082, en hemmer av IKK og IkB, noe som tyder på at den farmasøytiske mekanismen til Q-3-G også kan tilhøre NF-kB-signalveien.

2.3. Fuktighetsrelaterte signalveier for Q-3-G via aktivering av AP-1 og NF-kB

Basert på de tidligere mRNA-resultatene, antok vi at involvering av AP-1- og NF-kB-signalering på hydreringseffekten av Q-3-G også kan forekomme i proteinnivåene. Ved å bruke en Western blot-analyse undersøkte vi fosforyleringen av oppstrøms molekyler av AP-1 og NF-kB. Først, i AP-1-veien, ble fosforyleringen av c-Jun økt etter inkubering av HaCaT-celler med Q-3-G i 24 timer (Figur 4a). Nivået av p-INK ble også økt etter behandling med Q-3-G ved konsentrasjoner på 2,5,5 og 10 μM. Den totale formen for JNK forble uendret (Figur 4b). Vi undersøkte videre fosforyleringen av MKK4 og TAK-1, som er oppstrømsregulatorer av JNK. Som vist i figur 3c, etter behandling av HaCaT-celler med O-3-G, ble proteinnivåene til p-MKK4 og p-TAK1 også oppregulert.

I tillegg til NF-kB-signalering, økte Q-3-G fosforyleringen av p50 og p65, en underenhet av NF-kB (Figur 4c). Dessuten evaluerte vi aktiveringen av IKK og IkBa, som også ble økt med Q-3-G opp til 10 uM sammenlignet med kontrollgruppen (figur 4d). Til slutt bestemte vi aktiveringen av oppstrøms molekyler involvert i NF-kB-signalveien. Fosforyleringen av Src og Akt (Ser473) ble forbedret ved O-3-G-behandling (figur 4e). Samlet sett indikerer disse dataene at hudbeskyttelseseffektene av Q-3-G målretter TAK1- og Src-aktivering ved å øke proteinnivået, og dermed oppregulere aktiviteten til henholdsvis AP-1 og NF-kB.

2.4. Effekter av Q-3-G på transkripsjonsaktivering av AP-1 og NF-kB

Vi undersøkte cellecytotoksisiteten til Q-3-G i humane embryonale nyrecellelinje HEK293T-celler ved hjelp av en MTT-analyse (figur 4f). Levedyktigheten til HEK293T-celler ble ikke signifikant påvirket etter behandling med Q-3-G（2.5-20 μM） sammenlignet med ubehandlede celler.

Vi brukte en luciferaseanalyse for å bestemme om Q-3-G kunne modulere NF-kB- og AP-1-promoteranalysene. Vi bekreftet at O-3-G økte AP-1-mediert luciferaseaktivitet (Figur 4g) og NF-kB-mediert luciferaseaktivitet (Figur 4h) på en konsentrasjonsavhengig måte. Disse resultatene bekrefter at AP-1-aktivering og NF-KB-aktivering er viktige farmakologiske mål for Q-3-G.

Klikk på lenken for å få mer informasjon:https://www.xjcistanche.com/news/part-2-anti-inflammatory-antioxidant-moistu-55118278.html