DEL 1 Cistanche Tubulosa (Schenk) Wight-ekstrakt forbedrer baklemmerytelsen og demper Myosin Heavy Chain IId/IIx-ekspresjon i Cast-immobiliserte mus

For mer informasjon vennligst kontakt:Joanna.jia@wecistanche.com

1Division of Neuromedical Science, Institute of Natural Medicine, University of Toyama, 2630 Sugitani, Toyama 930-0194, Japan 2Department of Japanese Oriental Medicine, Graduate School of Medicine and Pharmaceutical Sciences, University of Toyama, 2630 Sugitani, Toyama {{5 }}, Japan

Korrespondanse skal rettes til Chihiro Tohda; chihiro@inm.u-toyama.ac.jp

Mottatt 14. juni 2019; Revidert 13. september 2019; Godtatt 17. september 2019; Publisert 22. oktober 2019

Akademisk redaktør: Wen-yi Kang

Copyright © 2019 Yoshiyuki Kimbara et al. Dette er en åpen artikkel distribuert under Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i et hvilket som helst medium forutsatt at originalverket er korrekt sitert.

Skjelettmuskelatrofi forekommer ved mange kliniske tilstander, men en farmakologisk behandling er ennå ikke etablert.Cistanche tubulosa(Schenk) Wight er en urtemedisin som brukes i tradisjonell japansk og kinesisk medisin. I den nåværende studien undersøkte vi effekten avC. tubulosa ekstrakt(CTE) på atrofiert muskel in vivo. Vi undersøkte også immobilisering av bakbensgips hos mus og utviklet en ny type baklemmerimmobiliserende gips, bestående av svamplignende tape og et tynt plastrør. Ved å bruke denne metoden ble 3 av 4 grupper med mus (n 11 for hver gruppe) støpt-immobilisert i bakbenene og administrert CTE eller bærer i 13 dager. En falsk prosedyre ble utført i musene i den fjerde gruppen som bæreren ble administrert til. Deretter ble triceps surae-musklene (TS) skåret ut. For å analysere effekten av det nye gipssystemet og CTE-administrasjonen på muskelatrofi, evaluerte vi TS våtvekt og myofiber tverrsnittsareal (CSA). Vi bestemte også MyHC IId/IIx-ekspresjonsnivåer ved hjelp av western blotting, siden økningen deres er et kjennetegn på muskelatrofi som ikke brukes, noe som tyder på et langsomt til raskt skifte av myofibertypen. Dessuten utførte vi to tester av bakbens ytelse. Den nye gipsimmobiliseringsmetoden reduserte TS våtvekt og myofiber CSA betydelig. Dette ble ledsaget av forverring av bakbensfunksjon og en økning i MyHC IId/IIx-ekspresjon. CTE-administrasjon endret ikke TS våtvekt eller myofiber CSA; den viste imidlertid en trend med forbedring av tapet av bakbensfunksjon og undertrykkelse av det økte MyHC IId/IIx-ekspresjonen i gipsimmobiliserte mus. Vår nye immobiliseringsmetode for bakbensstøpt induserte effektivt muskelatrofi. CTE påvirket ikke muskelmasse, men undertrykte skiftet fra langsom til rask myofibertype hos gipsimmobiliserte mus, noe som forbedret forverring av bakbensfunksjonen.

Cistanche deserticola har mange effekter, klikk her for å vite mer

1. Introduksjon

De patofysiologiske tilstandene assosiert med skjelettmuskelatrofi inkluderer sarkopeni [1], kakeksi [2] og glukokortikoid-indusert skjelettmuskelatrofi [3]. Skjelettmuskelatrofi er også forårsaket av langvarig bruk [4], som kan skyldes sengeleie [5], påføring av gips for behandling av brudd eller leddbåndsskader [6], eller romflukt [7]. Siden ulike sykdommer kan forårsake denne tilstanden, rammer den en stor prosentandel av befolkningen.

Tilstrekkelig trening og ernæringsterapi er avgjørende for å behandle muskelatrofi [8]. I tillegg har noen studier rapportert at farmakologiske mottiltak, inkludert selektive androgenreseptormodulatorer, humane monoklonale antistoffer mot myostatin og selektive ghrelinreseptoragonister, er effektive [9]; disse tilnærmingene er imidlertid ikke etablert ennå.

De muskelatrofiske tilstandene beskrevet ovenfor er ledsaget av en endring i myofibertypeprofilen og en reduksjon av muskelmasse. Muskelsvikt forårsaket av tap av nevral påvirkning og mekanisk avlastning induserer et langsomt til raskt skifte av myofibertype, og en endring i myosin tungkjede (MyHC) isoformprofil [10], signalisert av økningen av MyHC IId/IIx-ekspresjonsnivåer [11, 12]. Et raskt til sakte skifte av myofibertype induseres i stedet av glukokortikoidadministrasjon, kakeksi, sepsis og andre faktorer [10].

Cistancheer en urtemedisin som stammer fraCistanche deserticolaYC Ma,C. tubulosa(Schenk) Wight, eller C. salsa (CA Mey) Beck, ifølge den japanske farmakopeen [13]. I tradisjonell japansk (Kampo) og kinesisk medisin brukes det til å behandle "nyresviktsyndrom", karakterisert ved infertilitet, systemisk muskelsvakhet (spesielt i rygg og underekstremiteter), og skjelettsvakhet [14, 15]. Det er kjent å inneholde forskjellige bestanddeler, inkludert akteosid, echinakosid og isoakteosid [16]. Ekstraktet av denne urten, eller dens kjemiske bestanddeler, har vist kardio-, lever- og nevrobeskyttende effekter; antialdrings-, antifatigue-, vasodilaterende og afrodisiakum-effekter; antioksidant og anti-inflammatorisk aktivitet; og evnen til å forbedre hukommelse og læring [15, 16]. Likevel har denne urtens effektivitet for å forebygge eller behandle muskelsvinnende sykdommer ikke blitt bekreftet. Derfor, i denne studien, undersøkte vi effektene avC. tubulosaekstrakt (CTE) som behandling for muskelatrofi.

For dette formål brukte vi immobilisering av bakbensgips for å indusere muskelatrofi hos mus, spesielt med fokus på materialene som ble brukt i gipsen. Det er rapportert om en rekke støpesystemer, inkludert gipsavstøpninger [17], glassfiberavstøpninger [18], mikrosentrifugerør av polypropylen [19], festedraktlignende enheter laget av bomull og stålnett [20], plastpipetter med proksimal svamppolstring [21], avstøpninger laget av ikke-elastisk bandasjetape og vinylbelagt ståltråd [22], trådinnføring kombinert med metallplater [23], og bruk av en kirurgisk hudstiftemaskin [24]. En ideell gips bør være minimalt invasiv og ikke-traumatisk for å unngå inflammatoriske endringer fordi betennelse kan indusere muskelatrofi [25]. I tillegg bør bakbens ytelsestester med gipsen være mulig i de siste stadiene av eksperimentet. Videre skal kastet være lett å håndtere uten spesielle kunnskaper eller ferdigheter; det skal være lett, billig, enkelt å kjøpe, og bør ikke kreve spesielle enheter for påføring og fjerning.

Ulike dyremodeller for muskelsvinn er rapportert. Baklemmerlossing har blitt brukt ofte [11, 12], men har flere problemer, inkludert halekrose, som kan indusere systemisk betennelse [25]; avvik av kroppsvæsker til den kaudale siden, noe som resulterer i abnormiteter i bakbenets blodårer [26]; ekstraordinær mikrotyngdekraft på bakbenet, som sterkt kan påvirke proteinuttrykk, inkludert det til mitokondrielle enzymer [27]. Alle disse faktorene kan påvirke forløpet av muskelsvinn. En annen metode induserer muskelatrofi ved å frata muskelen nevronale input (for eksempel via isjiasnervetranseksjon) [28]; siden muskler er utsatt for trofiske faktorer fra terminale nevroner [29], kan denne metoden, som fører til en uvanlig nesten total denervert status, endre prosessen med muskelatrofi. Dyr som er utsatt for systemiske forstyrrelser som fremkaller muskelatrofi, som diabetes mellitus [30], nyresvikt [31], administrering av kortikosteroider [32], og aldring eller akselerert senescens [33, 34], kan brukes som modeller for mennesker sykdommer; disse systemiske tilstandene kan imidlertid også forstyrre prosessen med muskelatrofi.

Dermed valgte vi immobilisering av bakbensgips for å indusere muskelatrofi, og vi søkte å lage en ny metode for å utføre den på mus, der vi undersøkte effekten av CTE på muskelatrofi.

CistancheKosttilskudd godbiterNyreSykdomogØkerStyrke

2. Materialer og metoder

2.1. Plantemateriale og utvinning.

CTE ble kjøpt opp fra Alps Pharmaceutical Industry Co., Ltd. (Hida, Gifu, Japan).

C. tubulosa kjøttfulle stilker ble samlet fra Shinjang Uyghur Aptonom Rayon, Folkerepublikken Kina. Totalt 193 kg blandet pulver av C. tubulosa ble nedsenket i 1.883 l 30 prosent etanol. Blandingen ble refluksert i 2 timer ved 55–64 grader. Ekstraktutbyttet var 7,2 prosent og inneholdt 3,36 prosent akteosid og 12,72 prosent echinakosid.

2.2. Mus.

Voksne ddY (12 uker gamle) hannmus (Japan SLC, Shizuoka, Japan) ble holdt separat i plastbur og holdt ved en 12-t lys/mørke-syklus i et temperaturregulert (25 ± 2 grader) vivarium. Alle dyr fikk ad libitum tilgang til vann og chow (Labo MR lager; Nosan Corporation, Yokohama, Kanagawa, Japan).

Alle dyreforsøk og protokoller ble utført i samsvar med retningslinjene for stell og bruk av forsøksdyr på Sugitani Campus ved University of Toyama. Godkjenningsnummeret for dyreforsøkene er A2016INM-3. Alle anstrengelser ble gjort for å minimere antallet dyr som ble brukt.

2.3. Induksjon av hindlembsmuskelatrofi og CTE-administrasjon.

Mus ble delt inn i 4 grupper (n 11 per gruppe): på dag 2 ble alle mus bedøvet, og håret ble fjernet fra låret til ankelen med en hårfjerningskrem (Epilat cream; Kracie, Tokyo, Japan). Deretter ble 3 av 4 grupper støpte (pluss) grupper støpt-immobilisert i henhold til følgende prosedyre, som vist i figur 1(a)–1(g):

Trinn 1. Kutt en EPDM-gummiskumforseglingstape (Cemedine Corporation, Tokyo, Japan) i en 12 8 25 mm stripe (Figur 1(a)).

Trinn 2. Hold et bakben i ankelens plantarposisjon og pakk det veldig forsiktig inn i ankelleddet med en forseglingstape (Figur 1(b)).

Trinn 3. Klipp en myk PVC-isolasjonshette TIC-22 (Nichifu Corporation, Osaka, Japan), og dekk til forseglingstapemansjetten. Bruk dobbeltsidig tape (PRO SELF praktisk kuttet dobbeltsidig tape J-1300; Nitoms Inc., Tokyo, Japan) for å få dem til å feste seg (Figur 1(c)).

Trinn 4. Samle de kuttede endene av hetten; kuttet vanntett høyytelses selvklebende tape (krafttape; Asahipen Corporation, Osaka, Japan) til ca. 4 48 mm størrelse og fest de rynkede endene (Figur 1(d)).

Trinn 5. Sett et lite stykke (ca. 5 30 mm) aluminiumsfolietape (AL-30; Nichiban Corporation, Tokyo, Japan) på forsiden av den øvre enden av hetten (Figur 1) (e)).

Trinn 6. Klipp plasttapen (vinyl elektrisk isolasjonstape nr. 21; Nitto Denko Corporation, Osaka, Japan) til ca. 19 × 40 mm, og pakk hetten (Figur 1(f)).

Trinn 7. Utfør samme prosedyre på det kontralaterale bakbenet (Figur 1(g)).

Immobiliseringsperioden som ble brukt i denne studien var 13 dager, og gipsene ble erstattet hvis en eller flere av følgende tilstander oppsto: alvorlig pedalødem, nekrose på bakbenet, alvorlige hudsår, løsne gips på grunn av ødeleggelse, eller gipsdislokasjon fra ankel. På den gjenværende gruppen ble det kun utført depilering (shamprosedyre), og vehikel (fysiologisk saltvann) ble administrert i 13 dager fra dagen etter depilering (dag 2). Blant de 3 gipsgruppene (pluss) ble 2 administrert CTE (50 og 100 mg/kg/dag; gips (pluss)/CTE-50 gruppe og gips (pluss)/CTE-100 gruppe), og en ble administrert bærer (støpt (pluss)/vehikelgruppe), også fra dag 2. CTE ble oppløst i fysiologisk saltvann og administrert daglig via oral sonde i 13 dager.

2.4. Evaluering av bakbensfunksjon og bakbens muskelstyrke.

På dag 14 ble musene i gipsgruppen (pluss) bedøvet igjen etter CTE-administrasjon, og gipsene ble fjernet. Neste dag (dag 15) ble alle mus testet for bakbensfunksjon og muskelstyrke ved å bruke følgende to tester:

2.4.1. Måling av ganghastighet.

En 15 mm bred firkantet treplattform ble holdt horisontalt omtrent 50 cm fra bakken. Musen ble deretter plassert på plattformen, og ganghastigheten ble vurdert etter hvert som dyret krysset plattformen ved manuelt å registrere ved hjelp av en stoppeklokke tiden for å gå en distanse på 50 cm. På forhånd hadde hver mus blitt vant til plattformen ved å krysse den to ganger som en treningsøkt.

2.4.2. Fotfeiltest.

For å evaluere bakbens muskelstyrke utførte vi "fotfeiltesten", der hver mus ble plassert på plattformen igjen, og antall bakbensglidninger fra plattformen ble tatt opp i tabell. Denne testen er en modifisert versjon av den statiske stavtesten, der luftstenger festes ved hjelp av en G-klemme, og mus blir tvunget til å krysse dem [35]. Fotfeiltesting ble utført tre ganger, og gjennomsnittlig antall fotfall over de tre øktene ble registrert. Det var et hvileintervall på minst 15 minutter mellom øktene.

2.5. Histologiske og morfometriske analyser av Triceps Surae-muskelen.

Etter evalueringen av bakbensfunksjonen ble mus dypt bedøvet og avlivet ved fysiologisk saltvannsperfusjon. Deretter ble triceps surae (TS) musklene skåret ut fra begge sider av bakbenene; prøver fra venstre bakben ble fiksert i 4 prosent paraformaldehyd i PBS-løsning i 24 timer, deretter overført til 30 prosent sukroseløsning i PBS, og inkubert for kryobeskyttelse og kryoseksjonering. Etter dette ble 12- μm tykke seksjoner kuttet langs den lille aksen fra midten av magen til hver muskel ved hjelp av en kryostat (Leica 3050S; Leica systems, Nußloch, Tyskland). Sju til ti sekvensielle seksjoner ble montert på antistripbelagte glassplater (MAS-GP Type A, Matsunami Glass Industry, Osaka, Japan), tørket umiddelbart med en hårføner, lagret ved 30 grader, og farget med hematoxylin-eosin-farging (HE-farging) , ScyTek Laboratories, Logan, Utah, USA). En representativ seksjon per dyr, der den kortaksede skiven til hver myofiber var godt synlig, ble valgt, og dens tverrsnittsareal (CSA) ble målt ved bruk av Image J (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA) .

2.6. Western Blotting.

Totalt protein fra høyre TS ble ekstrahert ved følgende metode. Den høyre TS ble hakket ved bruk av saks og umiddelbart hurtigfryst i flytende nitrogen, lagret ved 30 grader og senere homogenisert for å lage et vevslysat. Tint muskler ble inkubert iskaldt i 30 minutter i 2 mL M-PER pattedyrproteinekstraktløsning (Pierce Biotechnology, Rockford, Illinois, USA) og deretter homogenisert. Homogenater ble deretter sentrifugert ved 4 grader og 4000 g i 10 minutter, og supernatanter ble samlet.

10 ug totalt protein i hvert muskellysat ble lastet og separert ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE), etterfulgt av elektrooverføring til en nitrocellulosemembran (0,2 μm, # 1620112, Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, USA). Ikke-spesifikk binding ble blokkert med 5 prosent fettfri tørrmelk (skummetmelkpulver, 190-12865, FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) i Tris-bufret saltvann med 0,05 prosent Tween 20 (TBS-T). Membranene ble deretter inkubert over natten ved 4 grader med et primært antistoff oppløst i Can Get Signal immunoreaction enhancer-oppløsning 1 (Toyobo, Osaka, Japan). Etter omrøring og skylling med TBS-T, ble membranene inkubert i 1 time ved romtemperatur med pepperrotperoksidase- (HRP-) konjugert sekundært antistoff fortynnet i Can Get Signal immunreaksjonsforsterkerløsning 2 (Toyobo, Osaka, Japan). Signaler på membranene ble detektert via elektrokjemiluminescens ved bruk av luminol. Densitometrisk analyse ble deretter utført ved bruk av CS Analyzer-programvaren (Atto, Tokyo, Japan). Antistoffene ble valgt og fortynnet som følger: muse-anti-MyHC IId/IIx monoklonalt antistoff (1:1000, klon A4.1025, #05-716, Merck Millipore, Burlington, Massachusetts, USA), muse-anti-GAPDH lasting av kontroll monoklonalt antistoff (1: 3500, G041 ABM, Vancouver, Canada), og HRP-konjugert geit-antimus IgG polyklonalt sekundært antistoff H&L (1: 2000, Abcam, Cambridge, Storbritannia).

2.7. Statistiske analyser.

Alle resultater er uttrykt som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (SEM). Den statistiske signifikansen av sammenligningene mellom grupper ble verifisert ved enveis ANOVA og post hoc Dunnetts tester eller Tukeys HSD-test; Kruskal–Wallis-testen og post hoc Dunns tester; eller toveis ANOVA med gjentatte mål og post hoc Dunnetts test. Smirnov–Grubbs test ble brukt for å ekskludere uteliggere. For alle statistiske evalueringer ble p-verdier mindre enn 0.05 ansett som statistisk signifikante, og alle analyser ble utført med GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, California, USA).

CistancheKosttilskudd Anti-aldring og øker styrke

3. Resultater

3.1. Dyrehelse og effekt av CTE på kroppsvekt.

I visuelt utseende var bakbenene til gipsimmobiliserte mus alle atrofiske, sammenlignet med musene til gipsmusene ( )/vehikelgruppemusene. Gipsimmobilisering resulterte i betydelige tap av kroppsvekt ved slutten av studiefasen. Derimot var endringer i kroppsvekt ikke signifikante hos musene i gipsgruppen ( )/kjøretøygruppen. De to gipsene (pluss)/CTE-gruppene viste ingen signifikante endringer i kroppsvekt sammenlignet med gipsgruppen (pluss)/kjøretøygruppen (Figur 2).

Alvorlige komplikasjoner i bakbenene til immobiliserte mus, slik som hudnekrose eller koldbrann, ble ikke observert og heller ikke unormal oppførsel i vivarium. Imidlertid ble milde komplikasjoner, inkludert fotødem, overfladiske hudsår og rubor i bakbenene, sett hos alle gipsimmobiliserte mus (Figur 1(h)). Løsning og dislokasjon av gipsen, som førte til gipserstatning, ble også observert i de fleste tilfeller.

3.2. Effekt av CTE på muskelstyrke og muskelytelse.

Gipsgruppen (pluss)/kjøretøysgruppen viste signifikant økte antall bakbensglidninger i fotfeiltesten (Figur 3(a)), og ganghastigheten var betydelig lavere enn i gipsgruppen ( )/kjøretøysgruppen (Figur 3(b) )).

CTE-behandling resulterte i en doseavhengig tendens til redusert bakbensglidning. I gips- ( pluss )/CTE-100-gruppen hadde behandlingen en tendens til å redusere (p 0.0604) bakbensglidninger sammenlignet med gips- ( pluss )/kjøretøygruppen (Figur 3(a)). Når det gjelder ganghastighet, viste både kaste (pluss )/CTE-50 og kaste (pluss )/CTE-100-gruppene ingen signifikante forskjeller i ganghastighet sammenlignet med gips- (pluss)/kjøretøygruppen, selv om det var en liten, ikke-signifikant doseavhengig trend mot høyere hastighet (figur 3(b)).

3.3. Våtvekt av TS og Myofiber CSA.

Våtvekten til TS ble signifikant redusert med gipsimmobilisering sammenlignet med gips ( )/kjøretøygruppen (Figur 4(a)). CTE-administrasjon påvirket ikke TS våtvekt.

Gjennomsnittlig myofiber CSA i hver gruppe ble også analysert. I gips ( pluss )/kjøretøy-gruppen ble det funnet en signifikant reduksjon i myofiber CSA sammenlignet med gips ( )/kjøretøy-gruppen (Figur 4(b)). Myofiber CSA ble videre klassifisert og analysert ved frekvensfordeling, som vist i figur 4(c). Den hyppigste CSA-klassen i gipsgruppen ( )/kjøretøygruppen var større enn den i gipsgruppen ( pluss )/kjøretøygruppen; prosentandelen av myofiberne i 1350- 2250 μm2 CSA-klassen var, eller hadde en tendens til å være, betydelig høyere i gipsgruppen ( )/kjøretøygruppen enn i gipsgruppen ( pluss )/kjøretøygruppen, og den motsatte trenden var tydelig i CSA-klassen 0 900 μm2-gruppene (Figur 4(c)). CSA-fordelingen ble ikke påvirket av CTE-administrasjon i de to gipsene (pluss)/CTE-gruppene, sammenlignet med gipsgruppen (pluss)/kjøretøygruppen (Figur 4(c)). Representative myofiberbilder er vist i figur 4(d).

3.4. Effekt av CTE på MyHC IId/IIx uttrykksnivåer i TS.

Western blotting ble utført i seks representative prøver fra hver gruppe (figur 5(a)). Disse prøvene ble valgt basert på deres avledning fra dyr som viste fotfeiltestytelse nærmest gjennomsnittsverdiene for deres respektive grupper.

I gips ( pluss )/kjøretøy-gruppen var MyHC IId/IIx betydelig økt sammenlignet med gips ( )/kjøretøy-gruppen. Denne økningen ble doseavhengig undertrykt av CTE-administrasjon. I gips ( pluss )/CTE-100-gruppen hadde MyHC IId/IIx-uttrykket en tendens til å redusere sammenlignet med gips- ( pluss )/kjøretøygruppen (p 0.0810) (Figur 5(b)) . GAPDH-uttrykk, som ble brukt som en intern kontroll, var ikke signifikant forskjellig mellom grupper (figur 5(c)).

Cistanchetubulosa har mange effekter