Pingping Zou

Pingping Zoua,†, Yuelin Songb,†, Wei Leia, Jun Lib, Pengfei Tua,b,

Yong Jiang,⁎

acetat Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Beijing 100191, China moderne forskningssenter for tradisjonell kinesisk medisin, School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, Kina

Mottatt 17. mai 2017; revidert 20. juni 2017; akseptert 17. juli 2017

Abstrakt: Cistanche deserticola(CD) er en av de to autoritative kildeplantene tilCistanches Herba, en velkjent medisinsk plante. Her ble 1H NMR-spektroskopi brukt for å karakterisere den kjemiske profilen og for å skille de forskjellige delene, samt for å foreslå en ny prosesseringsarbeidsflyt for CD. Signaltilordningen ble oppnådd ved flere en- og todimensjonale NMR-spektroskopiske teknikker i kombinasjon med tilgjengelige databaser og autentiske forbindelser. De øvre delene av planten ble skilt fra de nedre delene ved å kombinere det 1H NMR spektroskopiske datasettet med multivariat statistisk analyse. En ny prosesseringsmetode som bindestrek damping med frysetørking ble vist å være overlegen enten damping kombinert med ovnstørking eller direkte frysetørking via holistisk 1H NMR-basert metabolomisk karakterisering. Fenyletanoide glykosider, hovedsakelig echinacoside ogakteosid, ble filtrert ut og bekreftet som de kjemiske markørene som er ansvarlige for å vise overlegenheten til den nye prosesseringsarbeidsflyten, mens serielle primære metabolitter, spesielt karbohydrater og trikarboksylsyresyklusmetabolitter, ble funnet som de primære molekylene som styrer forskjellen mellom de øvre og nedre delene av planten. Samlet ble 1H NMR-spektroskopi demonstrert som et allsidig analytisk verktøy for å karakterisere den kjemiske profilen og for å veilede den dyptgående utnyttelsen av CD ved å gi omfattende kvalitativ og kvantitativ informasjon.

NØKKELORD:Cistanchedeserticola; 1H NMR-basert metabolomikk; Behandlingsarbeidsflyt; Forskjellige deler;Fenyletanoid glykosid; Trikarboksylsyresyklus metabolitter;Echinacoside; Acteosid

For mer informasjon vennligst kontakt:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola har mange effekter, klikk her for å vite mer

1. Introduksjon

Cistanches Herba(CH, kinesisk navn: Roucongrong), opprinnelig arkivert iShen Nongs kinesiske Materia Medica, har blitt mye sett på som en av de mest kjente spiselige styrkende og medisinske plantene, og hedret som "ørkenenes ginseng"^1,2. Som en av de to offisielle kildeanleggene til CH,Cistanche deserticola(CD, Orobanchaceae) er en holoparasitisk plante og hovedsakelig distribuert i nord og nordvest i Kina^2,3. Det har vært mye brukt for behandling av nyremangel preget av impotens, smerter i lender og knær, kvinnelig sterilitet og forstoppelse i tradisjonell kinesisk medisinsk praksis i århundrer.^3–5. Imidlertid er de ville kildene til CD på randen av utryddelse de siste årene på grunn av overhøsting, og den har blitt oppført som en av klasse II-plantene som trenger beskyttelse i Kina¹. Dessuten gir CD et viktig bidrag til ørkenkontroll. Derfor er det kritisk, men utfordrende å bruke dette urtematerialet mer effektivt.

Vitenskapelige studier vedrCistancheanlegg startet på 1980-tallet⁶. Fytokjemiske undersøkelser avdekket eksistensen av forskjellige kjemiske typer,e.g., fenyletanoidglykosider (PhGs), iridoider, lignaner, fettsyrer, alditoler og karbohydrater, innenfor CD⁷. Blant dem nevnes PhG-er oftest på grunn av deres brede spekter av biologiske aktiviteter, inkludert antioksidasjon, anti-aldring, anti-fatigue, anti-inflammasjon, styrking av kroppens immunitet, forbedring av læring og hukommelse til mus med Alzheimers sykdom, etc.¹. Nylig har PhG-er fått økende oppmerksomhet som potensielle nye medikamentkandidater for behandling av nevrodegenerative lidelser. Spesielt har en sammenslåing av de totale PhG-ene funnet i CH blitt utviklet som et nytt legemiddel, registrert som totaltCistancheglykosidkapsel (Memoregain^®) for behandling av vaskulær demens⁸. Echinacoside, den mest tallrike og effektive bestanddelen av de totale PhGs, viser anti-apoptotiske effekter på SHSY5Y nevronale celler etter TNF-indusert apoptose og reverserer underskudd hos mus med Parkinsons sykdom⁹. Dessuten er en annen primær aktiv forbindelse, acteosid (også kjent som verbascoside) i stand til å motvirke apoptosen i nevroner¹⁰for å forsvare mot nevrotoksisitet i PC12-celler indusert av 1-metyl-4-fenylpyridium eller glutamat¹¹, og for å forbedre skopolamin-indusert hukommelsessvikt².

LikCordycepsogGinseng, CD-en har blitt mye konsumert og verdsatt som helsekost. De faktiske og opplevde fordelene med CD vil sannsynligvis spille den avgjørende rollen for prisen på råstoffet. Gitt den store mengden av råmedisiner av CD, er skivene mer populære på markedet. Generelt er enzymatisk inaktivering og vannmangel de to nøkkeltrinnene under behandling av medisinske skiver. De konvensjonelle tørkemetodene for CD inkluderer isolasjon, ovnstørking, salting og kjellerlagring. Imidlertid lider produkter fra disse prosessene vanligvis av et dårlig utseende og lavt innhold av PhG, noe som hindrer bred bruk og forbruk av CD. I 2007 foreslo gruppen vår en ny prosesseringsteknikk for CD som dramatisk bevarte innholdet av echinacoside ogakteosidi skiver¹⁴. Men siden produktene fra denne prosessen fortsatt lider av et ubehagelig utseende, beskriver vi for tiden en prosesseringsmetodikk for å forbedre utseendet og for ytterligere å bevare innholdet av PhGs i de bearbeidede materialene.

Serielle analytiske verktøy har hittil blitt brukt for kjemisk analyse av CD, inkludert tynnsjiktskromatografi, høyytelses væskekromatografi (HPLC) kombinert med forskjellige detektorer, som diode array detector (DAD), evaporativ lysspredningsdetektor (ELSD), elektronfangstdetektor (ECD), og tandem massespektrometer (MS/MS). PhG-er, spesielt echinakosid og akteosid, har oftest blitt tatt i bruk som kvalitetsmarkører¹. Fingeravtrykket til dette urtestoffet er også utviklet ved bruk av HPLC–DAD og HPLC–DAD–MS/MS^15,16. Ikke desto mindre er det fortsatt en utfordring å vurdere kvaliteten på CD på grunn av den ekstremt komplekse kjemiske profilen. Generelt sett er tilnærminger rettet mot flere analytter ikke i stand til å tilby et helhetlig kjemisk syn på råekstraktene, selv om rikelig kvalitativ og kvantitativ informasjon kan fås fra LC−MS/MS. Dessuten kan HPLC-relaterte analytiske strategier begrenses av store mengder løsemidler, kjedelig prøveforberedelse og/eller tidkrevende prosedyrer. Derfor er det nødvendig med et nytt egnet analyseverktøy som kan gi omfattende informasjon om sammensatte pool for optimal kjemisk analyse. Heldigvis,¹H NMR-spektroskopi har blitt nøyaktig demonstrert som et attraktivt "alt i ett"-verktøy som er i stand til å tilby ikke bare kvalitativt datasett, men også kvantitativ informasjon for et bredt spekter av både primære og sekundære metabolitter med enkel prøveforberedelse og rask innsamling^17–20. Inntil nå, brede anvendelser av¹H NMR-spektroskopi har blitt lansert for samtidig bestemmelse, kjemisk profilering og metabolomikk av komplekse matriser.

Selv om det er utført flere undersøkelser for denne dyrebare urtemedisinen, er dens globale kjemiske profil stort sett ukjent. Fordi CD er en parasittisk plante, bør de nedre delene være ansvarlige for overføring av næringsstoffer, hovedsakelig primære metabolitter, fra verten mot de øvre delene, mens kraftig energimetabolisme, som blomst, vanligvis forekommer i de øvre delene. Derfor er det rimelig å anta at det oppstår forskjeller for metabolomet til forskjellige deler. Derfor, i den nåværende studien, tar vi sikte på 1) å karakterisere den kjemiske profilen til CD ved hjelp av¹H NMR-spektroskopi kombinert med forskjellige todimensjonale (2D) NMR-målinger; 2) å klargjøre forskjellene mellom øvre og nedre del, og 3) å foreslå en ny prosesseringsflyt gjennom¹H NMR-basert metabolomisk studie. Funnene som er oppnådd forventes å gi solide retningslinjer for videre utnyttelse av denne medisinske urten på en bedre måte, spesielt for bruk av forskjellige deler og bearbeidingsteknikker.

2. Eksperimentell

2.1. Plantematerialer

Tolv partier med ferske materialer (CD1–CD12, tabell S1, tilleggsinformasjon) ble samlet inn fra indre Mongolia, Xinjiang og Ningxia autonome regioner i Kina. Den botaniske opprinnelsen til alle råmaterialer ble autentisert som

1H NMR-basert metabolomikk avCistanche deserticola 649C. deserticolaav en av forfatterne, prof. Pengfei Tu. Alle kupongprøver deponeres ved herbariet til Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, Peking University (Beijing, Kina).

2.2. Kjemikalier og reagenser

Metanol-d4 (CD3OD, deuteriummengde, 99,8 atomprosent D), deuterert vann (D2O, deuteriummengde, 99,8 atomprosent D), og natrium 3-trimetylsilyl [2,2,3,3-d4 ] propionat (TSP-d4) ble oppnådd fra Cambridge Isotope Laboratories (Andover, MA, USA). Metanol av analytisk kvalitet ble kjøpt fra Beijing Chemical Works (Beijing, Kina).

Autentiske forbindelser, inkludert echinakosid, acteosid og mannitol, ble renset fra CD i laboratoriet vårt tidligere14, og sukrose, -galaktose, sammen med -glukose ble levert av Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Renheten til alle referanser ble bestemt til å være mer enn 98 prosent ved HPLC-UV og 1H NMR-analyser.

2.3. Prøveforberedelse

Alle råmaterialer (CD1–CD11) unntatt CD12 ble hakket i de øvre delene (GU) og de nedre delene (GD) på midten av hele stilkene, og alle delene ble kuttet i tynne skiver (ca. 6-mm -tykke hver). Deretter ble alle skiver av CD1–CD12 suksessivt dampet i 10 min og ovnstørket ved 6{{40}} grader i 48 timer for å gi prøver av a-type. To andre behandlingsmetoder, inkludert direkte frysetørking og 10-min damping etterfulgt av sekvensiell frysetørking, ble utført for noen utvalgte prøver, inkludert CD1-GU, CD4-GU, CD4-GD, CD11-GD og CD12, for å gi to ekstra sett med behandlede prøver (b- og c-type prøver). De detaljerte beskrivelsene av alle prøvene er illustrert i tabell S1. Før ekstraksjon ble alle bearbeidede skiver knust til pulver med en prøvemølle (modell YF102, Ruian Yongli Pharmacy Machinery, Kina) og siktet gjennom en 80 mesh sikt. De pulveriserte plantematerialene ble deretter nøyaktig veid (omtrent 200 mg for hver) og ekstrahert med 50- ganger 50 prosent vandig metanol (vekt/volum) i et ultralydvannbad (25 grader) i 40 minutter. Etterpå ble 50 prosent vandig metanol tilsatt for å kompensere for vekttapet under ekstraksjonen. Hvert ekstrakt ble sentrifugert ved 10,000×g ved 10 grader i 10 minutter og filtrert gjennom en 0,22 μm membran. Alikvoter (2 ml) av supernatanten ble deretter fordampet og ekssikkert ytterligere ved bruk av vakuumtørking ved 30 grader i 30 minutter. De tørkede restene av hver prøve ble rekonstituert ved å bruke en 0,5 ml blanding (1:1, v/v) av CD3OD og fosfatbuffer i D2O inneholdende 0,05 prosent TSP-d4 (pH 7,4), og løsningen ble deretter overført til en 5 mm (id) NMR-rør (Norell ST500-7) for NMR-analyser. Hver prøve ble analysert i tre eksemplarer.

2.4. NMR-målinger

Alle 1H NMR-, 13C NMR- og 2D NMR-spektra ble registrert på et Varian Unity Plus 500 MHz-spektrometer (Varian Inc., Palo Alto, CA, USA) ved 499,91 MHz protonfrekvens utstyrt med TCI kryoprobe og Z-gradientsystem. Identiske parametere ble brukt for både ekstrakter og referanseforbindelser for å oppnå sammenlignbare spektre. For 1H NMR-målinger ble 256 skanninger innhentet med følgende parametere: spektrabredde, 8012,6 Hz (16 ppm); pulsbredde, 11,05 μs (flippvinkel 90 grader); oppkjøpstid, 2,04 s; avspenningsforsinkelse (d1), 2 s; og temperatur, 298 K. CD3OD ble brukt for å låse feltfrekvensen, og de kjemiske skiftene til alle spektrene ble justert ved å bruke signalet fra TSP-d4 ved δ 0.00. En våt prosedyre ble tatt i bruk for å undertrykke intensiteten til H2O-signalet som lå rundt δ 3,3021. En eksponentiell funksjon med linjeutvidelsesfaktor (LB) som 0,3 Hz ble brukt, og dataene ble nullfylt for å gi minst fem datapunkter over halvbredden for hver resonans for å garantere presis og pålitelig integrasjon. De frie induksjonsforfallssignalene (FID) ble Fourier-transformerte (FT), og alle spektrene ble manuelt faset og korrigert ved bruk av et automatisert polynomisk grunnlinjeprogram.

For å hjelpe til med kjemisk karakterisering og signaltilordning,

13C NMR og ulike 2D NMR-analyser, for eksempel 1H–1H

korrelasjonsspektroskopi (1H–1H COSY), heteronukleær enkelt kvantekoherensspektroskopi (HSQC) og heteronukleær multiple bond-korrelasjonsspektroskopi (HMBC) ble også anskaffet for et representativt utvalg (CD1-GUI) ved bruk av disse standardprogrammene. Spektralbredden for COZY var δ 0.5–10.0 i begge dimensjoner og 128t1 trinn for hver t1. Seksten transienter som brukte en 1,00 s avspenningsforsinkelse ble lagt til med 822 komplekse data.

De optimale en- og n-bindings heteronukleære koblingskonstantene for HSQC og HMBC var henholdsvis 146 og 8 Hz. Områdene ble satt til henholdsvis –0.5–10.0 ppm i F2-dimensjonen og 0–200 ppm i F1-dimensjonen.

2.5. Multivariat statistisk analyse av NMR-spektroskopisk datasett

1H NMR-spektrene ble behandlet ved bruk av MestReNova-programvare (versjon 5.2.5, Mestrelab Research, Santiago de Compostella, Spania). Hvert spektrum ble skalert til den totale intensiteten og redusert til integrerte områder med lik bredde (0.02 ppm) i området δ 0,50–9,50 etter å ha ekskludert regionene med δ 4,70–

5.02 og δ 3,26–3,36 for å utelate restsignalene til henholdsvis vann og metanol. Hovedkomponentanalyse (PCA) med Pareto (Par) skalering samt ortogonal partiell minste kvadraters-diskriminerende analyse (OPLS-DA) med enhetsvarians (UV) skalering ble utført med SIMCA-P 12.0 programvare (Umetrics, Umeå, Sverige).

2.6. Samtidig bestemmelse av echinakosid og acteosid ved bruk av HPLC-UV

For å kryssvalidere funnene for de tre prosesseringsteknikkene, et Agilent 1260 HPLC-system bestående av en avgasser, en kvartær pumpe, en autosampler, en kolonneovn og en diode array-detektor (Agilent Technologies, Santa Clara , CA, USA) ble brukt for samtidig bestemmelse av echinacosid og acteosid i alle a-, b- og c-type prøver. En Agilent Zorbax SB-C18-kolonne (250 mm×4,6 mm, partikkelstørrelse 5 μm, Agilent Technologies) beskyttet av den tilsvarende beskyttelseskolonnen (10 mm×4,6 mm, partikkelstørrelse 5 μm) ble valgt for å utføre kromatografiske separasjoner. Prøveforberedelsesprotokollen, mobilfasen og elueringsprogrammet fulgte beskrivelsene arkivert i Chinese Pharmacopeia (2010 Edition)3 med mindre modifikasjoner. Kort fortalt ble ultralydassistert ekstraksjon utført i 30 minutter ved bruk av 50 prosent vandig metanol; 30 prosent vandig metanol ble tatt i bruk som den mobile fasen for isokratisk eluering ved en strømningshastighet på 1,0 ml/min, og kolonneovnen ble holdt ved

30 grader. Deteksjonsbølgelengden ble satt til 330 nm, og injeksjonsvolumet ble satt til 10 μL.

3. Resultater og diskusjon

3.1. Optimalisering av ekstraksjon og spektroskopiske parametere

For å oppnå 1H NMR-spektra av høy kvalitet for alle prøvene, ble ulike parametere nøye optimalisert ved å bruke en representativ prøve (CD1-GUI). For det første ble ekstraksjonsløsningsmiddel valgt blant 30 prosent vandig metanol, 50 prosent vandig metanol og metanol. Resultatene indikerte at en større total respons ble gitt av 50 prosent vandig metanol i forhold til de to andre, og stemte godt overens med ekstraksjonsprotokollen autentisert i Chinese Pharmacopeia (2015-utgaven)3. Ultralydsassistert ekstraksjon ble valgt på grunn av dens praktiske drift ved utbytter som er sammenlignbare med de for hot-reflux ekstraksjon og Soxhlet ekstraksjon (data ikke vist). Etterpå ble ultralydassistert varighet sammenlignet mellom 40 og 60 minutter, og 60 minutter ultralydvannbading viste ikke større ekstraksjonsstyrke enn 40 minutter; derfor ble 40 min satt for ultralydapparatet for tidsbesparende vurdering.

På den annen side ble {{0}},5 mL CD3OD–fosfatbuffer i D2O (1:1, pH 7,4) sammenlignet med 0,5 mL CD3OD–D2O (1: 1), og resultatene viste at befestningen med fosfatbuffer kunne hindre spektralprofilen fra variasjon og migrasjon. En 2,0 ml alikvot av ekstraktet ble suksessivt konsentrert, rekonstituert og underkastet NMR-analyse for å gi passende respons for de fleste signaler. Videre ble den våte metoden observert å være bedre enn et formetningsprogram for å redusere toppintensiteten til restvannet (rundt δ 4,8) i spekteret. Vi fant også at økningen av skannenummeret var gunstig for forbedringen av signal-støyforhold (S/N) som var ganske nyttig for sensitiv deteksjon (spesielt for sporkomponenter). Men siden denne tilnærmingen var skadelig for rask måling, ble 256 skanninger til slutt brukt for hver 1H NMR-analyse for å oppnå akseptabel følsomhet.

3.2. Signaltilordning av 1H NMR-spektrum

Identifikasjonen av kjemiske komponenter i CD ble oppnådd ved i fellesskap å analysere 1H NMR, 13C NMR og 2D NMR spektra (fig. 1 og tilleggsinformasjon fig. S1–S10) og sammenligne med prøver av autentiske forbindelser, samt ved å referere til tilgjengelige databaser, for eksempel MMCD . De plausible tilordningene til signalene i 1H NMR er gitt i fig. 1. Kjemiske skiftverdier for de antatte identitetene er oppsummert i tabell S2 (tilleggsinformasjon).

De strukturelle egenskapene til PhG-er i slekten Cistanche er beskrevet i litteratur1. På grunn av den store strukturelle likheten mellom PhG-er, f.eks. echinakosid vs. acteosid, overlappet protonsignalene til fenyletanoiddelene hverandre i 1H NMR-spekter. Denne overlappingen utgjorde et utfordrende analytisk problem for pålitelig å skille mellom disse signalene. I den nåværende studien ble signalene som tilhører echinacoside og acteosid, som er de primære ingrediensene i den opprinnelige planten, entydig tildelt ved hjelp av referanseforbindelser og forskjellige NMR-spektre (tabell S2, Fig. 1 og Fig. S1-S6). Det diagnostiske signalet ved δ 7,73 (d, J 16.0 Hz) indikerte fordelingen av Castano-

side B/D eller andre feruloylsubstituerte PhG-er (tabell S2 og fig. 1)22. Dessuten ble cis-type PhGs (cis-type kumaroyl eller caffeoyl substituerte PhGs) også observert i ekstraktet basert på tilstedeværelsen av δ 6,95 (d, J 12.0 Hz) i spekteret (tabell S2 og fig. . 1).

Flere åpenbare signaler ble oppdaget i området δ 8.0–9,5. Signalene ved δ 9,15, 8,88 og 8,09 ble foreløpig tilordnet nikotinamid (tabell S2 og fig. 1), og 13C NMR samt 2D

NMR-spektra (fig. S4–S6) støttet også denne oppgaven. Signalet ved δ 8,48 ble plausibelt tilordnet maursyre, mens signalene ved δ 8,13 og 8,11 ble generert fra henholdsvis adenosin og adenin (tabell S2 og fig. 1). Karbohydratsignalene er vanligvis lokalisert i området mellom δ 3.00 og 5.50. Åpenbart var sukrose det mest tallrike disakkaridet i CD, og ​​viste signifikante resonanser ved δ 4.04, 4.18 og 5.41 (tabell S2 og fig. 1 og S7). Tydelige signaler som tilhører de anomere protonene til -galaktose, -glukose og -glukose ble resonert ved henholdsvis δ 5,24, 5,2 0 og 4,60 (tabell S2, fig. 1 og S8, S9). Forekomsten av mannitol ble avslørt ved observasjon av signalet ved δ 4.00 så vel som ved å sammenligne med referanseforbindelsen (tabell S2, fig. 1 og S10). Det diagnostiske signalet til 1-O-etylglukosid ble observert ved 1,16 ppm ved å referere til HMDB. Aminosyrer, inkludert leucin (0,93 ppm), isoleucin/valin (0,98 ppm), treonin (1,27 ppm), alanin (1,49 ppm), lysin (1,71 ppm), glutamin (2,30 ppm), asparaginsyre (2,96 ppm), prolin (4,09 ppm), tyrosin (7,12 ppm) og fenylalanin (7,33 ppm) ble foreløpig tildelt ved å sammenligne deres respektive diagnostiske spektroskopiske atferd med de som er arkivert i HMDB (tabell S2 og fig. 1). Iridoider og lignaner ble tidligere nevnt som de viktige kjemiske homologene i CD. I det representative 1H NMR-spekteret (fig. 1) ble signalene til syringaresinol (et lignanderivat) og 8-epilogansyre (et iridoidderivat) observert ved henholdsvis δ 7,02 og 0,98. Videre kan multiplettsignalene varierte fra δ 6,56–6,64 foreløpig tilordnes sitrus A, alaschaniosid A eller dehydeodikoniferylalkoholglukosid (alle lignanderivater), mens signalene blant δ 6,18–6,33 også kan genereres av iridoider og (T) Figur 1). Dessuten ble forekomsten av noen alifatiske karboksylsyrer i CD, inkludert fumarsyre, maleinsyre, eplesyre, isositronsyre, sitronsyre, ketoglutarsyre, pyrodruesyre, ravsyre, eddiksyre og en annen fettsyre, tentativt karakterisert av observasjon av de diagnostiske signalene ved δ 6,54, 6,02, 4,27, 3,04, 2,73, 2,52, 2,49, 2,42, 1,97 og 1,33, sekvensielt (tabell S2 og fig. 1). I tillegg ble noen signaler, som et multiplettsignal rundt 3,80 ppm og en singlett ved 1,97 ppm22, sett på som egenskapene for henholdsvis metoksy- og acetylgruppene (tabell S2 og fig. 1), som er de vanlige erstatningene for fenylderivater. , spesielt PhGs i dette tilfellet. I mellomtiden kunne signalet ved 1,06 ppm foreløpig tilordnes rhamnose-resten. Det er velkjent at 1H NMR-spektroskopi kan gi direkte kvantitativ informasjon fordi intensiteten til protonsignalet er proporsjonal med den molare konsentrasjonen til analytten19. Derfor kan den foreløpige kvantitative sammenligningen utføres for ingrediensene i CD. Det er klart at karbohydratene, spesielt sukrose, ga de høyeste responsene i det representative spekteret (fig. 1). Som en holoparasitisk plante som vokser under jorden i nesten en hel livssyklus, er fotosyntese ikke nødvendig og ikke tilgjengelig for CD; derfor er det ikke overraskende at ingen fotosyntese-involvert primær metabolitt, slik som deltakeren i Kelvin-syklusen (også kjent som C3-syklus), ble funnet i spekteret23. Tvert imot ble det oppdaget et vell av molekyler som deltar i trikarboksylsyresyklusen (TCA-syklus, også kjent som sitronsyresyklus og Krebs-syklus), slik som sitronsyre, ketoglutarsyre, pyrodruesyre og ravsyre, noe som indikerer at kraftig sentral karbonmetabolisme (CCM) skjer i den opprinnelige planten. På den annen side ble PhG-er observert som den dominerende kjemiske familien blant forskjellige sekundære metabolitter, mens lignaner og iridoider bare ga mindre bidrag for hele spektralprofilen.

3.3. Presisjonsanalyse av 1H NMR-spektroskopi

Den spektroskopiske presisjonen spiller en nøkkelrolle i påliteligheten til karakterisering av metabolomikk. I den nåværende studien ble presisjonen til hele metodikken analysert ved å utarbeide en representativ prøve (CD1-GUI) i femdobbelt eksemplar og deretter analysere den i to påfølgende dager. De oppnådde spektrene viste stor generell likhet ved å overlegge alle spektre, noe som antyder at prøveforberedelsesprotokollen og 1H NMR-måling var reproduserbare og prøven kunne holde seg stabil på minst to dager.

3.4. Diskriminering av øvre og nedre plantedeler

Til nå har ingen bevis vist at de øvre delene av CD er ekvivalente med de nedre delene når det gjelder kjemisk profil og farmakologiske egenskaper. Med sikte på å avklare om akkumulering av primære eller sekundære metabolitter skjedde i visse deler av CD, ble hele de saftige stilkene kuttet i øvre og nedre deler, som begge ble deretter behandlet, ekstrahert og målt ved bruk av 1H NMR-spektroskopi. Fig. 2 viser de representative spektrene for begge deler. Samlet sett var de fleste signalene i de nedre delene høyere enn de i de øvre delene. I området δ 6.0–9.5 ble det ikke funnet noe unikt signal i noen av delene; Imidlertid var den generelle intensiteten til disse signalene i de nedre delene litt høyere enn de i de øvre delene, noe som tyder på at de aromatiske derivatene kunne anrikes i domenet nær parasittpunktet23. De nedre delene var også rike på fettsyrer, visse aminosyrer og noen andre energilagringsstoffer fordi den generelle signalresponsen til den alifatiske regionen (δ 0.5–3.{{10} }) i de nedre delene var høyere enn i de øvre delene. I tillegg kunne noen åpenbare forskjeller observeres innenfor sukkerområdet (δ 3.0–5.0), og de fleste av signalene lokalisert i området δ 3.0– 5.0 for de øvre delene var høyere enn de i de nedre delene, noe som indikerer at karbohydratene, bemerkelsesverdige oligosakkarider, kunne akkumuleres i de øvre delene. For å fremheve forskjellene mellom de øvre og nedre delene og også for å identifisere de primære bidragsyterne som er ansvarlige for deres diskriminering, ble multivariat dataanalyse brukt for å behandle det spektroskopiske datasettet til de forskjellige delene. En uovervåket tilnærming kalt PCA, som bare bruker informasjonen fra én matrise, ble opprinnelig brukt for å klassifisere alle prøver i henhold til karakteristiske 1H NMR-spektra. Imidlertid oppsto omfattende overlapping for disse to forskjellige delene (data ikke vist). Etterpå ble OPLS-DA, en overvåket tilnærming, lansert for å skjerpe separasjonen mellom ulike grupper samt for å forstå variablene som bærer klasseseparasjonsinformasjonen. OPLS-DA oppnådde en god separasjon for de forskjellige delene av CD. Fig. 3A og B viser henholdsvis poengsummen og S-plotten til OPLS-DA. Både den generelle godheten av tilpasning (R2Y¼{{30}}.910) og den generelle kryssvalideringskoeffisienten (Q2Y¼0.981) var nær 1.0. Derfor var den opprinnelige separasjonsmodellen statistisk god med høy forutsigbarhet. Det er klart at de øvre delene kunne skilles fra de nedre delene når prøvene ble merket med to grupper, og S-plottet ga signalene som potensielt bidro til differensieringen. Samlet sett ble flere prikker fordelt i regionen som tilsvarer de nedre delene i S-plotten, hvor høyere innhold av fettsyrer (δ 1,32–1,35) og TCA-syklusfaktorer (som ravsyre ved δ 2,42) var fordelt; den øvre delen (høyre klynge i fig. 3A) var imidlertid rik på noen karbohydrater (hovedsakelig δ 3,70–4,10, fig. 3B). De potensielle biomarkørene gitt av S-plottet var sterkt i samsvar med sammenligningen av spektrene til de to delene ved direkte observasjon og overlegging. Det er godt definert at metabolitter syntetiseres på vevs-, organ- og utviklingsspesifikke måter av spesifikke biosynteseenzymer og deretter lagres, noen ganger i høyt innhold i de produserende domenene, tilsvarende deres forskjellige funksjoner for hele planten. For eksempel viser både typene og innholdet av ginsenosider betydelige variasjoner blant jordstengler, røtter, blader og tilhengere av Panax notoginseng24. Når det gjelder CD, fra et kvalitativt synspunkt, viste de sekundære metabolittprofilene høy likhet mellom de øvre delene og de nedre delene. Fordi de nedre delene av hele plantene fungerer som rollen for overføring av næringsstoffer, hvorav de fleste er primære metabolitter, f.eks. karbohydrater, fra verten, Haloxylon ammodendron til de kraftige metabolismepunktene, noe som indikerer at flere primære metabolitter bør forekomme i nedre deler. Videre bør omfattende hydrolyse av polysakkarider til oligosakkarider og deretter til monosakkarider, som til slutt kan bli bio-overført til noen alifatiske karboksylsyrer, i stor grad forekomme i de øvre delene. Fordi 50 prosent vandig metanol ble brukt til ekstraksjon i denne studien og den var i stand til å ekstrahere hydrofile lavmolekyler i stedet for makromolekyler (f.eks. polysakkarider), er det ikke overraskende å merke seg at akkumulering av TCA-syklusfaktorer og fettsyrer ble demonstrert i de nedre deler. Noen oligosakkarider, de hydrolytiske produktene av polysakkarider, ble imidlertid funnet å være anriket i de øvre delene. På den annen side ble det observert mindre forskjeller for PhGs mellom ulike deler fra et kvantitativt synspunkt, og totalt sett ble det observert en liten akkumulering av PhG ved de nedre delene23,25. Det ble rapportert at haustoriumfloem sannsynligvis er det sekundære syntetiske organet for PhGs i CD23; derfor bør de nedre delene, som er nær parasittpunktet, være rike på PhGs.

3.5. Forslag til ny behandlingsmetode for CD

Det er klart at de medisinske skivene som tilhørte c-type prøver var overlegne med hensyn til godt utseende, off-white farge, lys og skarp tekstur. Fig. 4 viser de representative 'H NMR-spektra for disse tre typer prøver. Etter parallelle målinger ble det imidlertid oppnådd forskjellige spektralprofiler for de behandlede medisinske skivene. Gjennom direkte observasjon og overlegging kunne åpenbare forskjeller observeres. For det første, i området δ 6.00–8.00, der hovedsakelig inkluderte signalene som tilhører PhGs og noen andre fenoliske derivater, var responsene til c-type prøver (fig. 4C) ganske høyere enn de to andre typene. For det andre var responsene til de fleste karbohydrater og TCA-deltakere i b-type prøver (fig. 4B) nesten likeverdige med de i c-type prøver (fig. 4C), men mye høyere enn de i a-type prøver (fig. 4A). . For det tredje var innholdet av glukose (δ 5,20 for -glukose og δ 4,60 for -glukose) i b-type prøver (fig. 4B) litt høyere enn i c-type prøver (fig. 4C). Til slutt ble det påvist flere fettsyrer i a- og c-type prøvene enn i b-type prøver (fig. 4). Fremfor alt ble de mest tallrike fenolderivatene, som dette, som har blitt ansett som de effektive ingrediensene i CD, funnet i prøvene behandlet med en ny metode (c-type prøver), sammenlignet med a- og b- typeprøver. Dessuten ble det også funnet rikelig med primære metabolitter, som karbohydrater, TCA-deltakere og fettsyrer i prøver av c-type. Deretter ble sammenligningene av alle prøver gjennom multivariat dataanalyse utført med sikte på å fremheve likhetene så vel som forskjellene mellom disse tre typene medisinske skiver. PCA med Par-skalering og OPLS-DA med UV-skalering ble utført for å behandle det NMR-spektroskopiske datasettet suksessivt (data ikke vist). Signifikant separasjon ble ikke oppnådd ved bruk av PCA; scoreplottene til OPLS-DA for disse tre gruppene (grønne, blå og røde prikker i fig. 5A) viste imidlertid klar klassifisering, noe som indikerer at disse tre prøvegruppene var signifikant forskjellige med hensyn til deres metabolske profiler. De

nedbrytning av PhG-ene initiert av enten enzymene i den opprinnelige planten eller høytemperaturlagring. Som en konsekvens var de bearbeidede skivene (prøver av c-type) ved bruk av den nye metoden fordelaktige både ved et behagelig utseende og høyere effektivt innhold av blandinger. For å kryssvalidere de nevnte resultatene for de tre prosesseringsteknikkene, ble HPLC–UV-metoden som var godt utviklet og autentisert i Chinese Pharmacopeia (2015-utgaven)3 brukt til samtidig å bestemme innholdet av echinacosid og acteosid, som spilte viktige roller for å skille de tre ovennevnte typene bearbeidede produkter. Gjennomsnittlig innhold av echinacosid i prøver av a-, b- og c-type var henholdsvis 8,33, 4,10 og 16,19 mg/g, mens akteosidinnholdet var henholdsvis 1,57, 1,14 og 3,66 mg/g. Åpenbart var PhG-innholdet i c-type materialene 2–4 ganger høyere enn i a- og b-type prøver, og stemte godt overens med 1H NMR-baserte metabolomiske resultater. Blant de tilgjengelige analytiske teknikkene som vanligvis brukes i metabolomiske studier, har NMR- og MS-baserte metoder vanligvis blitt anerkjent for å være gunstige alternativer. NMR-spektroskopi, spesielt 1H-NMR, har uovertruffen overlegenhet i forhold til andre teknikker, slik som ikke-selektivitet, praktisk prøveforberedelse og den enkle samtidige påvisning av forskjellige grupper av metabolitter på relativt kort måletid. Hittil har 1H NMR-basert metabolomikk blitt brukt for å autentisere planter17 for å sammenligne analoge urter18, for å differensiere habitat26 og for å karakterisere nedbrytningen av urter26. Her ble 1H NMR brukt for å skille de forskjellige delene av CD, og ​​også for å foreslå en ny prosess arbeidsflyt, noe som indikerer at 1H NMR spektroskopi er et fleksibelt og robust analytisk verktøy for å tilby meningsfulle retningslinjer for utnyttelse av CD så vel som noen andre urtemedisiner ved å gi omfattende kvalitativ og kvantitativ informasjon om kompliserte ekstraktmatriser.